葉佳蓓，程建業(yè)，高雪亮，王凱，李普陽，王召，趙亞鵬*

1 河北省中醫(yī)院針灸科，石家莊 050011；2 河北中醫(yī)學院 河北省心腦血管病中醫(yī)藥防治研究重點實驗室；3 河北省中醫(yī)院外四科

缺血性卒中在我國的發(fā)病率和患病率呈逐年上升趨勢［1］，其中腦缺血再灌注（CI/R）損傷是影響缺血性卒中預后的重要病理生理過程，其導致的神經(jīng)損傷甚至有可能重于腦缺血造成的損傷［2］。對神經(jīng)細胞進行缺氧缺糖/復氧復糖（OGD/R）處理是體外模擬CI/R 損傷較為合理的方式［3-5］，以此來進行缺血性卒中離體層面的藥物及機制研究。出自《醫(yī)林改錯》的補陽還五湯是治療缺血性中風病的經(jīng)典復方，主要包括黃芪、赤芍、當歸、紅花、桃仁、川芎、地龍，其可通過保護線粒體、調(diào)控神經(jīng)元自噬與凋亡、促進神經(jīng)修復及血管再生等機制發(fā)揮神經(jīng)保護作用［6-8］，我們也通過在體實驗證實這一點［9］。本研究中，我們將通過大鼠星形膠質(zhì)細胞系CTX-TNA2 建立OGD/R 模型模擬CI/R 損傷，探究離體情況下補陽還五湯對CI/R損傷星形膠質(zhì)細胞的修復作用。

1 材料與方法

1.1 材料 細胞：CTX-TNA2 細胞即大鼠腦Ⅰ型星形膠質(zhì)細胞，購自賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司（iCell Bioscience Inc， Shanghai）。試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素—鏈霉素（10，000 U/mL）、胰蛋白酶-EDTA（0.25%）、胎牛血清、無糖培養(yǎng)基、PBS緩沖液均購自GIBICO 公司，MTS 試劑盒購自Promega公司，LDH 試劑盒購自南京建成生物工程研究所。儀器： 3111 型二氧化碳培養(yǎng)箱、3131 型三氣培養(yǎng)箱和Varioskan LUX 型多功能微孔板讀數(shù)儀購自Thermo Fisher Scientific 公司，SW-CJ-ID 型超凈工作臺購自蘇州凈化公司，Primovert 型倒置相差顯微鏡購自Carl Zeiss 公司，5702 型低溫離心機購自Eppendorf公司，0.22 μm濾膜購自Milipore公司。

1.2 補陽還五湯含藥血清和空白血清的制備 取30 只體質(zhì)量為230～240 g 的SD 雄性大鼠，由北京維通利華實驗動物科技有限公司提供，許可證號為SCXK（京）2016–0011，且動物實驗通過河北中醫(yī)學院倫理委員會審核批準（DWLL2020075），其中20只大鼠予補陽還五湯凍干粉水溶液灌胃，補陽還五湯凍干粉3.02 g /（kg· d）溶于2 mL/只的0.9%氯化鈉溶液中形成水溶液，另外10 只大鼠予2 mL/只的0.9%氯化鈉溶液灌胃，大鼠均連續(xù)灌胃7 d，最后1次灌胃后禁食水2 h，在無菌環(huán)境中進行腹主動脈取血并收集到促凝管中，全血常溫靜置15 min、4 ℃，2 500 r/min離心30 min，吸取上清，收集到一起離心混勻，56 ℃水浴30 min 滅活補體，經(jīng)0.22 μm 過濾除菌后存于-80 ℃冰箱。

1.3 CTX-TNA2 細胞分組、OGD/R 處理、補陽還五湯含藥血清加入 CTX-TNA2 細胞以完全培養(yǎng)基（含有10% 胎牛血清和1% 青鏈霉素混合液的DMEM 高糖培養(yǎng)基）、置于37 ℃ 74% N2+ 5% CO2+21% O2的細胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每24～32小時當細胞匯合度達到70%～80%時進行1∶2或1∶3傳代。將復蘇后傳代3～4 次且處于對數(shù)生長期的CTXTNA2 細胞分為觀察組、血清組、模型組、正常組。其中正常組不做任何處理，常規(guī)培養(yǎng)；模型組棄去原培養(yǎng)基，用室溫預熱的PBS 潤洗細胞，吸盡PBS，加入不含糖、含鈣鎂的無糖培養(yǎng)基，并迅速置于37 ℃，含94% N2+ 5% CO2+ 1% O2的三氣培養(yǎng)箱中6 h 進行缺氧缺糖，然后把無糖培養(yǎng)基全部更換為完全培養(yǎng)基，重新置于37 ℃ 74% N2+ 5% CO2+ 21% O2環(huán)境中進行24 h 復氧復糖；觀察組和血清組細胞用上述方法進行6 h缺氧缺糖處理，然后分別用含0.5%、1%、3%、5%和10%補陽還五湯含藥血清（觀察1、2、3、4、5組）或0.5%、1%、3%、5%和10%空白血清（血清1、2、3、4、5 組）的完全培養(yǎng)基進行24 h 復氧復糖處理。

