周袁媛,劉 芳,陳金武,劉 磊,宋文成,3,5,儲(chǔ)焰南,3

(1.安徽大學(xué) 物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院,合肥 230601; 2.中國(guó)科學(xué)院合肥物質(zhì)科學(xué)研究院 安徽省醫(yī)學(xué)物理與技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室健康與醫(yī)學(xué)技術(shù)研究所,合肥 230031; 3.中國(guó)科學(xué)院合肥腫瘤醫(yī)院,合肥 230031;4.合肥師范學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院,合肥 230061; 5.江蘇高校放射醫(yī)學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心,蘇州 215123)

等離子體是除了固體、液體、氣體外,物質(zhì)的第4種狀態(tài)。非熱大氣壓等離子體(nonthermal atmospheric plasma,NAP),又稱(chēng)低溫等離子體,是在標(biāo)準(zhǔn)大氣壓下產(chǎn)生的等離子體[1]。據(jù)報(bào)道NAP能夠用于如癌癥治療、凝血、抗炎、消毒、抗菌、美學(xué)修復(fù)等[2-7],在癌癥治療領(lǐng)域,Fridman等[8]發(fā)現(xiàn)NAP能夠抑制黑色素瘤的生長(zhǎng),進(jìn)而將NAP技術(shù)首次引入體表癌癥治療的研究中。

肺癌是常見(jiàn)的癌癥類(lèi)型之一,幾乎四分之一的癌癥死亡是由肺癌導(dǎo)致。另外,肺癌預(yù)后極差,5年相對(duì)生存率在所有的癌癥中最低(21%)[9]。常見(jiàn)的肺癌治療方式有手術(shù)治療、放療、化療等[10]。雖然每種類(lèi)型的治療手段都對(duì)肺癌發(fā)展起到了一定的抑制作用,但每種手段均存在不足。故急需發(fā)展其他更好的治療手段。NAP作為一種新興的治療手段而引起了廣泛的關(guān)注,Kim等[11]開(kāi)創(chuàng)性地將NAP和內(nèi)窺鏡技術(shù)相結(jié)合,使NAP能夠應(yīng)用在肺癌等內(nèi)部腫瘤的治療中。

在之前的研究中,已經(jīng)報(bào)道過(guò)NAP及其處理過(guò)的活化液對(duì)肺癌細(xì)胞株H460的殺滅作用[12-13],但圍繞其產(chǎn)生的相關(guān)組分、作用的相關(guān)信號(hào)通路的研究尚未明確。因此,我們希望能夠進(jìn)一步探究NAP殺滅H460的機(jī)制,以期NAP技術(shù)未來(lái)能夠廣泛應(yīng)用于臨床治療中。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人大細(xì)胞肺癌H460細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù),使用RPMI-1640培養(yǎng)基,加入10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素/鏈霉素)。細(xì)胞置于60 mm培養(yǎng)皿中生長(zhǎng),并放置于溫度37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2 試劑與儀器

培養(yǎng)基RPMI-1640購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司;胎牛血清購(gòu)自上海Lonsera公司;PBS、胰酶、雙抗和活性氧檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司;NAC、過(guò)氧化氫檢測(cè)試劑盒、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、5×上樣緩沖液、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、Tris、SDS、甘氨酸和硝酸纖維素膜購(gòu)自上海碧云天公司;MTT購(gòu)自美國(guó)Sigma有限公司;線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(M8650)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;脫脂奶粉和Tween-20購(gòu)自蘭杰柯科技有限公司;氯化鈉購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司;一抗(ACTB兔多抗、AKT兔多抗、PI3K兔多抗、JNK兔多抗和STAT3兔多抗)、二抗(HRP標(biāo)記的二抗)購(gòu)自Cell Signaling Technology公司;ECL Plus試劑購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技公司;氦氣(99.999%)購(gòu)自南京特種氣體廠有限公司。

