潘素躍，王樸，黃巧，胡敏，彭怡，李偉佳，戚嘉慧，劉凌宇，江千帆，何玉清，2

1 廣東醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學系 廣東醫(yī)科大學醫(yī)學系統(tǒng)生物學研究所，廣東東莞 523808；2 東莞市寮步醫(yī)院皮膚科

銀屑病是一種常見的由多種免疫細胞介導的慢性炎癥性皮膚病，常表現(xiàn)為皮膚紅斑，其表面附著數(shù)層銀白色鱗屑［1］。據(jù)調(diào)查，銀屑病的全球發(fā)病率為0.9%~8.5%，我國發(fā)病率為0.5%~4.6%［2］。銀屑病的病因復雜，可能與遺傳、感染、免疫失調(diào)、精神應激、藥物等多種因素有關(guān)，其發(fā)病機制是多種免疫細胞共同參與的免疫反應，其中以T 淋巴細胞介導為主，導致表皮細胞過度增殖以及不同程度的角質(zhì)形成細胞異常分化、炎癥發(fā)生及血管生成［3］。目前國際指南推薦的治療方法主要包括局部治療、常規(guī)全身治療、生物療法和免疫抑制劑等［4］。由于傳統(tǒng)藥物系統(tǒng)療法不良作用明顯，而生物制劑費用高昂，長期用藥會導致患者依從性變差且經(jīng)濟負擔過重［5］。因此，使用具有較好臨床療效的中藥復方制劑作為治療銀屑病的替代或補充藥物成為可能［6］。中藥治療銀屑病應予以更多的關(guān)注，相較于其他針對銀屑病生物信息學的研究側(cè)重于關(guān)鍵基因篩選上，本研究通過采用CIBERSORT 反卷積算法對銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因與免疫浸潤水平之間的關(guān)系進行了分析，篩選出銀屑病有治療潛力的中藥，為銀屑病病理機制的研究和更安全有效的治療方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源 在GEO 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）按照疾病類別為銀屑病，生物類型為人類的條件檢索基因表達譜。最終本研究選取 GSE166388 基因表達譜作為訓練數(shù)據(jù)集，GSE2737作為驗證集。其中 GSE166388含 4例份銀屑病皮損組織樣本與4 例份健康皮膚組織樣本；GSE2737 含4 例份銀屑病皮膚組織樣本與3 例份健康皮膚組織樣本。

1.2 銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因的獲取

1.2.1 銀屑病高度相關(guān)差異共表達基因（DEG s）的 獲取及生物學功能富集分析 ①銀屑病DEGs的獲?。菏褂?R 軟件包 limma（version 3.40.6）對合并數(shù)據(jù)集按照｜log2Fc|≥1，P< 0.05 的標準要求篩選DEG s，并繪制熱圖以及火山圖。②DEG s 富集分析：在GSEA 數(shù)據(jù)庫下載 GSEA 軟件（version 3.0），并 從 Molecular Signatures Database 下 載 c2.cp.kegg.v7.4.symbols.gmt 子集合，設(shè)定最小基因集為5，最大基因集為 5 000，且當P< 0.05， FDR < 0.25作為明顯富集基因集的判定標準，取交集的通路進行富集分析，對DEG s 富集最明顯的5 個通路進行可視化。③銀屑病相關(guān)性最高的基因模塊篩選：根據(jù)標準化后的基因表達矩陣，利用加權(quán)基因共表達網(wǎng)絡(luò)分析 （WGCNA） 包和 limma 包分別進行樣本聚類，計算軟閾值，構(gòu)建無尺度共表達網(wǎng)絡(luò)。通過基因顯著性和模塊顯著性評價基因和模塊之間的關(guān)聯(lián)性，篩選出銀屑病相關(guān)性最高的基因模塊。銀屑病高度相關(guān)DEG s 的功能富集：將①中獲取的DEG s與模塊相關(guān)性分析中相關(guān)性最高的模塊取交集（高度相關(guān)DEG s）。利用 R 軟件包 clusterProfiler 對高度相關(guān)DEG s 的生物過程 （BP）、分子功能（MF）以及細胞組分 （CC）進行基因本體論（GO）功能富集分析；對基因通路進行基因組百科全書（KEGG）功能富集分析。

