張樂樂, 楚艷艷, 楊 歐, 汪菲菲, 劉生杰

(1.阜陽師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 阜陽 236037;2.阜陽師范大學(xué) 信息工程學(xué)院食品系,安徽 阜陽 236041;3.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶與食品科技學(xué)院,安徽 合肥 230036)

皇冠梨主要產(chǎn)自河北趙縣,果實(shí)橢圓、果肉細(xì)膩多汁、風(fēng)味酸甜,含有多種組生態(tài)與纖維素,適合加工果汁飲料.同時(shí),皇冠梨具有補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)利尿、清心潤(rùn)肺等功效.以加工過程中產(chǎn)生的梨皮和梨核為原料進(jìn)行再開發(fā),不僅能夠增加附加經(jīng)濟(jì)效益,而且可以減少環(huán)境污染.熊果苷是綠色植物中天然存在的糖苷類物質(zhì),具有抗微生物、抗氧化、抗炎活性[1].梨皮中含有豐富的熊果苷[2],梨中主要的多酚物質(zhì)是熊果苷和兒茶素[3],其中熊果苷能迅速深入肌膚,有效抑制酪氨酸酶活性、黑色素合成和皮膚色素沉積,對(duì)色斑和雀斑有明顯的去除效果,在化妝品中有廣泛應(yīng)用[4].通過對(duì)梨渣中的熊果苷進(jìn)行提取和純化,為提高梨渣的附加價(jià)值提供參考依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

梨渣:新鮮的皇冠梨榨汁后廢棄梨皮、梨核,置于干燥箱60 ℃至恒重,用粉碎機(jī)粉碎至粉末,過40目篩后備用.熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品(arbutin),分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;酪氨酸酶,無水乙醇,分析純,天津市永大化學(xué)試劑有限公司;無水甲醇,色譜純,賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;乙酸乙酯,色譜純,西隴科學(xué)股份有限公司;HPD100大孔吸附樹脂,東鴻化工有限公司;D101大孔吸附樹脂,北京索萊科技有限公司;AB-8大孔吸附樹脂,廣州韋伯科技有限公司;還有其他常見玻璃儀器.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;DGT-G電熱鼓風(fēng)干燥箱,合肥華德利科學(xué)器材有限公司;LC-16高效液相色譜儀,島津儀器蘇州有限公司;超聲波清洗機(jī),上海聲彥超聲波儀器有限公司;還有其他常見玻璃儀器.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 熊果苷的提取

分別稱取適量梨皮、梨核、梨肉等樣品,按料液比1∶10(g/mL)分別加入無水乙醇,靜置過夜.然后超聲1 h,過濾得到熊果苷提取液,共過濾兩次.將兩次濾液合并后定容至50 mL,重復(fù)3次,備用.

1.3.2 熊果苷含量分析

(1)標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備.精確稱取0.000 7 g熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品溶解于1.00 mL甲醇溶液作為儲(chǔ)備液,然后用甲醇逐級(jí)稀釋,分別配制成濃度依次為0.75、1.5、3、6、12、24 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,備用.

(2)待測(cè)品溶液的制備.采用1.3.1的實(shí)驗(yàn)步驟得到濾液,分析備用.

(3)液相色譜條件.固定相:色譜柱WondaSil C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相∶水—甲醇(體積比)=9∶1.流速0.5 mL/min.柱溫30 ℃.檢測(cè)波長(zhǎng):220 nm.進(jìn)樣量:5 μL.

(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制.根據(jù)熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖,以熊果苷濃度對(duì)峰面積作圖,可得線性回歸方程,計(jì)算出梨皮、梨肉和梨核中的熊果苷含量.

1.3.3 方法學(xué)評(píng)價(jià)

(1)加標(biāo)回收率.在樣品中分別加入高、中、低三個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,配置成加樣回收液,經(jīng)平行提取,檢測(cè)含量并計(jì)算回收率.

(2)精密度實(shí)驗(yàn).取12 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按照1.3.2色譜條件,檢測(cè)6次,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)相對(duì)偏差(RSD).

1.3.4 大孔樹脂對(duì)熊果苷分離純化的影響

(1)大孔樹脂的預(yù)處理.分別取適量的AB-8 、HPD100和D101三種型號(hào)的大孔樹脂,活化后濕法上柱.經(jīng)計(jì)算一個(gè)柱體積(BV)約為15 mL.

