韓佳穎，覃瑤，何飛

2013—2021年杭州某綜合醫(yī)院非結(jié)核分枝桿菌肺病流行狀況分析

韓佳穎1，覃瑤2，何飛1

1.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，浙江杭州 310003；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院結(jié)核科，浙江杭州 310003

分析杭州市結(jié)核病定點診治醫(yī)院2013—2021年非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）肺病的流行狀況，為杭州市該病的臨床防治診療及流行病學(xué)提供依據(jù)。收集2013—2021年浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院結(jié)核科及呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的疑似肺結(jié)核患者，經(jīng)抗酸桿菌涂片及BACTEC MGIT960確診為分枝桿菌感染，采用實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（tuberculosis complex，MTB）與NTM的菌群鑒定，對鑒定為NTM的菌株采用HAIN基因分型鑒定法及DNA微陣列技術(shù)進行菌種鑒定，并對感染者的相關(guān)資料進行總結(jié)分析。2013—2021年，從37 520例疑似肺結(jié)核患者標本中分離出NTM菌株1257株，檢出率從2013年的0.8%上升到2021年的6.7%。患者中男性占50.76%，女性占49.24%。年齡分布上，60～79歲的中老年患者最多，占55.0%。2013年檢出3種NTM菌種，分別是胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和龜/膿腫分枝桿菌；2021年菌種分布達13種，前三位分別是胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌和鳥分枝桿菌。2013—2021年杭州地區(qū)NTM檢出率持續(xù)升高，感染人群以男性、60～79歲的中老年為主，感染菌種以胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌和鳥分枝桿菌為主。

分枝桿菌；非結(jié)核分枝桿菌；菌種鑒定；疾病特征；流行病學(xué)

非結(jié)核分枝桿菌（nontuberculosis mycobacteria，NTM）是除結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（tuberculosis complex，MTB）和麻風(fēng)分枝桿菌以外的其他分枝桿菌的總稱，目前共發(fā)現(xiàn)有菌種約190余種，14個亞種，大多數(shù)為條件致病菌[1]。近年來，NTM感染在歐美國家和包括我國在內(nèi)的亞洲國家的發(fā)病率均逐漸上升，已逐步成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題[2-3]。目前國內(nèi)尚缺乏大樣本NTM病的流行病學(xué)調(diào)查資料，了解NTM病的趨勢和流行對疾病診治和防控至關(guān)重要[1]。本研究對2013—2021年杭州市一家定點結(jié)核病診療中心分離培養(yǎng)的NTM菌株進行分析，以了解該市NTM的菌種分布、流行狀況，為本病的防治診療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象及菌株來源

通過調(diào)查電子病歷系統(tǒng)、檢驗系統(tǒng)的數(shù)據(jù)，收集2013年1月至2021年12月浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院結(jié)核科及呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科收治的37 520例疑似肺結(jié)核患者，對萋–尼氏染色法染色及MGIT960分枝桿菌快速培養(yǎng)陽性者，采用實時熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測進行MTB與NTM的初步菌群鑒定，對鑒定為NTM的菌株應(yīng)用HAIN基因分型鑒定及DNA微陣列菌種鑒定，同一患者多次培養(yǎng)得到同一種分枝桿菌按重復(fù)菌株剔除。MTB質(zhì)控菌株（標準菌株）H37Rv（ATCC27294）、胞內(nèi)分枝桿菌（ATCC13950）、鳥分枝桿菌（ATCC25291）、膿腫分枝桿菌（ATCC19977）、堪薩斯分枝桿菌（ATCC12478）、龜分枝桿菌（ATCC35752）、偶然分枝桿菌（ATCC6841）均來源于中國疾病預(yù)防控制中心國家結(jié)核病參比實驗室傳代培養(yǎng)。NTM病診斷標準參照指南[1]。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑 萋–尼氏染色試劑購自珠海貝索生物技術(shù)有限公司；BACTEC MGIT960分枝桿菌分析系統(tǒng)（MGIT 960）及其配套試劑MGIT試管、雜菌抑制劑均購自美國BD公司；HAIN基因分型試劑盒（CM/AS）購自德國HAIN Lifescience公司；分枝桿菌核酸檢測試劑盒、分枝桿菌菌種鑒定試劑盒（DNA微陣列芯片法）購自北京博奧生物有限公司。所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.2.2 儀器 生物顯微鏡（日本奧林巴斯公司）、低溫離心機（德國EPPENDORF公司）、熒光定量PCR儀（美國Roche公司）、全自動結(jié)核桿菌培養(yǎng)箱（美國BD公司）、HybSet微陣列芯片雜交儀、芯片洗干儀、微陣列芯片掃描儀均購自北京博奧生物集團有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 MGIT960培養(yǎng) 按照《結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)培訓(xùn)教程》[4]進行，對臨床分離株進行萋-尼抗酸涂片染色檢測是否存在抗酸桿菌，采用自動化的BACTEC MGIT 960分枝桿菌培養(yǎng)液快速培養(yǎng)，通常在2～4周內(nèi)報告陽性結(jié)果“分枝桿菌生長”，在42d后報告陰性結(jié)果。

