周改玲,喬宏興

(1.河南省商水縣動物衛(wèi)生監(jiān)督所,河南 商水 466199;2.河南牧業(yè)經濟學院 動物醫(yī)藥學院,河南 鄭州 450046)

糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)又稱糞鏈球菌(Streptococcusfaecalis),屬于革蘭氏陽性兼性厭氧球菌,能長期寄生于動物、食品、植物、水等各種環(huán)境[1],是人和動物腸道內的正常菌群,但并不是所有的糞腸球菌都為有益菌,一部分糞腸球菌屬于條件致病菌,主要由其毒力因子引起。近年來,由糞腸球菌引起的人及動物感染、死亡的病例增多[2],如引起人傳染性心內膜炎、雞敗血癥、公豬睪丸炎、家兔腹瀉等,可在人與動物之間水平傳播[3-5]。沙門氏菌病(Salmonellosis)又稱沙門氏菌食物中毒、沙門氏菌性小腸結腸炎等,是由沙門氏菌感染引起的人和各種動物疾病的總稱。人感染沙門氏菌臨床上主要侵入血液循環(huán)及消化道引起傷寒以及急性胃腸炎[6]。動物沙門氏菌感染主要表現(xiàn)為敗血癥、腸炎和慢性腸炎等[7]。

2021年8月份河南省周口市某鴨場番鴨陸續(xù)發(fā)病,臨床主要表現(xiàn)為精神沉郁、縮脖、采食減少、拉稀等癥狀,死亡率達20%。本試驗從發(fā)病死亡番鴨組織中分離出菌株并進行分子生物學鑒定和耐藥性分析,以期為鴨源細菌病的預防和治療提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 病料

無菌采集河南省周口市某鴨場死亡的成年番鴨病變肝臟、脾臟組織備用。

1.2 主要試劑

血瓊脂平板、SS瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、細菌藥敏片均購自杭州微生物試劑有限公司;DL2000 DNA Marker、2×Es Taq Master Mix購自康為世紀生物公司;瓊脂糖購自HydraGene公司;Gold View I型核酸染色劑購自北京索萊寶公司。

1.3 細菌分離培養(yǎng)與革蘭氏染色

用接種環(huán)挑取病變組織接種于鮮血瓊脂平板和SS瓊脂培養(yǎng)平板,37 ℃培養(yǎng)24 h,挑取單菌落進行革蘭氏染色。

1.4 分離菌16S rRNA基因序列分析

鏡檢后的單個菌落進行純化培養(yǎng),送上海派諾森基因科技有限公司進行16S rRNA測序,測序結果在GenBank中進行BLAST比對,將與測序菌同源性大于等于99%的菌及幾種常見菌16S rRNA序列利用MEGA 6.06軟件構建系統(tǒng)進化樹及核苷酸同源性分析。

1.5 致病性試驗

參考文獻[8]將培養(yǎng)好的2種菌液通過平板計數法分別將濃度調整為1×108CFU/mL。試驗設1個對照組和3個試驗組,每組10只小鼠,對照組腹腔注射0.1 mL無菌液體培養(yǎng)基,試驗1組注射0.1 mL菌株Ⅰ菌液,試驗2組注射0.1 mL菌株Ⅱ菌液,試驗3組腹腔注射0.1 mL菌株Ⅰ和Ⅱ混合菌液,在保證飼養(yǎng)條件相同的情況下觀察7 d并記錄小鼠發(fā)病及死亡情況,并對死亡小鼠的臟器進一步分離鑒定。

1.6 藥敏試驗

通過k-B法[9]測定分離菌的耐藥性,記錄抑菌圈直徑大小,根據藥敏片說明書的抑菌范圍標準判定。

1.7 耐藥基因PCR鑒定

根據于美美等[10]、楊芳芳[11]的研究合成四環(huán)素類(TetO、TetS、TetL)、氨基糖苷類(aph(3")-IIa、ant(3")-Ia、aac(6')-Ib)耐藥基因引物核酸序列6對。引物由上海生工生物工程有限公司合成,具體見表1。

表1 耐藥基因引物序列

從分離菌株的培養(yǎng)平板挑取單菌落接種到TSB及LB液體培養(yǎng)基中,置于37 ℃恒溫搖床中培養(yǎng)24 h。利用水煮法提取細菌DNA。以各菌DNA為模板進行PCR擴增,反應體系為:2×Es Taq Master Mix 10 μL,F/R引物(10 μmoL)各0.5 μL,細菌DNA 2 μL,ddH2O 7 μL。PCR程序:預變性95 ℃ 10 min,變性95 ℃ 30 s;退火(溫度見表1)30 s;延伸72 ℃ 40 s,35個循環(huán),終延伸72 ℃ 10 min。將PCR擴增產物進行1%的瓊脂糖凝膠電泳。符合預期大小的核酸條帶膠回收后送上海生工生物工程有限公司進行測序。