1.2 方法

1.2.1 NAP裝置

實(shí)驗(yàn)所用氦氣介質(zhì)阻擋放電大氣壓NAP裝置,見(jiàn)圖 1(a),氦氣純度為99.999%,流量為1 L/min。實(shí)驗(yàn)時(shí)需要提前通氣90 s,以確保排盡裝置底部容納凹槽內(nèi)空氣。容納凹槽內(nèi)能夠放置60 mm培養(yǎng)皿,當(dāng)電源接通時(shí),該裝置在有效電壓3.78 kV、頻率25 kHz的條件下產(chǎn)生NAP,當(dāng)細(xì)胞貼壁且覆蓋70%皿底面積時(shí),使用NAP處理,放置于恒溫培養(yǎng)箱中,孵育相應(yīng)時(shí)間后,進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2 培養(yǎng)基中ROS的測(cè)定

含或不含細(xì)胞的培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)NAP作用0、15、30和45 s后,或者用NAC預(yù)處理1 h再用NAP處理45 s后,放置0 h(立即測(cè))和4 h后,使用過(guò)氧化氫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基內(nèi)過(guò)氧化氫水平,即培養(yǎng)基中ROS的含量。步驟如下:使用96孔板中每孔加入100 μL培養(yǎng)基,再加入100 μL過(guò)氧化氫檢測(cè)試劑,每組設(shè)3個(gè)平行樣本測(cè)量,溶液充分混勻后,室溫放置30 min,于560 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度,該值最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出不同處理?xiàng)l件下培養(yǎng)基中過(guò)氧化氫的濃度。

1.2.3 細(xì)胞內(nèi)ROS的測(cè)定

使用活性氧檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)ROS含量。H460在經(jīng)過(guò)NAP作用0和45 s,或者用NAC預(yù)處理1 h再用NAP處理45 s,孵育4 h后棄去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基,使用PBS清洗培養(yǎng)皿后加入1 mL DCFH-DA熒光探針,避光孵育20 min后,棄去培養(yǎng)皿中液體,再使用PBS清洗培養(yǎng)皿以確保未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針影響檢測(cè)結(jié)果。DCFH-DA可被細(xì)胞內(nèi)各類(lèi)活性氧成分氧化為DCF,發(fā)出綠色熒光,進(jìn)而使用倒置熒光顯微鏡檢測(cè)并拍照。

1.2.4 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

使用MTT比色法[14]測(cè)量細(xì)胞增殖能力。H460在經(jīng)過(guò)NAP處理0、15、30、45、60和75 s后,或用NAC預(yù)處理1 h再用NAP處理45 s后,于恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h,棄去培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基,分別在每培養(yǎng)皿中加入1.5 mL的0.5 mg/mL MTT試劑,放置4 h使MTT與胞內(nèi)琥珀酸脫氫酶充分反應(yīng)后,棄去皿內(nèi)液體,加入等量二甲基亞砜(DMSO)溶解結(jié)晶紫,取200 μL溶液至96孔中,設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,并在波長(zhǎng)492 nm下測(cè)量每皿溶液的吸光度,細(xì)胞活力(Y)通過(guò)以下公式計(jì)算得到:

式中,ODA代表未處理(NAP處理0 s)組吸光度,ODB代表陰性對(duì)照(培養(yǎng)皿內(nèi)無(wú)細(xì)胞)組吸光度,ODC代表實(shí)驗(yàn)組吸光度。

1.2.5 線粒體膜電位檢測(cè)

使用線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)H460在經(jīng)過(guò)NAP作用0和45 s,或用NAC預(yù)處理1 h再用NAP處理45 s后,線粒體膜電位的變化情況。具體操作如下:經(jīng)處理的細(xì)胞在培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去培養(yǎng)基,用PBS清洗,再加入1 mL JC-1染色工作液,放入培養(yǎng)箱中孵育20 min,結(jié)束后吸除試劑,并使用JC-1染色緩沖液(1×)洗滌兩次,放入熒光顯微鏡下觀察。當(dāng)線粒體膜電位下降時(shí),JC-1從紅色熒光轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色熒光,進(jìn)而測(cè)定線粒體膜電位。

