趙喜朋,趙國(guó)平

(1.安徽大學(xué) 物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院,合肥 230601;2.中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院強(qiáng)磁場(chǎng)科學(xué)中心,合肥 230031)

細(xì)胞自噬(Autophagy)是一種通過溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)部功能失調(diào)的細(xì)胞組分的復(fù)雜過程,它在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)平衡、發(fā)育和分化過程中起關(guān)鍵作用[1]。自噬過程受到一系列自噬相關(guān)基因(ATG)的調(diào)控,這些ATG基因通常形成復(fù)合體參與調(diào)控自噬的各個(gè)過程。ULK1/2通過招募ATG13、FIP200和ATG101共同形成ULK復(fù)合體,該復(fù)合體是自噬的起始信號(hào)[2],ATG5-ATG12復(fù)合物與ATG16偶聯(lián)以擴(kuò)增自噬體膜[3],ATG4B與ATG7結(jié)合LC3I和磷脂酰乙醇胺(PE)形成的LC3II偶聯(lián)到自噬膜上,然后招募一些自噬受體(如P62、NBR1)形成自噬體,最終自噬體與溶酶體結(jié)合,內(nèi)容物被降解[4-6]。其中,LC3I到LC3II的轉(zhuǎn)換以及P62蛋白的降解可以作為自噬發(fā)生的標(biāo)志事件。自噬在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中具有雙重作用。在腫瘤的起始階段,一些基因的突變會(huì)抑制細(xì)胞自噬,例如:PI3K的突變、AKT或PTEN的缺失或沉默都會(huì)激活mTOR,從而抑制自噬[7-8]。在腫瘤發(fā)展的末期,自噬的激活可以促進(jìn)多種腫瘤生長(zhǎng),以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物和放射治療的抗性[9-10]。在腫瘤治療中,自噬抑制劑或誘導(dǎo)劑的使用已經(jīng)克服了部分癌細(xì)胞的化療耐藥性或放療抗性,表明自噬是癌癥治療的新靶點(diǎn)[11]。

HIGD1A是一種重要的線粒體蛋白,其作為細(xì)胞色素c氧化酶的一個(gè)亞基可以催化氧還原為水[12],在線粒體電子傳遞鏈復(fù)合物中起重要作用,過表達(dá)HIGD1A蛋白可以減少細(xì)胞對(duì)氧的消耗,但會(huì)觸發(fā)線粒體ROS形成,導(dǎo)致AMPK調(diào)控的細(xì)胞抗氧化的激活[13]。作為重要的線粒體靶點(diǎn),HIGD1A被報(bào)道在響應(yīng)電離輻射之后,可以轉(zhuǎn)位入核,參與同源重組修復(fù)[14]。同時(shí)有研究發(fā)現(xiàn)HIGD1A會(huì)抑制細(xì)胞色素c釋放到細(xì)胞質(zhì),從而抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]。許多研究表明細(xì)胞自噬與凋亡之間存在串?dāng)_[16],但是HIGD1A是否參與細(xì)胞自噬,以及是否通過細(xì)胞自噬調(diào)控腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性尚未見報(bào)道。本研究利用HIGD1A敲低細(xì)胞系,在自噬誘導(dǎo)劑和電離輻射處理之后,通過檢測(cè)細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白LC3、P62的蛋白水平以及mCherry-GFP-LC3的熒光水平,探究線粒體蛋白HIGD1A通過調(diào)控自噬增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞(HeLa)輻射敏感性的機(jī)制,為臨床上宮頸癌的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

人宮頸癌細(xì)胞系HeLa(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫);DMEM培養(yǎng)基(以色列 Biological Industries 公司);胎牛血清(以色列 Biological Industries 公司);青霉素-鏈霉素溶液(中國(guó)Biosharp公司);HIGD1A、LC3、P62、cleaved caspase-3、caspase-7抗體(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);β-actin 抗體(美國(guó) Affinity Biosciences 公司);Ad-mCherry-GFP-LC3B(中國(guó)碧云天公司);CCK-8(中國(guó)陶術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

所用細(xì)胞系均以含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng),培養(yǎng)環(huán)境均為37 ℃,5% CO2。

1.2.2 蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)

收集待檢測(cè)的細(xì)胞,加入預(yù)冷的含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,于冰上充分裂解細(xì)胞,4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min,取上清液進(jìn)行BCA定量。SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉后,孵育相應(yīng)的抗體,4 ℃孵育過夜,TBST洗膜3次后,孵育對(duì)應(yīng)二抗,TBST洗膜3次后在凝膠成像儀中進(jìn)行蛋白檢測(cè)。

1.2.3 構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)敲低HIGD1A的HeLa細(xì)胞系