1.3.2 PCR熒光探針法初步鑒定 按照結(jié)核菌和非結(jié)核分枝桿菌實時PCR檢測試劑盒說明，采用雙重PCR技術(shù)和Taqman探針技術(shù)相結(jié)合，對標本中提取的分枝桿菌核酸進行定性檢測。分別針對MTB和NTM的特異性序列設(shè)計引物和探針，兩探針分別標記對應(yīng)的熒光發(fā)光基團。檢測時，當反應(yīng)體系中有目的基因存在時，就會釋放出熒光。通過監(jiān)測FAM及HEX兩通道不同的熒光信號變化，進而實現(xiàn)對MTB和NTM的檢測。結(jié)果判定見表1。

表1 PCR熒光探針法檢測結(jié)果及解釋

1.3.3 菌種鑒定 2013—2016年，將培養(yǎng)陽性菌種經(jīng)HAIN基因組試劑盒提取DNA，擴增200bp片段的23SrRNA；雜交及顯色操作過程參照試劑盒說明書，示例見圖1。2017—2021年，采用DNA微陣列芯片法鑒定培養(yǎng)陽性菌種，將雜交緩沖液和PCR產(chǎn)物吹掃并混合。再將混合物添加到采樣孔中，進行洗滌和干燥芯片，采用微陣列芯片掃描儀進行掃描和相應(yīng)軟件進行信號讀取，所有NTM菌株都獲得一張清晰的芯片圖，示例見圖2。

圖1 HAIN基因分型試劑盒菌種鑒定雜交示例圖

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以例數(shù)（百分率）[（%）]表示，比較采用2檢驗，<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各年度NTM菌株檢出情況

對37 520份標本進行檢測，2013—2016年共分離培養(yǎng)出4種NTM，分別為胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌，共計245株。2017—2021年共分離培養(yǎng)出12種NTM，分別為胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、偶然分枝桿菌、戈登分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、田野分枝桿菌、土分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌株共計1012株，NTM的總分離率為3.4%，具體見圖3和表2。

圖3 患者納入及實驗室檢測流程圖

2.2 NTM患者的性別、年齡分布

2013—2021年杭州市NTM感染患者中，男性占50.76%，略高于女性的49.24%。患者年齡7～98歲，平均62.8歲。各年度感染者及男、女性感染者的年齡分布均以60～79歲組最多，具體見表3、表4。2013—2021年，男女構(gòu)成比變化趨勢差異有統(tǒng)計學(xué)意義（2=8.218，=0.003），NTM年齡構(gòu)成比變化趨勢差異有統(tǒng)計學(xué)意義（2=5.144，=0.023）。

表2 2013—2021年NTM檢出情況

2.3 NTM菌種分布

2013年分離出NTM 31株，共鑒定出胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌3種菌種，有1例MTB及NTM共存；2014—2016年分離出NTM共214株，前三位分別為胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌；2017年共分離出NTM 50株，鑒定出8種NTM，前三位分別為胞內(nèi)分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌；2018年105株共鑒定出8種NTM，前三位分別為胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌；2019年296株共鑒定出9種NTM，前三位分別為胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌；2020年共檢出NTM 283株，包括12種類型，菌種前三位分別為胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌；2021年共檢出NTM 278株，包括12種類型，前三位分別為胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌和鳥分枝桿菌，分別占45.7%、15.5%、12.2%，其余還有少許堪薩斯分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、偶然分枝桿菌、戈登分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、田野分枝桿菌、土分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌菌株。