1.2.6 Western Blot實(shí)驗(yàn)

H460細(xì)胞NAP處理后,收集于離心管中,使用預(yù)冷PBS清洗兩次,棄上清液,加入200 μL RIPA裂解液重懸細(xì)胞,于冰上裂解20 min,4 ℃離心,收集上清液。BCA法蛋白定量后,加入上樣緩沖液,在100 ℃煮20 min;之后每組取20 μL,于恒壓100 V下進(jìn)行電泳90 min,再將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上,用含5%脫脂牛奶的TBST封閉2 h,4 ℃下孵育一抗過(guò)夜,用TBST清洗后,加入HRP標(biāo)記的二抗,室溫下孵育40 min,再用TBST清洗,在條帶上滴加ECL試劑,顯影成像。另外,使用的一抗包括:ACTB(1∶10 000)、JNK(1∶2 000)、STAT3(1∶1 000)、AKT(1∶2 500)和PI3K(1∶2 500),用含1%脫脂牛奶的TBST稀釋;使用的二抗按照1∶10 000,用TBST稀釋。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

分析數(shù)據(jù)至少進(jìn)行了3次重復(fù)的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)(n=3),并以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。所有數(shù)據(jù)均采用單因素或雙因素方差分析(ANOVA)確定。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 NAP裝置相關(guān)參數(shù)

使用0、15、30、45、60和75 s的NAP處理H460后,立即測(cè)量培養(yǎng)基的pH和溫度。隨著NAP處理時(shí)間的增加,培養(yǎng)基的pH值在8.15附近,溫度在22 ℃左右輕微波動(dòng),并沒(méi)有顯著變化,說(shuō)明NAP殺滅細(xì)胞的條件較為溫和,不會(huì)出現(xiàn)常見(jiàn)放療溫度過(guò)高導(dǎo)致的灼傷和pH值的變化等問(wèn)題,見(jiàn)圖 1(b)和1(c)。因此,該實(shí)驗(yàn)結(jié)果為NAP應(yīng)用于臨床腫瘤治療的可行性提供了可靠的依據(jù)。

(a)氦氣放電NAP示意圖,不同時(shí)間NAP處理含H460細(xì)胞的培養(yǎng)基;(b)pH值隨作用時(shí)間變化;(c)溫度隨作用時(shí)間變化。

2.2 NAP導(dǎo)致培養(yǎng)基中ROS含量增加

使用0、15、30、45、60和75 s的NAP處理含H460和不含H460的培養(yǎng)基,并在處理后立即或孵育4 h后,測(cè)量培養(yǎng)基中的ROS含量。與對(duì)照組(處理0 s)相比,隨著NAP處理時(shí)間增加,含或不含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中ROS的含量都顯著增加,并且當(dāng)孵育4 h后,含或不含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中ROS的含量也同樣增加,見(jiàn)圖2。并且,在NAP作用后立刻檢測(cè)培養(yǎng)基中ROS時(shí),無(wú)論培養(yǎng)基中是否含有細(xì)胞,其ROS含量的變化情況差異不大(P=0.959 1),而當(dāng)NAP作用后孵育4 h再檢測(cè),發(fā)現(xiàn)含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中的ROS隨作用時(shí)間增長(zhǎng)而增長(zhǎng),但上升速度顯著低于不含細(xì)胞的培養(yǎng)基(P<0.001)。Ma等[15]使用PAM(NAP作用20 min)處理含細(xì)胞的培養(yǎng)基0、2、4、6和12 h,發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng),含細(xì)胞的培養(yǎng)基中ROS含量顯著下降,這可能是因?yàn)镽OS進(jìn)入細(xì)胞中,其含量與細(xì)胞內(nèi)組分相互作用而降低。

NAP處理含或不含細(xì)胞的培養(yǎng)基 0、15、30、45、60和75 s,立即或者孵育4 h后檢測(cè)培養(yǎng)基中的ROS含量。* 為P<0.005;** 為P<0.001;*** 為P<0.000 1。

(a)熒光顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的變化情況;(b)熒光強(qiáng)度定量分析。培養(yǎng)基中加或不加入NAC 孵育1 h后,使用NAP處理細(xì)胞45 s。* 為P<0.005。