1.2.2 銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因的篩選 將篩選出的銀屑病高度相關(guān)DEG s 導入 STRING 數(shù)據(jù)庫繪制蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，置信分數(shù)設(shè)置為>0.4。并通過 Cytoscape 的 CytoHubba 插件，利用 MCC、DEGREE、EPC和 CLOSENESS 四種 Hub 基因算法，將四種算法結(jié)果的前10 個基因取交集，得到銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因。選取外部銀屑病基因芯片作為驗證集，對篩選出的銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因的表達水平進行驗證。

1.3 銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因表達水平與皮損組織免疫浸潤細胞比例的相關(guān)性分析 通過 CIBERSORT算法，按照P<0.05 的標準計算 22 種免疫細胞在所有樣本中的占比情況，并進行可視化；對銀屑病皮損組織樣本與健康對照皮膚組織之間的免疫細胞進行差異分析，并通過箱線圖進行可視化。將關(guān)鍵基因與免疫浸潤細胞進行 Pearson 相關(guān)性分析。

1.4 對銀屑病有治療潛力的中藥預測選 將銀屑病“Psoriasis”輸入Coremine medical醫(yī)學本體信息檢索平臺（WWW.coremine.com/medical/）的檢索框中，在搜索結(jié)果中點擊右側(cè)“基因”選項，分別選擇上述步驟中得到的銀屑病發(fā)病相關(guān)關(guān)鍵基因，同時點擊網(wǎng)頁左側(cè)“drug”選項，結(jié)果出現(xiàn)很多與銀屑病發(fā)病相關(guān)的中藥名。最后基于P<0.05的檢驗水準，篩選出現(xiàn)頻次最高的中藥作為對銀屑病有治療潛力的中藥。

2 結(jié)果

2.1 銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因的獲取結(jié)果 篩選出銀屑病DEGs 1 181 個，其中上調(diào)基因 564 個，下調(diào)基因 617個。

GSEA 分析結(jié)果顯示，銀屑病DEGs 富集最明顯的前 5 個的信號通路分別是MAPK 信號通路、NOTCH 信號通路、mTOR 信號通路、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、醛固酮調(diào)節(jié)鈉重吸收。

WGCNA 分析結(jié)果顯示，獲得了 24 個共表達模塊，其中與銀屑病相關(guān)性最高為 darkolivegreen4 模塊，這個模塊共包含了 1 807 個基因。

最終共獲得348 個銀屑病高度相關(guān)DEGs。GO富集分析結(jié)果顯示，在生物過程方面銀屑病高度相關(guān)DEGs 主要富集在線粒體翻譯延伸、線粒體翻譯終止、對其他生物的反應、翻譯終止、對外部生物刺激的反應；在分子功能方面主要富集在線粒體內(nèi)膜、細胞器核糖體、線粒體核糖體、細胞器內(nèi)膜、線粒體蛋白復合體；在細胞組分方面主要富集于核糖體的結(jié)構(gòu)組成、內(nèi)肽酶活性、絲氨酸型肽酶活性、絲氨酸型內(nèi)肽酶活性、肽酶活性作用于l -氨基酸多肽等方面。KEGG 富集分析結(jié)果顯示，銀屑病高度相關(guān)DEGs 相關(guān)的富集通路有NF-κB 信號通路、Toll 樣受體信號通路、細胞因子—細胞因子受體的相互作用、P53信號通路、IL-17信號通路等。

最終得到了PCNA、CXCL8、S100A9、CCNB1 四個銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因。 選取 GSE2737 芯片作為驗證集分析結(jié)果顯示，在銀屑病皮損組織和正常皮膚組織中，PCNA、CXCL8、S100A9、CCNB1 表達水平差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），并且在銀屑病患者組織樣本中所有關(guān)鍵基因均明顯上調(diào)（見圖1）。

圖1 GSE2737中銀屑病皮損組織和健康皮膚組織中銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因表達水平的小提琴圖