(2)三種大孔樹脂對(duì)梨渣中雜質(zhì)的吸附情況.將濃縮好的梨渣樣品上樣后,用不同濃度的乙醇溶液(0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)進(jìn)行洗脫,洗脫體積為2 BV.所得流份按洗脫液分成若干等量樣品,進(jìn)行薄層色譜檢測(cè)和高效液相色譜檢測(cè).

(3)薄層色譜檢測(cè).選用硅膠G254板為固定相,以乙酸乙酯∶甲醇(體積比)=3∶1為展開劑,在室溫下上行展開,取出,晾干,置碘蒸氣中熏蒸5 min后取出,在日光下檢視.

(4)高效液相色譜檢測(cè).取經(jīng)過三種大孔樹脂純化后效果最好的流份各1.00 mL,按照1.3.2色譜方法進(jìn)行檢測(cè).

1.3.5 酶活測(cè)定

酪氨酸酶活性抑制檢測(cè)方法,參照文獻(xiàn)[5]的實(shí)驗(yàn)方法略做修改,反應(yīng)體系組成見表1.依次添加溶液置于96孔板混勻,保溫30 ℃靜置2 h,然后于475 nm處測(cè)吸光度,每組平行實(shí)驗(yàn)3次.酶活抑制率的計(jì)算公式為

式中,A1、A2、A3、A4分別表示反應(yīng)體系1、2、3、4在475 nm處測(cè)得的吸光度.同時(shí)用含5%(質(zhì)量濃度)煙酰胺的小白瓶(OLAY)作對(duì)照組.

表1 反應(yīng)體系組成

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)重復(fù)3次,用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示.采用Origin Pro 8.6軟件繪圖分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 梨渣中熊果苷含量分析

液相色譜法主要是依據(jù)保留時(shí)間和峰面積來定性定量檢測(cè)目標(biāo)物[6].按照1.3.2的方法,利用高效液相色譜法鑒定梨渣提取物中的成分,結(jié)果如圖1所示.A圖是梨渣提取物的色譜圖,目標(biāo)物質(zhì)的出峰時(shí)間是10.322 min. B圖是熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖,出峰時(shí)間是10.307 min.比較兩者的保留時(shí)間,可以確定梨渣中含有熊果苷.

圖1 梨渣提取物與熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品液相色譜圖

圖2 梨不同部位熊果苷含量比較

根據(jù)熊果苷的濃度與峰面積之間的關(guān)系,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線y=14170x+5044.3,R2=0.998 3.可以看出,熊果苷在0.75～24 μg/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系良好.皇冠梨不同部位的熊果苷含量見圖2.結(jié)果發(fā)現(xiàn),發(fā)現(xiàn)梨皮中熊果苷的含量為22.85±1.67 μg/g,梨肉為5.05±1.12 μg/g,梨核為8.42±0.60 μg/g,在梨皮中的熊果苷含量最多,其次是梨核,梨肉最低,結(jié)果與文獻(xiàn)[7]結(jié)果是一致的.郭靜[8]研究指出,熊果苷易溶于水可能與熊果苷的運(yùn)輸有關(guān),熊果苷在梨樹體內(nèi)合成后,因其溶解性可能會(huì)造成隨著水分的運(yùn)輸表現(xiàn)出分布不均勻現(xiàn)象.果皮是熊果苷含量最高的部位,可能是由于梨果皮存在蒸發(fā)現(xiàn)象,使得果實(shí)內(nèi)的熊果苷向外緣富集所導(dǎo)致[9].

2.2 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.2.1 加標(biāo)回收率

在樣品中分別加入高、中、低三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,配置成三種不同濃度的加樣回收液,按照上述條件進(jìn)行分析,對(duì)添加3、6、12 μg/mL三個(gè)水平的梨皮中的熊果苷做樣品加樣回收實(shí)驗(yàn),平均加標(biāo)回收率為97.22%、100.83%、100.44%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.42%、1.19%、1.96%,均小于2%,說明檢測(cè)的結(jié)果準(zhǔn)確可靠.

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取12 μg/mL的熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液,按照上述高效液相色譜的條件,連續(xù)進(jìn)樣6次進(jìn)行實(shí)驗(yàn).計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)=1.08%,說明精密度良好.