(a)處理細(xì)胞0、15、30、45、60和75 s;(b)不同濃度NAC處理細(xì)胞1 h,再用NAP處理細(xì)胞0和45 s。不同時(shí)間NAP處理肺癌細(xì)胞H460,24 h后進(jìn)行MTT測(cè)定細(xì)胞活力的變化,NAP處理0 s設(shè)為對(duì)照。** 為P<0.001,*** 為P<0.000 1。

2.3 NAP導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS含量增加

為探究NAP對(duì)H460細(xì)胞內(nèi)ROS的影響,使用NAP對(duì)H460細(xì)胞處理0或45 s,孵育4 h后,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的變化情況見(jiàn)圖 3,NAP能夠?qū)е翲460細(xì)胞中ROS的含量增加;但培養(yǎng)基中加入100 μmol/L ROS清除劑NAC,能夠?qū)е录?xì)胞內(nèi)ROS含量下降。因此,我們認(rèn)為NAP殺傷H460細(xì)胞與胞內(nèi)ROS的上升有關(guān)。

2.4 NAP降低肺癌細(xì)胞H460的細(xì)胞活力

使用0、15、30、45、60和75 s的NAP處理H460,孵育24 h后測(cè)定細(xì)胞活力,見(jiàn)圖 4(a),隨著NAP作用時(shí)間的增加,H460的細(xì)胞活力顯著下降,并且處理組與對(duì)照組(0 s)的細(xì)胞活力有顯著性差異(P<0.001)。當(dāng)NAP作用45 s后,細(xì)胞活力低于50%,因此,選擇NAP作用45 s進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。為研究ROS對(duì)細(xì)胞活力的影響,向培養(yǎng)皿中加入不同濃度的NAC,孵育1 h后NAP處理細(xì)胞45 s。孵育24 h后進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn),見(jiàn)圖 4(b),當(dāng)培養(yǎng)基中NAC濃度為50 μmol/L時(shí),細(xì)胞活力能夠恢復(fù)到對(duì)照組的83.85%,而當(dāng)培養(yǎng)基中NAC濃度增加到100 μmol/L時(shí),細(xì)胞活力能夠恢復(fù)到對(duì)照組的95.99%。由此可知,隨著培養(yǎng)基中NAC含量的上升,NAP作用后H460細(xì)胞活力顯著上升。因此,我們認(rèn)為NAP抑制肺癌細(xì)胞H460的活力由ROS介導(dǎo)。

2.5 NAP導(dǎo)致細(xì)胞線粒體膜電位下降

為探究NAP對(duì)H460細(xì)胞線粒體膜電位的影響,對(duì)H460細(xì)胞用NAP處理0或45 s,孵育4 h后使用熒光探針JC-1進(jìn)行實(shí)驗(yàn),見(jiàn)圖5。NAP能夠?qū)е翲460細(xì)胞中紅色熒光強(qiáng)度下降而綠色熒光強(qiáng)度上升,這表示線粒體膜電位下降。除此之外,當(dāng)培養(yǎng)基中加入NAC時(shí),JC-1的紅/綠熒光比例上升。這些結(jié)果表明NAP激發(fā)了胞內(nèi)ROS的上升,ROS又進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位去極化,細(xì)胞發(fā)生凋亡。如Xu等[16]證實(shí)NAP能夠產(chǎn)生ROS,導(dǎo)致多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞的線粒體膜電位下降,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生線粒體途徑的細(xì)胞凋亡。

(a)熒光顯微鏡檢測(cè)線粒體膜電位變化情況;(b)熒光強(qiáng)度定量分析。培養(yǎng)基中加或不加入NAC 孵育1 h后,使用NAP處理細(xì)胞45 s,JC-1染色。** 為P<0.001。