2.2 銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因與皮損組織免疫浸潤細胞的相關(guān)性 銀屑病患者皮損組織樣本中，CD8+T細胞、輔助性T細胞、未活化的樹突狀細胞平均占比最高，免疫浸潤最明顯?；罨臉渫粻罴毎椭行粤＜毎阢y屑病皮損組織中明顯增高，而幼稚B細胞、活化的NK細胞、單核細胞在銀屑病皮損組織中出現(xiàn)不同程度減少。γ δ T細胞與活化的CD4記憶T細胞之間存在正相關(guān)（r=1.00）；中性粒細胞和活化的NK細胞之間存在負相關(guān)（r=-0.93）。 銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因PCNA 和CCNB1與中性粒細胞和活化的樹突狀細胞均呈正相關(guān)（r分別為0.87、0.83，P均<0.05；r分別為0.86、0.85，P均<0.05），S100A9 和CXCL8 與單核細胞均呈負相關(guān)（r分別為-0.80、-0.78，P均<0.05）。

2.3 對銀屑病有治療潛力的中藥 銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因相對應的中藥見表1，其中出現(xiàn)頻次最高的中藥為厚樸花、大黃。

表1 銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因?qū)闹兴?/p>

3 討論

銀屑病的特點是慢性鱗屑性丘疹斑塊，其皮膚損害可泛發(fā)至全身，并與多種合并癥相關(guān)，如心臟代謝疾病、腦卒中、慢性腎臟疾病、炎癥性關(guān)節(jié)炎、抑郁和淋巴瘤等［7］。 銀屑病病程長、反復發(fā)作，可降低患者的生活質(zhì)量，造成社會和個人的沉重負擔。

本研究從 CIBERSORT 算法著手，篩選銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因，探究銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因與免疫浸潤細胞的關(guān)系，并對銀屑病有治療潛力的中藥進行篩選。在對篩選出的348 個DEG s 進一步分析篩選后，最終得到PCNA、CXCL8、S100A9、CCNB1 這四個銀屑病關(guān)鍵致病基因。PCNA 是一種與 DNA 復制、修復和細胞周期進程有關(guān)的代謝蛋白，在細胞增殖方面發(fā)揮重要作用［8］，反映銀屑病表皮細胞的增殖分化異常情況，可作為評估銀屑病進展的最關(guān)鍵基因之一。CXCL8 即IL-8，是一種重要的促炎因子［9］，參與銀屑病的發(fā)病過程，因此成為銀屑病的潛在治療靶點［10］。它參與調(diào)控疾病角質(zhì)形成細胞增殖、中性粒細胞浸潤和血管生成等。在銀屑病病變的角質(zhì)形成細胞中能夠發(fā)現(xiàn)CXCL8 受體的表達，CXCL8 可通過自分泌的形式來激活角質(zhì)形成細胞，并產(chǎn)生和釋放炎癥介質(zhì)，有助于中性粒細胞遷移到病變部位［11-12］。有研究表明，CXCL8 蛋白水平與 PASI 評分呈正相關(guān)，進一步提示CXCL8 可能與尋常型銀屑病的病情嚴重程度存在緊密聯(lián)系。CXCL8 可能參與著尋常型銀屑病的發(fā)生與發(fā)展，未來可能作為預測銀屑病嚴重程度的有效指標，可為尋常型銀屑病的病情進展及臨床診斷提供有用的參考價值。S100鈣結(jié)合蛋白 A9 （S100A9） 主要在中性粒細胞、單核—巨噬細胞系以及病變的角質(zhì)細胞中表達［13］。S100A9 和 S100A8 形成二聚體之后，能夠結(jié)合靶蛋白、傳遞鈣信號以及調(diào)節(jié)胞質(zhì)中鈣離子的濃度［14］，參與了細胞的增殖分化、炎癥反應、細胞凋亡等過程。在銀屑病易感位點PSORS4 附近發(fā)現(xiàn)了S100A8 以及S100A9基因［15］，在銀屑病發(fā)病的早期階段也觀察到了它們的表達［16］。銀屑病患者的S100A8/A9 血清水平升高，并且升高的S100A8/A9 血清水平與疾病活動有明顯的相關(guān)性，表明這些S100 蛋白是銀屑病的潛在致病因子［17］。銀屑病的病理機制與角質(zhì)形成細胞的細胞周期密切相關(guān)，其中CCNB1 是與細胞周期相關(guān)的基因，有研究［18］顯示 CCNB1、CDC20 在銀屑病的皮損部位高表達，進一步提示CCNB1 可能與尋常型銀屑病的發(fā)生與發(fā)展存在緊密聯(lián)系?？傊?，這些銀屑病發(fā)病關(guān)鍵靶基因可能在調(diào)節(jié)角質(zhì)細胞增殖分化、參與炎癥反應、維持正常的皮膚屏障功能以及調(diào)節(jié)胞質(zhì)中鈣離子的濃度方面發(fā)揮著重要的作用。