表3 NTM患者不同特征在2013—2021年的分布情況[n（%）]

表4 2013—2021年各年齡組NTM患者在不同性別中的分布情況

3 討論

3.1 NTM分離率

我國目前尚沒有關(guān)于NTM的大樣本流行病學(xué)調(diào)查資料[1,5]。既往研究顯示，我國NTM分離率由1979年的4.3%上升至2010年的22.9%，呈明顯的上升態(tài)勢[6]。一項薈萃分析指出，在中國疑似結(jié)核患者中，NTM的分離率為4.66%～5.78%，分枝桿菌中NTM的分離率為11.57%[7]。

NTM的分離率在我國的東南沿海地區(qū)高于其他地區(qū)[8]。本研究結(jié)果顯示杭州地區(qū)2013—2021年總分離率為3.40%，低于2010年流行病學(xué)抽樣調(diào)查的22.90%、北京市37.30%、廣州市24.20%、紹興市10.90%、湖南省10.20%、福建省6.35%、深圳市4.10%[6,9-14]。本研究2021年NTM的分離率為6.7%，與重慶市5.7%、上海市5.9%相近，高于云南的1.6%[15-17]。NTM的流行及檢出有顯著的地域差異，提示不同地區(qū)需根據(jù)當?shù)匾咔樽鞒鱿鄳?yīng)的防控策略。

3.2 NTM在人群中的分布

NTM的發(fā)病與年齡呈正相關(guān)，在湖南省14個地級市的年齡分布中，40歲以上的中老年患者最多，占39.2%[12,18]；南京地區(qū)50歲以上的患者男性占68.6%，女性占77.8%[19]；深圳地區(qū)患者主要年齡段以55歲以下的青壯年為主，占84.5%，且男、女性患者的分布峰值均以25～34歲年齡組最多，可能與當?shù)氐娜丝诮Y(jié)構(gòu)有關(guān)[14]。韓國男性患者主要集中在60和70多歲，而女性患者則更年輕一些，平均62.7歲[20]。新加坡患者的中位年齡為67歲[21]。美國65歲以上的患者年患病率也明顯高于其他年齡段[19]。本研究中NTM感染者的男女性分布峰值均在60～79歲，與文獻報道一致。

3.3 NTM種群分布比較

NTM為環(huán)境細菌，菌種分布具有地域差異性，可能與當?shù)氐牡乩砦恢?、氣候、生活環(huán)境、實驗室條件等密切相關(guān)[7]。在南京、北京、湖南等地胞內(nèi)分枝桿菌是最常見的致病菌，分別占70.1%、31.8%、27.2%[9,12,19]；上海、伊朗最常見的是堪薩斯分枝桿菌，分別占45.0%、30.5%[16,22]；深圳、新加坡、廣東最常見的是膿腫分枝桿菌，分別占41.6%、49.9%、48.8%[14,21]。而MAC作為大多數(shù)國家（地區(qū)）的主要菌種，在澳大利亞、韓國、亞洲、北美、南非、歐洲和南美洲所占比例分別為71.1%、63.6%、53.8%、52.0%、50.5%、36.9%、31.3%[20,23]。

有研究指出，在中國2015年之前最流行的菌種是膿腫分枝桿菌，2015年后則為胞內(nèi)分枝桿菌[7]。本研究經(jīng)菌種鑒定NTM種群分布達13種，2013—2021年最常見的均為胞內(nèi)分枝桿菌，與部分文獻內(nèi)容契合。

3.4 NTM菌種鑒定的重要性

NTM感染后可產(chǎn)生與MTB相似的癥狀、體征和影像改變，目前大部分基層醫(yī)院依然使用抗酸染色作為診斷MTB的方法。但在無菌種鑒定結(jié)果的情況下，抗酸染色不能有效區(qū)分兩者，故不少NTM患者被誤診為MTB感染，并接受持續(xù)無效的抗結(jié)核治療[1]。因此需要更多的臨床實驗室開展NTM的菌種鑒定及藥敏檢測，需要臨床醫(yī)生對本病有更多的認識。