2.3 大孔樹脂分離純化效果

2.3.1 薄層色譜結(jié)果

將樣品經(jīng)過大孔樹脂純化的不同流份進(jìn)行薄層層析,三種型號(hào)的大孔樹脂純化結(jié)果見圖3～圖5.圖3是梨渣濃縮樣品經(jīng)過AB-8大孔樹脂分離純化后的薄層色譜圖.其中1-13號(hào)為13個(gè)流份,14號(hào)是熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品.可以看出,熊果苷的Rf=0.85,其中1-6號(hào)流份雜質(zhì)較多;相比而言,7號(hào)流份的分離效果比較理想,含有的雜質(zhì)較少,而8-13號(hào)流份拖帶現(xiàn)象嚴(yán)重.圖4是梨渣濃縮樣品經(jīng)過HPD100大孔樹脂分離純化后的薄層色譜圖.1-13號(hào)為13個(gè)流份,14號(hào)是熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品.可以看出,相比而言,4號(hào)流份的純化效果比較理想.

圖3 AB-8大孔樹脂分離后的流份薄層色譜圖 圖4 HPD100大孔樹脂分離后的流份薄層色譜圖

圖5 D101大孔樹脂分離后的流份薄層色譜圖

圖5是梨渣濃縮樣品經(jīng)過D101大孔樹脂分離純化后的薄層色譜圖.其中,1-13號(hào)為13個(gè)流份,14號(hào)是熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品.可以看出,5號(hào)流份的純化效果最好.6～12號(hào)流份可以檢出熊果苷,但是由于其他雜質(zhì)的影響,拖尾比較嚴(yán)重.

比較以上不同薄層色譜板的分離純化效果,發(fā)現(xiàn)大孔樹脂AB-8分離得到的7號(hào)流份、大孔樹脂HPD100的4號(hào)流份、大孔樹脂D101的5號(hào)流份的純化效果比較理想,經(jīng)高效液相色譜法進(jìn)一步驗(yàn)證,篩選出最佳分離效果的大孔樹脂.

2.3.2 高效液相色譜分析結(jié)果

將大孔樹脂AB-8分離得到的7號(hào)流份、大孔樹脂HPD100的4號(hào)流份、大孔樹脂D101的5號(hào)流份進(jìn)行高效液相色譜分析,結(jié)果見圖6.A圖是AB-8的7號(hào)流份,B圖是HPD100的4號(hào)流份,C圖是D101的5號(hào)流份,根據(jù)高效液相色譜檢測(cè)得出的色譜圖結(jié)果,對(duì)比分析后得出D101的純化效果最好.

圖6 三種型號(hào)大孔樹脂的色譜圖

D101是非極性樹脂,AB-8樹脂屬于弱極性,HPD100屬于非極性樹脂[10].三種型號(hào)的大孔樹脂具有適中的孔徑和較大的比表面積,屬于弱極性樹脂,可以有效減少對(duì)極性雜質(zhì)的吸附.通過對(duì)比,D101型號(hào)的大孔樹脂純化后的流份經(jīng)過高效液相色譜分析,與前兩者相比,雜質(zhì)去除效果明顯,分離純化效果最好.

2.4 測(cè)定酶活實(shí)驗(yàn)結(jié)果

依據(jù)1.3.5實(shí)驗(yàn)方法添加樣品于96孔板后,2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定熊果苷對(duì)酪氨酸酶活性的抑制情況.配制3組平行實(shí)驗(yàn),利用相關(guān)數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算得出,大孔樹脂D101分離純化的5號(hào)流份對(duì)酪氨酸酶的抑制率為39.70±0.99%,5%煙酰胺的抑制率為57.20±0.19%.純化的熊果苷對(duì)酪氨酸抑制率低于5%煙酰胺的酶活抑制率,主要是由于提取的樣品中含有少量的雜質(zhì),但是美白活性及其作用機(jī)理還需要進(jìn)一步研究.

3 結(jié)論

以皇冠梨為原料提取熊果苷,利用高效液相色譜法檢測(cè)出梨皮、梨核、梨肉中熊果苷的含量分別為22.85±1.67 μg/g, 8.42±0.60 μg/g,5.05±1.12 μg/g.對(duì)比AB-8、HPD100和D101三種型號(hào)的大孔樹脂對(duì)梨渣中熊果苷的純化效果,發(fā)現(xiàn)大孔樹脂D101的分離純化效果最好,其中5號(hào)流份的純度較高,其對(duì)酪氨酸酶的抑制率為39.70±0.99%,低于5%煙酰胺的抑制率57.20±0.19%.研究成果為后續(xù)的梨渣分離純化工藝提供了較好的實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為其在美白領(lǐng)域的應(yīng)用提供了思路和方法.