委托蘇州金唯智公司進(jìn)行敲低HIGD1A的目標(biāo)序列合成,目標(biāo)序列為5′-CCATTCGTACCCGTTGGAATA-3′,并將目標(biāo)序列退火后連接到pLKO.1載體上。使用三質(zhì)粒轉(zhuǎn)染系統(tǒng)(pLKO.1-HIGD1A/scramble shRNA、psPAX2、pMD2.G)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,48 h后收集病毒液并感染HeLa細(xì)胞,在病毒感染72 h后使用嘌呤霉素篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。其中scramble shRNA來自實(shí)驗(yàn)室保存,插入到pLKO.1載體上的序列為5′-GGGTGAACTCACGTCAGAA-3′。

1.2.4 熒光檢測(cè)mCherry-GFP-LC3B

使用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒檢測(cè)自噬進(jìn)程,GFP在溶酶體酸性環(huán)境中會(huì)發(fā)生淬滅,所以紅色熒光代表自噬溶酶體水平,完整的mCherry-GFP-LC3(黃色熒光斑點(diǎn))僅代表自噬起始階段的自噬體含量。細(xì)胞在感染病毒48 h后,重新消化接種于玻片上培養(yǎng)并進(jìn)行相應(yīng)的處理,在處理相應(yīng)時(shí)間后進(jìn)行熒光檢測(cè)處理,使用PBS洗滌細(xì)胞3次,-20 ℃預(yù)冷的4%多聚甲醛固定30 min,PBS洗滌3次之后,將玻片面朝下置于載玻片上,于熒光顯微鏡下檢測(cè)mCherry和GFP熒光水平。

1.2.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活力

分別取對(duì)照細(xì)胞和敲低HIGD1A的HeLa細(xì)胞系接種于96孔板,待細(xì)胞貼壁后,使用雷帕霉素或者氯喹(CQ)預(yù)處理2 h,然后4 Gy劑量照射,培養(yǎng)48 h后,根據(jù)說明書,棄去原來的細(xì)胞培養(yǎng)基,加入含有CCK-8溶液的完全培養(yǎng)基,置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h,檢測(cè)450 nm下的吸光度值。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Image J軟件對(duì)Western Blot結(jié)果進(jìn)行灰度分析。運(yùn)用GraphPad Prism 9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果,使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析并確定P值,P<0.05說明兩組間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建HIGD1A穩(wěn)轉(zhuǎn)敲低細(xì)胞系

使用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù),構(gòu)建HIGD1A穩(wěn)定敲低的HeLa細(xì)胞系,并利用Western Blot對(duì)敲低效率進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,敲低細(xì)胞系的HIGD1A蛋白表達(dá)水平顯著降低,敲低組HIGD1A的蛋白表達(dá)量相對(duì)于對(duì)照組降低至40%(P<0.000 1,n≥3),見圖1。

(a)Western Blot檢測(cè)HeLa細(xì)胞中HIGD1A的蛋白表達(dá)水平;(b)Western Blot結(jié)果的灰度值分析。**** 為P<0.000 1。

2.2 HIGD1A參與饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬

為探究HIGD1A蛋白是否參與細(xì)胞自噬,采用饑餓處理的方式誘導(dǎo)細(xì)胞自噬,使用EBSS處理對(duì)照細(xì)胞和HIGD1A敲低細(xì)胞。通過Western Blot檢測(cè)LC3和P62的表達(dá)水平,與對(duì)照組細(xì)胞相比,LC3Ⅱ蛋白表達(dá)無顯著性變化,敲低HIGD1A促進(jìn)P62蛋白的積累;在EBSS處理4 h后,兩組細(xì)胞中LC3Ⅱ蛋白表達(dá)無顯著性差異,敲低HIGD1A抑制了P62蛋白的降解;同時(shí)使用EBSS和CQ處理細(xì)胞后,如圖2(a)～(c),與對(duì)照組細(xì)胞相比,HIGD1A敲低細(xì)胞中P62沒有顯著變化,但LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.000 1,n≥3),表明敲低HIGD1A抑制EBSS誘導(dǎo)的自噬。使用外源表達(dá)的mCherry-GFP-LC3B在熒光水平進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證自噬的變化。結(jié)果如圖2(d)～(f)顯示,與對(duì)照組細(xì)胞相比,同時(shí)使用EBSS處理細(xì)胞后,HIGD1A敲低細(xì)胞中的紅色熒光(自噬溶酶體)表達(dá)水平顯著下降(P<0.001,n≥3)。黃色熒光(自噬體)的表達(dá)水平也顯著下降(P<0.000 1,n≥3)。表明HIGD1A敲低阻斷了細(xì)胞自噬的過程。以上結(jié)果表明,HIGD1A參與饑餓誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬,且敲低HIGD1A抑制EBSS誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平。