1.4 細胞存活率的檢測 采用MTS 法。將對數(shù)生長期的上述各組細胞接種于96 孔板中，每孔加入20 μL CellTiter 96水溶液試劑，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育50 min。在多功能微孔板讀數(shù)儀測定各孔490 nm 處的吸光度值。細胞存活率=（實驗組吸光度值-空白組吸光度值）/（對照組吸光度值-空白組吸光度值）。

1.5 細胞乳酸脫氫酶漏出率的檢測 采用LDH法。將對數(shù)生長期的上述各組細胞接種于96 孔板中，吸取各細胞孔的上清液加入到另一新的96孔板中加入LDH 試劑，按說明書進行孵育，在多功能微孔板讀數(shù)儀中測450 nm 吸光度， 此為細胞上清中 LDH 釋放量；然后向原培養(yǎng)板中細胞加入1%Triton X-100，室溫反應20 min 后取細胞反應液及 LDH 工作液混勻，繼續(xù)在多功能微孔板讀數(shù)儀中測450 nm 吸光度，此為細胞破膜液 LDH 釋放量。LDH 漏出率（%）=上清 LDH 釋放量/（上清 LDH釋放量 + 細胞破膜液 LDH釋放量）×100%。

1.6 細胞形態(tài)和狀態(tài)的觀察 將對數(shù)生長期的上述各組細胞置于倒置相差顯微鏡下觀察其胞體狀態(tài)、突起形態(tài)及胞間連接情況，每組細胞采集3個視野的圖像留存。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以xˉ ± s 表示，滿足正態(tài)性和方差齊性檢驗者，多樣本比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），兩兩比較采用Tukey 法；不滿足正態(tài)性和方差齊性檢驗者，采用多個獨立樣本的非參數(shù)秩和檢驗（Kruskal-WallisHTest）。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細胞存活率比較 觀察1、2、3、4、5 組細胞 存 活 率 分 別 為92.90% ± 5.77%、94.00% ±12.43%、98.80% ± 6.55%、101.50% ± 0.61%、94.40% ± 19.75%，血清1、2、3、4、5組細胞存活率分別為88.85% ± 0.06%、92.64% ± 4.43%、90.15% ±2.44%、82.98% ± 16.48%、86.75% ± 12.41%，模型組細胞存活率為79.25% ± 2.15%，

正常組細胞存活率為141.20% ± 4.78%。與正常組相比，模型組細胞存活率減低（P<0.01）。觀察3、4 組細胞存活率升高（P均<0.01）。與血清4組相比，觀察4組細胞存活率更高（P<0.01）。

2.2 各組乳酸脫氫酶漏出率比較 觀察1、2、3、4、5 組細胞乳酸脫氫酶漏出率分別為26.06% ±3.31%、26.58% ± 2.94%、26.74% ± 2.67%、20.99% ± 2.48%、31.56% ± 2.42%，血清1、2、3、4、5 組細胞乳酸脫氫酶漏出率分別為25.31% ±3.48%、26.31% ± 2.26%、27.06% ± 1.26%、27.56% ± 1.62%、29.31% ± 2.97%，模型組乳酸脫氫酶漏出率為29.62% ± 0.91%，正常組乳酸脫氫酶漏出率為0。與正常組相比，模型組細胞乳酸脫氫酶漏出率增高（P<0.01）；與模型組相比，觀察組細胞乳酸脫氫酶漏出率降低（P<0.01）；與血清4 組比較，觀察4組乳酸脫氫酶漏出率低（P<0.05）。

2.3 各組細胞形態(tài)比較 由上述結(jié)果可知5%補陽還五湯含藥血清處理可對OGD/R 損傷后的細胞產(chǎn)生一定的修復作用，因此倒置相差顯微鏡重點觀察5%的補陽還五湯含藥血清及5%的空白血清對OGD/RCTX-TNA2細胞的影響。鏡下觀察發(fā)現(xiàn)正常組細胞貼壁情況良好，細胞呈多角形、形態(tài)良好、胞膜光滑、胞體清晰，細胞排列較密集，細胞之間連接緊密；模型組細胞較正常組損傷嚴重，細胞胞體腫脹且狀態(tài)不佳、突起嚴重萎縮變形、胞質(zhì)分泌的顆粒樣物質(zhì)增多，細胞間連接斷裂嚴重甚至消失。經(jīng)過5%的補陽還五湯含藥血清和空白血清干預后，細胞胞體形態(tài)較模型組有所恢復，胞質(zhì)分泌顆粒減少，胞間突起均較模型組有所增加。其中，與5%空白血清相比，5%補陽還五湯含藥血清干預后細胞狀態(tài)的好轉(zhuǎn)情況更為明顯，胞內(nèi)結(jié)構(gòu)更為清晰、顆粒明顯減少、突起萎縮及胞間連接顯著好轉(zhuǎn)，見圖1。

