張慶雪，趙碩，張瑩瑩，高東程，李靖若

1 鄭州大學第三附屬醫(yī)院乳腺外科，鄭州 450052；2 鄭州大學第一附屬醫(yī)院乳腺外科

目前女性乳腺癌已超過肺癌成為2020 年全球發(fā)病率最高的癌癥，發(fā)病人數(shù)占所有新發(fā)癌癥患者的11.7%，同時，死亡人數(shù)占所有癌癥死亡患者的6.9%，是導致全球女性死亡人數(shù)最多的癌癥［1］。隨著手術(shù)、化療、放療、內(nèi)分泌治療、靶向治療以及免疫治療等多種治療策略的快速發(fā)展，女性乳腺癌患者的平均五年生存率達到了91%［2］，但耐藥和復發(fā)轉(zhuǎn)移仍是導致乳腺癌患者預后不良的關(guān)鍵因素［3］。乳腺癌是一種高度異質(zhì)性疾病，根據(jù)雌激素受體、孕激素受體、人類表皮生長因子受體-2（HER-2）及細胞增殖指數(shù)ki-67 的表達水平，可分為Luminal A型、Luminal B 型、HER-2 陽性及三陰性乳腺癌四種類型［4-5］，具有相同臨床分期和病理分型的患者預后也可能存在較大差異［6］。目前，21 基因檢測［7］、70 基因檢測［8］、7 基因乳腺癌指數(shù)［9］、50 基因復發(fā)風險［10］和12 基因檢測［11］等多基因檢測僅適用于激素受體陽性、HER-2陰性的早期乳腺癌患者，臨床暫無用于預測其他類型乳腺癌患者預后的預測模型。因此，迫切需要開發(fā)新的預測方法，為乳腺癌患者的預后預測和個體化抗癌治療提供指導。

銅是所有生物體必需的礦物質(zhì)營養(yǎng)素，與能量代謝、活性氧解毒、鐵攝取和信號傳導等多種生物過程相關(guān)［12］。研究［13］顯示，腫瘤對銅的需求更高，銅通過促進癌細胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移參與多種腫瘤的進展，然而過量的銅可能會導致癌細胞銅死亡［14］。銅死亡是一種由TSVETKOV 等［15］于2022 年發(fā)現(xiàn)的新型調(diào)節(jié)性細胞死亡，不同于凋亡、壞死和鐵死亡等已知細胞死亡形式，它依賴于銅積累和線粒體呼吸。銅與三羧酸循環(huán)的酯?；煞种苯咏Y(jié)合，誘導酯?；鞍踪|(zhì)聚集及鐵硫簇蛋白質(zhì)丟失，從而誘發(fā)蛋白質(zhì)毒性應激導致細胞死亡［15］。因此，誘導癌細胞發(fā)生銅死亡在抗癌治療中具有巨大潛力。長鏈非編碼核糖核酸（lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過 200 個核苷酸的線性非編碼RNA［16］，通過在轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后及表觀遺傳學水平調(diào)節(jié)基因的表達，參與細胞增殖、分化、干細胞重編程及腫瘤發(fā)生或耐藥等多種病理生理過程［17］。RNA 療法可以通過增加或沉默特定蛋白質(zhì)的表達調(diào)節(jié)靶細胞，在乳腺癌治療中具有高選擇性和低脫靶風險［18］。目前，銅死亡相關(guān)lncRNA在乳腺癌中的研究尚不全面，篩選銅死亡相關(guān)lncRNA，并構(gòu)建乳腺癌預后預測模型有助于實現(xiàn)精準抗癌治療。本研究篩選出與乳腺癌預后關(guān)系密切的銅死亡相關(guān)lncRNA，基于銅死亡相關(guān)lncRNAs 構(gòu)建了乳腺癌預后預測模型，并驗證了其效能。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)及其來源 從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載女性乳腺癌患者的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床信息，截至2023 年2月17 日。共下載1 105 例乳腺癌樣本和112 例正常乳腺樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。使用Perl 軟件（版本5.32.1）對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)整理、ID 轉(zhuǎn)換，并分離mRNA 和lncRNA 表達譜，獲得19 962 個mRNAs和16 901 個lncRNAs。從已發(fā)表文獻中獲取銅死亡相關(guān)基因［15，19-22］，共19 個，分別為NFE2L2、NLRP3、ATP7B、ATP7A、SLC31A1、FDX1、LIAS、LIPT1、LIPT 2、DLD、DLAT、PDHA1、PDHB、MTF1、GLS、CDKN2A、DBT、GCSH、DLST。TCGA 為公開可用的數(shù)據(jù)庫，本研究遵循TCGA 數(shù)據(jù)庫的訪問政策和出版指南，故無需倫理委員會批準。