(a)對(duì)照細(xì)胞和HIGD1A敲低細(xì)胞在單獨(dú)EBSS或EBSS和CQ(10 μmol/L)同時(shí)處理4 h后,Western Blot檢測(cè)P62、LC3的蛋白表達(dá)水平;(b)和(c)Western Blot結(jié)果的灰度值分析;(d)在腺病毒Ad-mCherry-GFP-LC3B感染細(xì)胞48 h后,使用EBSS處理細(xì)胞4 h,熒光檢測(cè)mCherry-GFP-LC3B的表達(dá)水平;(e)～(g)對(duì)(d)中結(jié)果mCherry(自噬溶酶體)和GFP+mCherry(自噬體)計(jì)數(shù),計(jì)算GFP/mCherry比值,并統(tǒng)計(jì)。ns為P>0.05,* 為P<0.05,*** 為P<0.001,**** 為P<0.000 1。

2.3 HIGD1A參與電離輻射誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬

為探究HIGD1A是否參與電離輻射(IR)誘導(dǎo)的自噬反應(yīng),使用γ射線(4 Gy)照射對(duì)照組和HIGD1A敲低細(xì)胞。Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示,HIGD1A敲低促進(jìn)P62蛋白的積累,但LC3Ⅱ蛋白表達(dá)量無顯著變化;在IR處理4 h后,兩組細(xì)胞中LC3Ⅱ蛋白表達(dá)無顯著性差異,HIGD1A敲低抑制了P62蛋白的降解;在CQ聯(lián)合IR處理細(xì)胞后,與對(duì)照細(xì)胞相比,敲低HIGD1A對(duì)P62的積累沒有顯著影響,但顯著降低LC3Ⅱ的表達(dá)水平(P<0.01,n≥3),見圖3(a)～(c)。使用Ad-mCherry-GFP-LC3B重組腺病毒對(duì)細(xì)胞自噬流進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果與EBSS誘導(dǎo)自噬相似,與對(duì)照組細(xì)胞相比,使用IR處理細(xì)胞后,敲低HIGD1A抑制細(xì)胞自噬溶酶體和自噬體的生成(P<0.01,n≥3),見圖3(d)～(g)。以上結(jié)果表明,HIGD1A響應(yīng)電離輻射誘導(dǎo)的自噬,且敲低HIGD1A抑制電離輻射誘導(dǎo)的自噬。

(a)在CQ(10 μmol/L)預(yù)處理對(duì)照細(xì)胞和HIGD1A敲低細(xì)胞2 h后,使用4 Gy劑量γ射線處理細(xì)胞,4 h后Western Blot檢測(cè)P62、LC3的蛋白表達(dá)水平;(b)和(c)Western Blot結(jié)果的灰度值分析;(d)在腺病毒Ad-mCherry-GFP-LC3B感染細(xì)胞48 h后,使用4 Gy劑量γ射線處理細(xì)胞,4 h后熒光檢測(cè)mCherry-GFP-LC3B的表達(dá)水平;(e)～(g)對(duì)(d)中結(jié)果mCherry(自噬溶酶體)和GFP+mCherry(自噬體)計(jì)數(shù),計(jì)算GFP/mCherry比值,并統(tǒng)計(jì)。ns為P>0.05,* 為P<0.05,** 為P<0.01,**** 為P<0.000 1。

2.4 敲低HIGD1A聯(lián)合自噬抑制劑增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性

根據(jù)以上結(jié)果,我們推測(cè)敲低HIGD1A聯(lián)合自噬抑制劑可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)電離輻射的敏感性。通過CCK-8對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn),使用CQ預(yù)處理之后進(jìn)行電離輻射處理,敲低HIGD1A組較對(duì)照組細(xì)胞活力有顯著下降(P<0.01,n≥3);雷帕霉素預(yù)處理后進(jìn)行電離輻射處理的結(jié)果顯示,雷帕霉素處理后HIGD1A敲低細(xì)胞系的細(xì)胞活力較對(duì)照細(xì)胞無明顯變化(P<0.01,n≥3),見圖4。以上結(jié)果表明,敲低HIGD1A聯(lián)合CQ能夠進(jìn)一步抑制輻射誘導(dǎo)的自噬增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性。

在用CQ(10 μmol/L)/雷帕霉素(100 nmol/L)預(yù)處理對(duì)照細(xì)胞和HIGD1A敲低細(xì)胞2 h后,使用4 Gy劑量γ射線輻照細(xì)胞,48 h后使用CCK-8處理細(xì)胞4 h,測(cè)定450 nm下的吸光度值,對(duì)數(shù)據(jù)分析并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞活力。ns 為P>0.05,** 為P<0.01。