圖1 CTX-TNA2細胞形態(tài)（×200）

3 討論

目前，已有大量研究從在體實驗角度發(fā)現(xiàn)補陽還五湯能夠減輕CI/R 損傷［8，10-11］，其中星形膠質(zhì)細胞可通過降低其興奮性氨基酸毒性、減輕炎癥反應和促進神經(jīng)修復等機制參與此過程。因此，本研究選擇從離體層面重點探討補陽還五湯對星形膠質(zhì)細胞的作用，研究對象選取大鼠星形膠質(zhì)細胞系即CTX-TNA2細胞。

中藥及復方的離體實驗研究主要有以下三種藥物干預方式：中藥提取物直接添加、含藥血清添加和含藥血漿添加。單味中藥的有效單體成分多直接添加到細胞培養(yǎng)體系中，而中藥復方若采取直接接觸細胞的方式，則會因為本身含有的雜質(zhì)及滲透壓、酸堿度、鞣質(zhì)成分、無機鹽離子等非特異性理化因素影響到最終實驗結(jié)果。本研究中使用的補陽還五湯通常是需要口服并經(jīng)吸收、代謝而起效，且鑒于含藥血清技術(shù)較為成熟、應用廣泛，故采用補陽還五湯含藥血清作為離體實驗的干預方式。

血清藥理學是日本學者田代真一在20 世紀80年代提出的一研究中藥復方的體外實驗方法，經(jīng)過多年的發(fā)展，現(xiàn)已成為較為科學的、研究中藥藥效及作用機制和物質(zhì)基礎(chǔ)的方法。血清藥理學是指將單味中藥或中藥復方通過給動物灌胃一定時間后收集動物體內(nèi)血清即含藥血清，直接加入到離體反應體系中進行藥效評價及機制研究。影響含藥血清藥效以及最終實驗結(jié)果的因素有很多，包括供體實驗動物選擇、含藥血清的給藥劑量和方案、采血時間、血清滅活與保存以及對照設(shè)計等方面。本研究采用與CTX-TNA2 細胞同種屬的SD 大鼠作為供體實驗動物來制備含藥血清，以此來縮小動物血清和動物細胞之間的差異。在給藥劑量方面，為保證動物連續(xù)灌胃給藥的一致性，課題組前期將補陽還五湯水煎液統(tǒng)一制成凍干粉，經(jīng)臨床用藥量、動物等效劑量系數(shù)（按體表面積）和凍干粉得粉率換算后確定3.02 g/（kg·d）為SD 大鼠給藥劑量、2 mL 為大鼠灌胃體積。同時有研究［12］表明補陽還五湯的含藥血清無明顯的量效依存關(guān)系，應以臨床等效劑量為基準。在給藥方案和采血方案上，根據(jù)大量文獻和本課題組前期研究，我們對大鼠進行連續(xù)7 d灌胃和最后一次灌胃后空腹2 h采血，以此達到含藥血清中血藥濃度的穩(wěn)定。在血清滅活方面，為減少血清中多種酶、抗體、補體等生物活性物質(zhì)對實驗結(jié)果的影響，本研究選擇同時滅活處理含藥血清和空白血清，滅活并不影響細胞生長，這樣更加突出含藥血清中補陽還五湯的作用。在對照設(shè)計方面，本研究全程選擇經(jīng)相同灌胃和采血處理后得到的空白血清作為對照，使含藥血清組的結(jié)果更具可比性。另外，對于離體反應體系中含藥血清的添加方式，我們將含藥血清視為一種外來添加物，選擇含藥血清和常規(guī)細胞培養(yǎng)血清并存的方法，即在復氧復糖10%胎牛血清基礎(chǔ)上額外添加不同體積分數(shù)的含藥血清，雖然增加了細胞復氧復糖時的總血清含量，但是這種方式穩(wěn)定了細胞狀態(tài)，保證了所有細胞反應體系的一致性，還能更好地模擬在體實驗中的干預方式。

細胞存活率反映外源添加物質(zhì)對細胞活力和健康程度的影響，乳酸脫氫酶漏出率反映外源添加物質(zhì)對細胞產(chǎn)生的毒性作用，以此來發(fā)現(xiàn)補陽還五湯含藥血清抗CTX-TNA2 細胞OGD/R 損傷的最佳參考濃度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在完全培養(yǎng)基中加入5%補陽還五湯含藥血清可顯著提高OGD/R 損傷的CTXTNA2 細胞存活率并降低其乳酸脫氫酶漏出率，而且優(yōu)于同濃度的空白血清。然后通過倒置相差顯微鏡觀察正常組、模型組、觀察組和血清組的細胞胞體及突起情況時，發(fā)現(xiàn)5%補陽還五湯含藥血清處理的細胞在OGD/R 損傷后恢復較好。因此，5%可作補陽還五湯含藥血清減輕CTX-TNA2 細胞OGD/R損傷的參考濃度。

綜上所述，本研究通過離體實驗探究了補陽還五湯對大鼠CTX-TNA2細胞的保護作用，發(fā)現(xiàn)5%補陽還五湯含藥血清可修復CTX-TNA2 細胞OGD/R損傷。在此基礎(chǔ)上我們將對補陽還五湯離體層面的神經(jīng)保護機制進行深入研究，并在中藥復方血清藥理學應用上進行探索。