2 結果與分析

2.1 細菌分離培養(yǎng)與革蘭氏染色

將番鴨病變組織劃線培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn),鮮血瓊脂培養(yǎng)平板長出一種灰白色、濕潤光滑、凸起的圓形菌落(圖1A),菌落周圍形成ɑ溶血環(huán),革蘭氏染色直徑為0.4～1.0 μm,呈球形或橢圓形、單個、雙個或鏈狀存在的陽性球菌,無芽孢、無莢膜(圖1C),符合糞腸球菌特征,命名為HN2021Ef菌株;SS培養(yǎng)平板上長出一種無色透明、表面光滑、濕潤、中心有黑點的菌落(圖1B),革蘭氏染色鏡鑒觀察為短桿陰性菌(圖1D),符合沙門氏菌特征,命名為HN2021Sa菌株。

圖1 細菌分離及鏡鑒結果

2.2 分離菌16S rRNA基因序列分析

將分離的HN2021Ef菌株純化后送公司測序,用NCBI Blast程序將拼接后的序列與NCBI 16S數據庫中的序列進行比對,結果顯示,HN2021Ef與糞腸球菌(序列號JQ388685.1)相似性達100%,且與其它糞腸球菌株的同源性均大于99%,根據不同屬細菌16S rRNA基因同源性為70%～90%,而同一種內不同株間基因同源性>99%[12],確定該細菌為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)。同時將與待測目的序列同源性大于99%的11個菌株及沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌、多殺性巴氏桿菌參考毒株的16S rRNA基因序列用軟件MEGA 6.06進行多序列匹配排列,以Neighbor-Joining方式進行同源性比較,并繪制進化樹。結果發(fā)現(xiàn)本菌與11種糞腸球菌均在一個分支中,而沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌、多殺性巴氏桿菌與本菌株均不在一個分支,同源性差異很大,具體見圖2、圖3。

圖2 糞腸球菌HN2021Ef株16S rRNA分析結果

圖3 糞腸球菌HN2021Ef株16S rRNA基因核苷酸序列同源性分析

同樣將分離的HN2021Sa菌種純化后送公司測序,測序結果與NCBI 16S數據庫中的序列進行比對,結果顯示,最靠前的30多個序列均為禽沙門氏菌,與該菌的相似性均為99.93%,確定該細菌為沙門氏菌[12]。將與待測物種序列同源性大于99%的任意5個菌株及選取的鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌、多殺性巴氏桿菌的16S rRNA基因序列用軟件MEGA 6.06進行同源性比較,并繪制進化樹。結果發(fā)現(xiàn)本菌與5種禽沙門氏菌均在一個分支中,而鴨疫里默氏菌、大腸桿菌、鏈球菌、多殺性巴氏桿菌等菌株與本菌株均不在一個分支,同源性差異很大,具體見圖4、圖5。

圖4 沙門氏菌HN2021Sa株16S rRNA分析結果

圖5 沙門氏菌HN2021Sa株16S rRNA基因核苷酸序列同源性分析

2.3 致病性試驗結果

小鼠感染沙門氏菌,24 h后均陸續(xù)出現(xiàn)精神萎頓、聚堆、拉稀便等癥狀,36 h后陸續(xù)出現(xiàn)死亡,7 d后死亡3只。小鼠感染糞腸球菌后,12 h出現(xiàn)精神沉郁,食欲減退癥狀,156 h后死亡1只,其余小鼠恢復正常。而混合感染的小鼠在8 h后均陸續(xù)出現(xiàn)嗜睡、腹瀉、食量減少等癥狀,24 h出現(xiàn)死亡,7 d后死亡5只。對照組小鼠均無異常。具體結果見表2。分離3組試驗組死亡小鼠肝臟培養(yǎng)細菌,經鑒定1組為沙門氏菌,2組為糞腸球菌,3組為沙門氏菌和糞腸球菌。

表2 2種分離菌對小鼠致病性結果

2.4 藥敏試驗

對分離的沙門氏菌菌株和糞腸球菌菌株進行藥敏試驗,結果表明,沙門氏菌對頭孢噻肟、氟苯尼考、阿莫西林3種藥物敏感;對環(huán)丙沙星、安普霉素、氨芐西林、硫酸黏菌素、替米考星5種藥物中度敏感;對慶大霉素、多西環(huán)素2種藥物完全耐藥。糞腸球菌對環(huán)丙沙星、慶大霉素、安普霉素、頭孢噻肟、氟苯尼考、林可霉素、阿莫西林、替米考星8種藥物敏感;對氨芐西林、硫酸黏菌素2種藥物中度敏感,對多西環(huán)素1種藥物完全耐藥,具體結果見表3。