1.2 乳腺癌預后關(guān)系密切的銅死亡相關(guān)lncRNA篩選及預后預測模型構(gòu)建 ①乳腺癌組織中銅死亡相關(guān)lncRNA 篩選：使用R 軟件（版本4.1.2）的R 包“l(fā)imma”對mRNA 表達譜和19 個銅死亡相關(guān)基因取交集，獲取乳腺癌組織中表達的銅死亡相關(guān)基因。進一步采用Pearson 相關(guān)性分析乳腺癌組織中表達的銅死亡相關(guān)基因與lncRNA 的相關(guān)性，以|r|>0.4和P<0.001為標準篩選出乳腺癌組織中的銅死亡相關(guān)lncRNA，并使用R 包“dplyr”、“ggalluvial”和“ggplot2”繪制?；鶊D。②乳腺癌組織中與預后關(guān)系密切的銅死亡相關(guān)lncRNA 篩選：選擇銅死亡相關(guān)lncRNA 表達譜與臨床資料均完整的患者885例（整體組），用R 包“caret”的“createDataPartition”函數(shù)按照1∶1 的比例將整體組患者隨機分為訓練組443 例與驗證組442 例，并使用χ2檢驗分析組間臨床資料（包括生存時間、生存狀態(tài)、年齡、臨床分期及T、N、M 分期）差異。在訓練組中，使用R 包“survival”進行單因素Cox 回歸分析初步篩選與乳腺癌患者預后相關(guān)的銅死亡相關(guān)lncRNA，篩選標準為P<0.05。為避免lncRNA 的過度擬合，使用R 包“survival”和“glmnet”進行最小絕對收縮和選擇算子（LASSO）回歸進一步篩選預后關(guān)系密切的銅死亡相關(guān)lncRNA。隨后，使用R 包“survival”和“survminer”進行多因素Cox 回歸分析。③乳腺癌預后預測模型的構(gòu)建：根據(jù)赤池信息準則（AIC）確定最佳預后預測模型（AIC值最小）。模型公式如下：

其中n表示納入模型的lncRNA 數(shù)量，coefi為各lncRNA的回歸系數(shù)，Xi為各lncRNA的表達量。

1.3 乳腺癌預后預測模型的效能驗證 根據(jù)乳腺癌的預后預測模型，計算訓練組患者的風險評分。以訓練組患者的中位風險評分作為截斷值，將訓練組、驗證組和整體組的患者分別劃分為高風險組和低風險組。 乳腺癌預后預測模型的區(qū)分能力驗證：分別在訓練組、驗證組和整體組中使用R 包“survival”和“survminer”進行生存分析，繪制生存曲線，比較高、低風險組患者的生存率；將整體組患者按不同臨床特征分為亞組，使用R 包“survival”和“survminer”繪制生存曲線并比較不同亞組中高、低風險患者的生存率差異。乳腺癌預后預測模型的準確性驗證：使用R 包“timeROC”繪制ROC，并計算曲線下面積（AUC）評估預后預測模型對乳腺癌患者1、3、5 年生存率的預測效能。在整體組中，使用R 包“timeROC”、“rms”和“pec”繪制風險評分及臨床特征的多指標ROC 及一致性指數(shù)曲線比較不同指標的預測性能。乳腺癌預后預測模型的獨立性驗證：使用R包“survival”對風險評分及各臨床特征進行單因素及多因素 Cox 回歸分析評估風險評分是否是乳腺癌患者預后的獨立影響因素。臨床實用性驗證： 高、低風險組間差異表達基因本體功能及信號通路富集分析；高、低風險組患者免疫浸潤分析。

高、低風險組間差異表達基因本體功能及信號通路富集分析：使用R 包“l(fā)imma”篩選高、低風險組間差異表達的基因，篩選標準為|log2差異倍數(shù)|>1，錯誤發(fā)現(xiàn)率<0.05。使用R 包“clusterProfiler”、“org.Hs.eg.db”和“enrichplot”進行京都基因和基因組百科全書（KEGG）通路富集分析識別差異表達的基因主要參與的信號通路，進行基因本體功能（GO）分析差異表達的基因主要涉及的生物學過程、細胞成分和分子功能，P<0.05和校正后的P值<1被認為顯著富集。使用R包“ggplot2”將富集結(jié)果可視化。