2.5 HIGD1A參與細(xì)胞自噬并抑制細(xì)胞凋亡

細(xì)胞自噬與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切[16],以往的研究表明HIGD1A能夠降低細(xì)胞凋亡水平[15],本文推測(cè)HIGD1A可能通過調(diào)控凋亡參與自噬途徑。接下來,通過Western Blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白caspase-7和cleaved caspase-3的表達(dá)水平評(píng)估細(xì)胞的凋亡水平。結(jié)果顯示,敲低HIGD1A細(xì)胞中caspase-7和cleaved caspase-3的表達(dá)水平升高,見圖5(a);雷帕霉素處理后的對(duì)照細(xì)胞中caspase-7以及cleaved caspase-3表達(dá)水平下降(P<0.05,n≥3),但雷帕霉素的使用對(duì)HIGD1A敲低細(xì)胞系中caspase-7和cleaved caspase-3的表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響,見圖5(b)～(d),說明敲低HIGD1A使細(xì)胞維持在較高的凋亡水平。以上結(jié)果表明,HIGD1A可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡參與細(xì)胞自噬途徑。

(a)Western Blot檢測(cè)cleaved caspase-3、caspase-7的蛋白表達(dá)水平;(b)使用雷帕霉素(100 nmol/L)處理對(duì)照細(xì)胞和HIGD1A敲低細(xì)胞24 h后,Western Blot檢測(cè)cleaved caspase-3、caspase-7的蛋白表達(dá)水平;(c)和(d)Western Blot結(jié)果的灰度值分析。ns為P>0.05,* 為P<0.05。

3 討論與結(jié)論

放射治療是臨床上治療惡性腫瘤的重要手段,如何提高腫瘤細(xì)胞的放射敏感性是臨床治療過程中面臨的重要問題。HIGD1A被報(bào)道可以參與DNA同源重組修復(fù)調(diào)控腫瘤細(xì)胞的輻射敏感性[14],但HIGD1A在自噬中的作用尚不明確。本研究使用自噬誘導(dǎo)劑EBSS和電離輻射處理細(xì)胞,通過檢測(cè)自噬標(biāo)志蛋白LC3和P62的表達(dá)水平、mCherry-GFP-LC3B融合蛋白的熒光表達(dá)水平,并結(jié)合CCK-8實(shí)驗(yàn),以及檢測(cè)caspase-7和cleaved caspase-3的表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)HIGD1A響應(yīng)電離輻射處理之后的自噬,敲低HIGD1A聯(lián)合輻射能夠進(jìn)一步抑制細(xì)胞自噬的發(fā)生,增強(qiáng)Hela細(xì)胞的輻射敏感性。

細(xì)胞自噬發(fā)生過程中LC3蛋白會(huì)從LC3I轉(zhuǎn)換為膜結(jié)合的LC3II,P62蛋白作為自噬受體將自噬底物和LC3II連接,然后通過自噬溶酶體降解,所以LC3II和P62常作為檢測(cè)自噬的標(biāo)志蛋白[17]。本研究發(fā)現(xiàn),同時(shí)使用CQ和EBSS或電離輻射處理細(xì)胞后,敲低HIGD1A抑制了LC3II的生成,但P62的降解并沒有被抑制,可能P62不介導(dǎo)HIGD1A調(diào)控的自噬。自噬在放療后具有維持腫瘤細(xì)胞存活的功能,并最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的輻射抗性和惡性腫瘤復(fù)發(fā),使用自噬抑制劑(如氯喹)阻斷自噬活性可以使腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射敏感[18-19],表明自噬信號(hào)是腫瘤治療中的重要靶點(diǎn)。本研究對(duì)細(xì)胞活力的檢測(cè)發(fā)現(xiàn),敲低HIGD1A并使用自噬抑制劑進(jìn)一步抑制自噬降解可以增強(qiáng)HeLa細(xì)胞的輻射敏感性,表明HIGD1A參與細(xì)胞遭受應(yīng)激后的保護(hù)性自噬。自噬與凋亡之間存在復(fù)雜的交互調(diào)控[16],本文發(fā)現(xiàn)敲低HIGD1A提高了細(xì)胞的凋亡水平,結(jié)合敲低HIGD1A自噬水平下降,表明HIGD1A可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡參與細(xì)胞自噬。

綜上所述,本研究初步闡明HIGD1A蛋白參與細(xì)胞自噬并且通過細(xì)胞自噬調(diào)控腫瘤輻射敏感性的作用。本次實(shí)驗(yàn)將細(xì)胞自噬誘導(dǎo)劑和抑制劑與腫瘤放療相結(jié)合,這些數(shù)據(jù)可能為臨床治療提供相關(guān)支持。