2.6 NAP抑制相關(guān)蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡

PI3K、AKT、JNK、STAT3這4種蛋白能夠參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝、增殖、遷移等重要生命活動(dòng)。有研究表明沉默非小細(xì)胞肺癌H1299的基因TARBP2[17],能夠下調(diào)JNK/STAT3/AKT通路的表達(dá),進(jìn)而減弱肺癌細(xì)胞的遷移與侵襲;并且白鮮堿[18]、厄洛替尼[19]等藥物能夠抑制PI3K/AKT信號(hào)通路的表達(dá)而起到抗癌的作用。Van Gils等[20]證明ROS能夠抑制JNK/STAT3信號(hào)通路,導(dǎo)致細(xì)胞線粒體功能產(chǎn)生障礙,阻礙細(xì)胞存活。而Guo等[21]證明抑制STAT3表達(dá)后又能導(dǎo)致AKT表達(dá)的減少。AKT是一種蛋白激酶,可阻止細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。ROS能夠抑制癌細(xì)胞中PI3K/AKT的表達(dá),抑制細(xì)胞遷移和生長(zhǎng)[22],又或者PI3K/AKT能夠進(jìn)一步導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低,導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[23]。因此為探究NAP對(duì)H460細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)情況的影響,使用NAP對(duì)H460處理0或45 s,進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn),蛋白表達(dá)情況見(jiàn)圖6。研究發(fā)現(xiàn)NAP導(dǎo)致PI3K、AKT、JNK、STAT3的表達(dá)量顯著降低,而在培養(yǎng)基中加入NAC能夠消除NAP對(duì)上述蛋白表達(dá)量的影響。因此,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NAP產(chǎn)生的ROS導(dǎo)致H460細(xì)胞死亡與下調(diào)PI3K/AKT和JNK/STAT3/AKT通路密切相關(guān)。

(a)PI3K、AKT、JNK、STAT3的表達(dá);(b)蛋白強(qiáng)度定量分析。培養(yǎng)基中加或不加入NAC孵育1 h后,使用NAP處理細(xì)胞45 s,Western Blot檢測(cè)。* 為P<0.05;** 為P<0.001;*** 為P<0.000 1。

3 討論與結(jié)論

目前針對(duì)H460的研究主要集中在細(xì)胞死亡的現(xiàn)象中,如研究NAP對(duì)H460造成的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化[34]、細(xì)胞凋亡、肌動(dòng)蛋白損傷[13]、DNA斷裂[12]等現(xiàn)象,但是沒(méi)有對(duì)其中ROS的作用以及涉及的相關(guān)蛋白表達(dá)變化進(jìn)行研究。本研究從NAP處理H460細(xì)胞入手,通過(guò)檢測(cè)NAP處理后培養(yǎng)基的溫度和pH值變化,提示NAP在臨床實(shí)用具有可行性,通過(guò)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn),證明NAP作用時(shí)間越長(zhǎng),H460細(xì)胞活力越低,而加入NAC后細(xì)胞活力恢復(fù);細(xì)胞內(nèi)外ROS含量檢測(cè)證明,隨著NAP作用的上升,細(xì)胞內(nèi)外ROS含量上升,當(dāng)培養(yǎng)基中加入NAC后,胞內(nèi)的ROS含量也隨之下降;JC-1檢測(cè)實(shí)驗(yàn)表明,NAP會(huì)造成H460線粒體膜電位下降,而在培養(yǎng)基中加入NAC后,線粒體膜電位會(huì)上升;Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,NAP會(huì)下調(diào)PI3K、AKT、JNK、STAT3蛋白的表達(dá),在培養(yǎng)基中加入NAC,上述蛋白表達(dá)量也上升。

因此,本研究表明NAP產(chǎn)生的ROS是其殺傷H460細(xì)胞的有效組分,它誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生線粒體依賴(lài)的細(xì)胞凋亡,并且研究表明NAP導(dǎo)致的死亡與抑制PI3K/AKT和JNK/STAT3/AKT蛋白通路表達(dá)相關(guān)。將來(lái)的研究可以圍繞NAP抑制肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲通路進(jìn)行。闡明NAP殺傷H460細(xì)胞相關(guān)蛋白信號(hào)通路的作用機(jī)制,對(duì)NAP未來(lái)更好地運(yùn)用于臨床具有重要意義。