高、低風險組患者免疫浸潤分析：使用R 包“estimate”進行ESTIMATE 算法計算乳腺癌患者的免疫細胞、基質(zhì)細胞、腫瘤純度及綜合評分［23］，使用R 包“l(fā)imma”和“ggpubr” 進行Wilcoxon 檢驗比較高、低風險組間差異。對患者的表達譜進行歸一化校正，利用CIBERSORT 算法計算兩組患者免疫細胞的相對浸潤豐度［24］，采用Wilcoxon檢驗比較組間差異。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌預后預測模型 Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示乳腺癌組織中銅死亡相關(guān)lncRNAs 719 個。訓練組（n=443）和驗證組（n=442）臨床特征比較，P均>0.05，見表1，說明兩組基線資料均衡可比。在訓練組中，單因素Cox 回歸分析初步篩選出17 個與乳腺癌患者預后相關(guān)的銅死亡相關(guān)lncRNAs，包括7個保護lncRNAs［風險比（HR）<1］和10 個危險lncRNAs（HR>1）；LASSO回歸分析進一步確定了14個與乳腺癌預后關(guān)系密切的銅死亡相關(guān)lncRNAs。采用多因素Cox 回歸分析最后構(gòu)建了由10 個lncRNAs組成的乳腺癌預后預測模型，模型公式如下：風險評分=（-1.129 216 501 573 150×AKT3.IT1 表達量） +（-1.166 095 685 256 72×AL137847.1 表 達 量） +（0.729 804 497 137 164×LINC02043 表 達 量） +（0.745 696 645 441 295×AL683813.1 表 達 量） +（-0.903 562 388 041 113×AL807757.2 表達量） +（1.040 608 675 397 110×AC073127.1 表 達 量） +（2.160 133 554 898 460×MFF.DT 表 達 量） +（1.417 144 256 517 410×AC091588.1 表 達 量） +（-0.764 700 719 748 750×AC079766.1 表達量） +（-3.608 177 447 126 010×AL451123.1 表達量）。

表1 各組臨床病理特征

2.2 乳腺癌預后預測模型的效能驗證結(jié)果 根據(jù)乳腺癌預后預測模型公式，訓練組患者的中位風險評分為1.066，根據(jù)中位風險評分將患者分為高風險組和低風險組。生存曲線顯示在訓練組、驗證組和整體組中，高、低風險組患者的總體生存率差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.001），且高風險組患者預后較差，見圖1~3。亞組分析顯示不同年齡、臨床分期、T、N 和M0 分期亞組中高風險組患者的生存率均低于低風險組（T3-4 亞組P=0.003，其余P均<0.001）（圖4、5、6、7 及圖8 的M0 分期），M1 分期亞組中高、低風險組患者的生存率差異無統(tǒng)計學意義（P=0.139）（圖8）。

圖1 訓練組高、低風險組患者總生存率的生存曲線

圖2 驗證組高、低風險組患者的生存曲線

圖3 整體組高、低風險組患者的生存曲線

圖4 不同年齡亞組中高低風險組的生存曲線

圖5 不同臨床分期亞組中高低風險組的生存曲線

圖6 不同T分期亞組中高低風險組的生存曲線

圖7 不同N分期亞組中高低風險組的生存曲線

圖8 不同M分期亞組的生存曲線

訓練組中，乳腺癌預后預測模型預測乳腺癌患者1、3、5 年生存率的AUC 分別為0.848、0.783、0.793，驗證組中分別為0.764、0.697、0.675，在整體組中分別為0.807、0.739、0.709。在整體組中，多指標ROC（圖9）及一致性指數(shù)曲線（圖10）顯示風險評分的AUC 值和一致性指數(shù)均高于其他臨床特征。

圖9 整體組風險評分及各臨床特征的多指標預測乳腺癌患者生存率的ROC

圖10 整體組風險評分及各臨床特征的一致性指數(shù)曲線

單因素COX 回歸分析顯示，風險評分與乳腺癌患 者的預 后顯著 相關(guān)［（HR（95%CI）為1.063（1.045～1.081），P<0.001］；多因素Cox回歸分析顯示，風險評分是乳腺癌患者的獨立預后影響因素［（HR（95%CI）為1.065（1.047～1.082），P<0.001］。