從數(shù)據(jù)集的 GSEA 分析結(jié)果中可以看出，其信號通路主要富集在MAPK 通路、NOTCH 通路、mTOR通路、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、醛固酮調(diào)節(jié)鈉重吸收等。在銀屑病發(fā)生發(fā)展過程中，MAPK 信號通路能與多種細胞因子相互影響，發(fā)生一系列復雜的免疫反應。由此可見，MAPK 信號通路有可能是銀屑病發(fā)病的關(guān)鍵通路之一［19］。NOTCH/HES1 信號通路通過調(diào)控 mTORC1 信號通路，促進 IL-17A 的表達，在銀屑病中發(fā)揮促炎作用。KEGG 富集分析顯示多條通路與銀屑病發(fā)病相關(guān)。其中，由于NF -κ B在銀屑病的發(fā)病過程中過度活化［20］，其活性升高后促進角質(zhì)形成細胞分泌大量的促炎因子，而抑制 NF-κ B保護銀屑病角質(zhì)形成細胞的作用［21］。Toll 樣受體家族（TLRs）作為一種重要的模式識別受體（PRR），主要參與細胞固有免疫，識別病原體相關(guān)分子模式并誘導天然免疫應答。研究［22］表明銀屑病的發(fā)病可能與 TLR9 有緊密關(guān)系。p38 MAPK 信號通路能參與以 IL-17 為主導的銀屑病的發(fā)病機制。在人表皮細胞中，p38 MAPK 激活后能增加 IL-6、IL-23 的表達從而特異性促進 IL-17 的分泌［23］，而 IL-17A 又能反向激活 p38 MAPK 信號通路從而使 IL-1、IL-22、IL-6、TNF-α 表達增多［24-25］，IL-17F 可通過激活 p38 MAPK，使 IκBξ 表達量升高，而IκBξ 又是銀屑病相關(guān)基因的關(guān)鍵調(diào)控因子［26］。Th17 細胞分泌 IL-17A以及 IL-17F，IL-17 信號通路的主要靶細胞是角質(zhì)形成細胞、內(nèi)皮細胞和固有免疫細胞，其下游趨化因子和組織重塑因子的上調(diào)，表明 IL-17 信號通路在銀屑病的疾病進展中起到關(guān)鍵的作用。