3.5 局限性

本研究在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬杭州市胸科醫(yī)院進行，數(shù)據(jù)無法完全代表杭州地區(qū)的總體流行病學(xué)，但該院是杭州最大的結(jié)核病定點診治醫(yī)院，對了解整個杭州地區(qū)的NTM感染現(xiàn)狀具有一定的代表性；其次，未納入肺外的NTM感染人群，會導(dǎo)致檢出率的低估；此外，每位患者的環(huán)境因素未納入回顧性研究。

綜上所述，2013—2021年杭州地區(qū)NTM發(fā)病率持續(xù)上升，感染人群以男性、中老年為主，NTM流行菌種以胞內(nèi)分枝桿菌、龜/膿腫分枝桿菌和鳥分枝桿菌為主。由于NTM的發(fā)病率預(yù)計將持續(xù)增加，因此有必要進行前瞻性評估，并盡早開展NTM菌種鑒定，這對本病的早期診治有重要意義。

[1] 中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會. 非結(jié)核分枝桿菌病診斷與治療指南(2020年版)[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2020, 43(11): 918–946.

[2] 沙巍, 肖和平. 再議非結(jié)核分枝桿菌的危害性[J]. 中華結(jié)核和呼吸雜志, 2018, 41(2): 83–85.

[3] Furuuchi K, Morimoto K, Yoshiyama T, et al. Interrelational changes in the epidemiology and clinical features of nontuberculous mycobacterial pulmonary disease and tuberculosis in a referral hospital in Japan[J]. Respir Med, 2019, 152: 74–80.

[4] 趙雁林. 結(jié)核病實驗室診斷技術(shù)培訓(xùn)教程[M]. 北京: 人民衛(wèi)生出版社, 2014: 42–47.

[5] Wassilew N, Hoffmann H, Andrejak C, et al. Pulmonary disease caused by non-tuberculous mycobacteria[J]. Respiration, 2016, 91(5): 386–402.

[6] 全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組, 全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室. 2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告[J]. 中國防癆雜志, 2012, 34(8): 485–508.

[7] Zhou L, Xu D, Liu H, et al. Trends in the prevalence and antibiotic resistance of non-tuberculous mycobacteria in mainland china, 2000—2019: Systematic review and Meta-analysis[J]. Front Public Health, 2020, 8: 295.

[8] 陳闖, 逯嘉, 楊筠, 等. 中國16省報告非結(jié)核分枝桿菌在抗酸染色陽性菌中的分離情況[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)情報雜志, 2017, 33(8): 762–767

[9] Huang J J, Li Y X, Zhao Y, et al. Prevalence of nontuberculous mycobacteria in a tertiary hospital in Beijing, China, January 2013 to December 2018[J]. BMC Microbiol, 2020, 20(1): 158.

[10] 馬品云, 譚耀駒, 蔡杏珊, 等. 2013—2015年廣州市舊城區(qū)各類分枝桿菌流行情況[J]. 中國防癆雜志, 2016, 38(10): 823–826.

[11] 金法祥, 陶學(xué)芳, 王華鈞, 等. 2017年紹興地區(qū)106株非結(jié)核分枝桿菌菌種鑒定結(jié)果分析[J]. 中國防癆雜志, 2019, 41(11): 1179–1183.

[12] 陳忠南, 易松林, 胡培磊, 等. 2012—2017年湖南省非結(jié)核分枝桿菌感染的特征分析[J]. 中國防癆雜志, 2019, 41(2): 217–221.

[13] 林建, 趙永, 戴志松, 等. 福建省261株非結(jié)核分枝桿菌的菌種鑒定分析[J].中國防癆雜志, 2021, 43(6): 590–595.

[14] 洪創(chuàng)躍, 李金莉, 趙廣錄, 等. 2013—2017年深圳市非結(jié)核分枝桿菌流行狀況分析[J]. 中國防癆雜志, 2019, 41(5): 529–533.

[15] 羅明, 張匯征, 李桓, 等. 重慶市2016—2017年非結(jié)核分枝桿菌流行狀況分析[J]. 國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志, 2019, 40(10): 1178–1182.