高、低風險組間差異表達基因129 個。GO 分析顯示，差異表達基因富集于銨離子代謝過程、體液免疫反應和內(nèi)分泌激素分泌等生物過程，血液微粒子、角蛋白絲和中間絲等細胞成分，以及氨基酸結(jié)合、免疫球蛋白結(jié)合和ATP 酶-偶聯(lián)的無機陰離子跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活動等分子功能。KEGG 分析顯示，這些差異表達基因顯著富集于B 細胞受體信號通路、色氨酸代謝、PI3K-Akt 信號通路和鉑類耐藥性等通路。

免疫細胞評分、基質(zhì)細胞評分、腫瘤純度及綜合評分的中位數(shù)在高風險組分別為411.670、518.220、969.350、0.734，在低風險組中分別為594.006、757.348、1394.424、0.690。與低風險組比較，高風險組免疫細胞、基質(zhì)細胞及綜合評分低，腫瘤純度高（P<0.001）。低風險組中幼稚B 細胞、靜息自然殺傷細胞、活化自然殺傷細胞和靜息肥大細胞浸潤豐度較高，高風險組中M0 和M2 巨噬細胞浸潤豐度較高（P均<0.05），見表2。

表2 免疫細胞相對浸潤豐度

3 討論

乳腺癌是高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，在女性癌癥中占新診斷患者的31%，占死亡患者的15%，是導致20～59 歲女性死亡的首要原因［25］。耐藥和復發(fā)轉(zhuǎn)移是導致患者預后不良的關(guān)鍵因素。腫瘤的異質(zhì)性導致具有相同臨床病理特征的患者預后亦可能存在較大差異，迫切需要探索有效的乳腺癌預后預測模型來準確預測患者預后，以利于進一步的臨床決策。銅死亡是一種由銅觸發(fā)的線粒體細胞死亡方式［14］。研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌［26］、黑色素瘤［27］和肝細胞癌［28］等高線粒體代謝的腫瘤可能對銅離子載體誘導的銅死亡更敏感［29］。雙硫侖已被證實能夠作為銅離子載體誘導銅死亡發(fā)生［15］，研究［30］表明其在治療乳腺癌時還可以降低腫瘤抑制基因PTEN 的表達并激活乳腺癌組織中Akt 信號傳導，聯(lián)合應用PI3K 抑制劑可以顯著抑制乳腺癌細胞的生長。本研究基于銅死亡相關(guān)lncRNA構(gòu)建乳腺癌預后預測模型，旨在為乳腺癌的預后評估提供新的視角。

本研究從TCGA 數(shù)據(jù)庫中獲得719 個銅死亡相關(guān)lncRNAs，通過多因素Cox 回歸將10 個lncRNAs納入預后預測模型，LINC02043、AL683813.1、AC073127.1，MFF.DT 和AC091588.1 是 危 險lncRNAs，AKT3.IT1、AL137847.1、AL807757.2、AC079766.1 和AL451123.1 是 保 護lncRNAs，這 些lncRNAs 可能是乳腺癌的生物標志物及潛在治療靶點。據(jù)研究［31］報道，LINC02043 是酒精相關(guān)性肝細胞癌的危險lncRNA，與其他lncRNAs 相結(jié)合可以預測酒精相關(guān)性肝細胞癌的無復發(fā)生存期。本研究發(fā)現(xiàn)LINC02043 亦是乳腺癌的危險lncRNA，與患者的預后不良相關(guān)。YU 等［32］研究提示，MFF.DT 作為危險lncRNA 與其他幾種銅死亡相關(guān)lncRNAs 聯(lián)合構(gòu)成乳腺癌的獨立預后因素，本研究結(jié)果與之相符。然而暫時沒有關(guān)于其余8 種lncRNAs 的研究報道，它們在乳腺癌中的生物學機制未來有必要通過進一步的體內(nèi)外實驗來探索，且有望成為乳腺癌的潛在治療靶點。