通過 CIBERSORT 反卷積算法對皮損組織樣本中 22 種免疫細胞進行免疫浸潤分析。從結(jié)果可以看出，輔助性T 細胞、未活化的樹突狀細胞、CD8+T細胞占比最高，并且輔助性T細胞、未活化的樹突狀細胞在病例樣本中也明顯升高。多種免疫細胞在銀屑病病例樣本中占比升高，提示其在銀屑病發(fā)病時的重要意義。樹突狀細胞作為免疫應答啟動的關(guān)鍵細胞，它具有高效攝取、 加工處理和遞呈抗原的功能。未成熟 DC 在炎癥性疾病中數(shù)量極少，具有較強的遷移能力；成熟 DC 能有效激活初始 T 細胞，位于啟動，調(diào)控以及維持免疫應答的中心環(huán)節(jié)［27-28］。銀屑病的發(fā)病離不開免疫和炎癥刺激，而外周血Th1/Th2 平衡失衡和相關(guān)信號通路被激活是推動銀屑病發(fā)展的起始和擴大階段的主要原因［29］。其中Th1 主要分泌 IL-2、 IFN-γ，參與機體的細胞免疫和炎癥反應［30］；而Th2分泌 IL-4、IL-10，參與體液免疫，同時還可抑制炎癥反應［31］。正常情況下，外周血Th1/Th2 的相對平衡發(fā)揮著免疫保護作用，而其失衡則會引起過度炎性反應［32］。免疫細胞相關(guān)性分析顯示，γδT 細胞與活化的CD4 記憶T 細胞之間存在明顯的正相關(guān)性，表明這兩種免疫細胞的協(xié)同作用對銀屑病發(fā)病有重要影響。記憶T細胞區(qū)別于初始T 細胞的重要特征是能夠高效和快速地產(chǎn)生細胞因子，也是CD4+記憶T 細胞發(fā)揮抗感染作用的關(guān)鍵機制。對人類銀屑病進行的研究表明，漿細胞樣樹突狀細胞通過分泌 IFNα 促發(fā)銀屑病，而 IFNα 可促使 γδT 細胞分泌 IFNγ 及銀屑病相關(guān)生長因子 IGF-1。此外，γδT 細胞還能分泌 TNFα、IL-17A［33］等與銀屑病發(fā)展相關(guān)的細胞因子及 IL-8、CCL3、CCL4、CCL5 等趨化炎癥細胞到皮膚局部的炎癥因子，γδT細胞可能在銀屑病的疾病進展中起著關(guān)鍵的作用。由此可以推測，這兩種免疫細胞的協(xié)同作用對銀屑病發(fā)病可能有重要影響，可以對其開展相關(guān)實驗研究進行驗證。銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因PCNA 和CCNB1與中性粒細胞和活化的樹突狀細胞均呈正相關(guān)性，S100A9 和CXCL8 與單核細胞均呈負相關(guān)性。提示銀屑病發(fā)病關(guān)鍵基因與銀屑病的免疫細胞浸潤機制有關(guān)。

在中醫(yī)上，銀屑病屬于中醫(yī)“白疕”、“白殼瘡”、“松皮癬”、“干癬”等范疇，其病因多與血瘀、血燥、血熱、 風邪、濕毒等相關(guān)。中醫(yī)治療多以清熱涼血解毒、養(yǎng)血滋陰潤膚、理氣活血化瘀、清熱利濕通絡(luò)等為法。Coremine Medical 是一個基于文獻的高效、精準數(shù)據(jù)挖掘服務平臺。運用AI自然語言處理技術(shù)，Coremine Medical 對數(shù)據(jù)庫內(nèi)的文獻信息進行分析，實現(xiàn)不同信息關(guān)聯(lián)程度的可視化展示，以協(xié)助生物醫(yī)學研究者進行數(shù)據(jù)相關(guān)性預測。其適用于各種實驗設(shè)計，包括以基因/蛋白，藥物或表型為導向的相關(guān)預測以及實驗結(jié)果的輔助驗證。本研究將篩選出的關(guān)鍵基因映射至 Coremine Medical 在線數(shù)據(jù)庫，得到了相對應的中藥，其中出現(xiàn)頻次最高的中藥為厚樸花、大黃。厚樸花性味功用與厚樸大致相似，但是藥性更為溫和，能行氣宣郁，化濕和胃，理膈寬脘，且無耗氣傷陰之弊。大黃是常用的中藥之一，其具有活血逐瘀、清熱瀉火、通便導瀉等功效。另外，現(xiàn)代醫(yī)學研究［34］顯示，大黃具備抑制胰酶分泌、保護胃腸道黏膜、促進腸道正常蠕動等功效，可以減少腹痛、腹脹等癥狀持續(xù)時間，緩解臨床癥狀。有研究［35］表明，大黃可能通過調(diào)節(jié)體內(nèi) NF-κ B 信號通路，抑制眾多炎癥因子的釋放，減緩機體的炎癥反應從而對銀屑病病程進行干預，但是其具體作用機制仍待挖掘。雖然目前暫未發(fā)現(xiàn)有關(guān)厚樸花治療銀屑病的研究或?qū)嶒?，但本研究對治療銀屑病中藥的篩選結(jié)果提示對厚樸花、大黃可以進行深入的臨床研究。

綜上，銀屑病的4 個關(guān)鍵基因PCNA、CXCL8、S100A9、CCNB1 均與皮損組織免疫浸潤細胞比例存在較強相關(guān)性；對銀屑病具有治療潛力的中藥為厚樸花、大黃。本研究為銀屑病發(fā)病機制和治療用藥的進一步研究提供了新的指導方向。