[16] Wu J, Zhang Y, Li J, et al. Increase in nontuberculous mycobacteria isolated in Shanghai, China: Results from a population-based study[J]. PLoS One, 2014, 9(10): e109736.

[17] 陳濤, 許琳, 楊慧娟, 等. 云南省非結(jié)核分枝桿菌流行狀況及病原譜分析[J]. 中國熱帶醫(yī)學(xué), 2018, 18(9): 7–9.

[18] Winthrop K L, Marras T K, Adjemian J, et al. Incidence and prevalence of nontuberculous mycobacterial lung disease in a large U.S. managed care health plan, 2008—2015[J]. Ann Am Thorac Soc, 2020, 17(2): 178–185.

[19] Hu C, Huang L, Cai M, et al. Characterization of non-tuberculous mycobacterial pulmonary disease in Nanjing district of China[J]. BMC Infect Dis, 2019, 19(1): 764.

[20] Park Y, Kim C Y, Park M S, et al. Age-and sex-related characteristics of the increasing trend of nontuberculous mycobacteria pulmonary disease in a tertiary hospital in South Korea from 2006 to 2016[J]. Korean J Intern Med, 2020, 35(6): 1424–1431.

[21] Zhang Z X, Cherng B P Z, Sng L H, et al. Clinical and microbiological characteristics of non-tuberculous mycobacteria diseases in Singapore with a focus on pulmonary disease, 2012—2016[J]. BMC Infect Dis, 2019, 19(1): 436.

[22] Khosravi A D, Asban B, Hashemzadeh M, et al. Molecular identification, and characterization ofstrains isolated from four tuberculosis regional reference laboratories in Iran during 2016—2018[J]. Infect Drug Resist, 2020, 13: 2171–2180.

[23] Hoefsloot W, van Ingen J, Andrejak C, et al. The geographic diversity of nontuberculous mycobacteriaisolated from pulmonary samples: An NTM-NET collaborative study[J]. Eur Respir J, 2013, 42(6): 1604–1613.

Analysis on the epidemic situation of nontuberculosis mycobacteria pulmonary disease in a general hospital in Hangzhou from 2013 to 2021

HAN Jiaying, QIN Yao, HE Fei

1.Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Affiliated Hangzhou Chest Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, Zhejiang, China; 2.Department of Tuberculosis, Affiliated Hangzhou Chest Hospital, Zhejiang University School of Medicine, Hangzhou 310003, Zhejiang, China

To analyze the epidemic situation of nontuberculosis mycobacteria (NTM) pulmonary diseases in the tuberculosis designated hospital in Hangzhou city from 2013 to 2021, so as to provide reference for clinical prevention, treatment and epidemiology of NTM disease in Hangzhou city.To collect suspected pulmonary tuberculosis patients admitted to theDepartment ofTuberculosis and Respiratory, Affiliated Hangzhou Chest Hospital, Zhejiang University School of Medicine from 2013 to 2021,who were diagnosed withinfection by acid fast bacilli smears and BACTEC MGIT960, use real-time fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to detect the initial flora identification oftuberculosis complex(MTB) and NTM, use HAIN genotyping identification method and DNA microarray technology to identify the strains identified as NTM, and summarize and analyze the relevant data of patients.From 2013 to 2021, 1257 NTM isolates were isolated from 37520 patients, rising from 0.8% in 2013 to 6.7% in 2021. Among patients, 50.76% were male and 49.24% were female. In the age distribution, the middle-aged and elderly patients aged 60-79 years were the most, accounting for 55.0%. Three NTM strains were detected in 2013,including,and/; In 2021, there were 13 NTM strains, with the first three being,and.From 2013 to 2021, the detection rate of NTM in Hangzhou continued to increase. The majority of infected people were men, middle-aged and elderly people aged 60 to 79 years old. The main strains were,mand.

; Nontuberculous mycobacteria; Strain identification; Disease characteristics; Epidemiology

R18；R52

A

10.3969/j.issn.1673-9701.2023.27.002

浙江省中醫(yī)藥科技計劃項目（2022ZA127）

覃瑤，電子信箱：418497538@qq.com

（2022–12–26）

（2023–09–03）