根據(jù)風險評分將乳腺癌患者分為高風險組和低風險組，隨著風險評分升高患者死亡率增加。生存曲線顯示無論是訓練組、驗證組還是整體組，高風險組患者的生存率均更低，表明預后預測模型對不同風險的患者有較好的區(qū)分能力。ROC 顯示風險評分預測乳腺癌患者1 年、3 年和5 年生存率的AUC 值較高，表明預后預測模型具有較強的預測效能，且多指標ROC 及一致性指數(shù)曲線表明模型的預測能力和臨床應用效能優(yōu)于其他臨床特征。獨立預后分析表明，風險評分是乳腺癌的獨立預后因素。亞組生存分析表明，該預后預測模型適用于不同臨床階段的乳腺癌患者。由于樣本中M1 分期的患者人數(shù)較少，高、低風險組生存率的差異無統(tǒng)計學意義，但結(jié)果仍表現(xiàn)出高風險組患者總生存率較低的趨勢。

為了進一步驗證預后預測模型的效能，我們探索了高、低風險組患者之間的生物學功能差異，對兩組間差異表達的基因進行了功能富集分析。KEGG分析表明差異表達的基因主要富集于B細胞受體信號通路、PI3K-Akt 信號通路和鉑類耐藥性等通路。GO 分析表明差異表達的基因富集于體液免疫反應等生物過程。GARAUD 等［33］發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤性B 細胞可以產(chǎn)生持續(xù)的體液免疫反應，并有助于在乳腺癌腫瘤部位產(chǎn)生有效的抗腫瘤免疫反應。HARRIS等［34］在三陰性乳腺癌中發(fā)現(xiàn)，B 淋巴細胞具有IgG偏向的克隆擴張，并與良好的預后相關(guān)，這可能是抗原驅(qū)動的體液免疫反應。PI3K-Akt 信號通路在細胞代謝、細胞生長增殖、細胞凋亡和血管生成等基本細胞活動中起主要作用［35］，大約70%的乳腺癌患者攜帶PI3K/AKT 突變［36］，從而導致該通路的過度激活，促進腫瘤細胞生長、增殖和血管生成，是導致乳腺癌的內(nèi)分泌治療、靶向治療和化療耐藥性的重要機制之一［37-38］。因此，高、低風險組間的預后差異可能與乳腺癌患者的免疫狀態(tài)及化療耐藥性相關(guān)。

腫瘤微環(huán)境包括腫瘤中的所有非癌宿主細胞（如免疫細胞和基質(zhì)細胞）以及非細胞成分［39］，不同浸潤性免疫細胞具有抗腫瘤或促腫瘤的功能，隨著免疫逃逸的發(fā)生，免疫療法成為癌癥治療的新策略［40］。ESTIMATE 算法顯示低風險組的基質(zhì)評分、免疫評分和綜合評分高，腫瘤純度低，表明低風險組患者的免疫細胞浸潤程度更高。腫瘤相關(guān)巨噬細胞可以分化為兩個亞型，M1型巨噬細胞主要通過介導ROS誘導的組織損傷發(fā)揮抗腫瘤作用，而M2型巨噬細胞通過激活血管生成、免疫抑制及細胞外基質(zhì)重塑表現(xiàn)出促腫瘤活性［41-42］。免疫浸潤分析發(fā)現(xiàn)，高風險組患者M2 型巨噬細胞浸潤豐度較高，可能通過M2 型巨噬細胞的促腫瘤作用導致癌細胞發(fā)生免疫逃逸而促進乳腺癌進展。因此，高、低風險組患者之間可能存在免疫狀態(tài)差異，且低風險組患者的免疫原性更高，更可能從免疫治療中獲益。本研究構(gòu)建的預后預測模型能夠較為準確地反映乳腺癌抗腫瘤免疫狀態(tài)，為評估乳腺癌患者對免疫治療敏感性提供參考。

綜上所述，本研究基于TCGA 數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了由10 個銅死亡相關(guān)lncRNAs 構(gòu)成的乳腺癌預后預測模型，該模型具有良好的準確性、區(qū)分能力、獨立性，不僅可以有效地預測乳腺癌患者的預后，還可以評估患者的免疫浸潤狀態(tài)，反映免疫治療敏感性，為實現(xiàn)個體化抗癌治療提供參考。本研究也存在一定的局限性。首先，由于其他數(shù)據(jù)庫中缺乏完整的lncRNA 表達譜或臨床信息，本研究采用了內(nèi)部驗證的方法，未來仍有必要基于獨立的外部數(shù)據(jù)集來驗證乳腺癌預后預測模型的有效性。此外，本研究在生物信息學層面分析了銅死亡相關(guān)lncRNAs 對乳腺癌患者預后的影響，未來需要通過體內(nèi)外實驗來進一步探索銅死亡相關(guān)lncRNAs 在乳腺癌中的病理生理功能。