表3 糞腸球菌菌株及沙門氏菌菌株藥敏試驗結果

2.5 耐藥基因分析

在對沙門氏菌及糞腸球菌耐藥基因進行檢測后發(fā)現(xiàn)沙門氏菌檢出四環(huán)素TetO、TetS耐藥基因及氨基糖苷類ant(3")-Ia耐藥基因,糞腸球菌檢出四環(huán)素TetL耐藥基因,具體結果見圖6。

圖6 糞腸球菌和沙門氏菌菌株四環(huán)素類耐藥基因電泳結果

3 討 論

本試驗從病變番鴨組織中分離鑒定出沙門氏菌及糞腸球菌,經16s rRNA序列測序分析,發(fā)現(xiàn)分離的2種菌株與沙門氏菌及糞腸球菌的同源性最高。其系統(tǒng)發(fā)育樹與核苷酸序列同源性分析結果表明,不同物種、不同地域、不同時間上分離的沙門氏菌及糞腸球菌其差異性較小,但不同種屬菌株之間存在一定的差異性,從分子水平上證實分離的2株不同形態(tài)的菌株分別為糞腸球菌和沙門氏菌。

關于細菌耐藥問題在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中一直普遍存在,不合理的用藥方案和藥物泛濫使用,加速耐藥菌株的出現(xiàn)。本研究藥敏試驗結果顯示,樣品中分離的沙門氏菌對多西環(huán)素和慶大霉素均完全耐藥,分離出的糞腸球菌對多西環(huán)素完全耐藥,分離出的2種菌對其余幾種抗生素出現(xiàn)了不同程度的耐受性。同時本試驗對分離的沙門氏菌分別進行四環(huán)素類(TetO、TetS、TetL)耐藥基因和氨基糖苷類(aph(3")-IIa、ant(3")-Ia、aac(6')-Ib)耐藥基因檢測,結果發(fā)現(xiàn)沙門氏菌菌株檢測到TetO、TetS、ant(3")-Ia耐藥基因。TetO和TetS屬于四環(huán)素耐藥機制中的核糖體保護蛋白,該蛋白能保護核糖體不被四環(huán)素作用,使細菌具有抵抗多西環(huán)素等的能力[13]。氨基糖苷類核苷轉移酶(ANT)屬于氨基糖苷類鈍化酶類之一。鄧飛等[14]研究表明由沙門氏菌的耐藥基因編碼的氨基糖苷類修飾酶可對氨基糖苷類的結構進行修飾,使其失活而無法作用于沙門氏菌,這是介導氨基糖苷類耐藥的主要機制。李少博等[15]認為,沙門氏菌的耐藥性是由于編碼沙門氏菌某些成分的基因發(fā)生突變而造成的,而抗性基因的嵌入及通過基因的轉移也能導致細菌耐藥性不斷增強。本試驗對分離的糞腸球菌進行四環(huán)素類(TetO、TetS、TetL)耐藥基因檢測,結果發(fā)現(xiàn)糞腸球菌菌株中出現(xiàn)TetL耐藥基因。TetL屬于四環(huán)素耐藥機制中的外輸泵蛋白第2群蛋白,主要存在于革蘭氏陽性菌中,Tet外輸泵基因編碼的相關膜蛋白可將四環(huán)素泵出胞外,降低了細胞內保護核糖體的藥物濃度,從而產生耐藥[13]。因此在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中,對抗生素的使用要給予足夠的重視,特別是因抗生素的濫用,多重耐藥菌株大量出現(xiàn),且產生的因素復雜,控制難度大[16]。因此檢測細菌的耐藥性有助于全面掌握耐藥性的流行規(guī)律,也為畜禽抗菌藥物的合理使用提供警示和科學合理的依據。

關于動物單獨感染糞腸球菌及沙門氏菌的報道很多,陳一資等[17]發(fā)現(xiàn)由糞鏈球菌感染的肉鴨爆發(fā)傳染病,且死亡率很高。李慧等[2]將不同劑量的糞腸球菌人工感染小鼠,發(fā)現(xiàn)小鼠腦部呈現(xiàn)不同程度的血腦屏障損傷。井郁金等[18]發(fā)現(xiàn)某羊場由于金黃色葡萄球菌與糞鏈球菌混合感染導致該羊群體溫升高、咳嗽,發(fā)病不斷。沙門氏菌主要發(fā)生于雛鴨等幼禽的急性細菌傳染病[19-21]。本試驗采樣的鴨場在疫病發(fā)生后經實驗室檢測,排除病毒性疾病感染,從肝臟中分離出致病性的沙門氏菌和糞腸球菌,致病性試驗結果表明混合感染2種菌的小鼠死亡率增加。分析原因發(fā)現(xiàn)該鴨場每個鴨舍飼養(yǎng)密度太大,空氣流通不暢,臭味熏天,蒼蠅較多,且鴨舍濕度較大,極利于有害細菌的繁殖。動物機體是一個免疫力和病原體互相抗衡和較量的環(huán)境,如果機體免疫力較高,即便有病原體存在,機體也處于一個平衡穩(wěn)定的狀態(tài)。但如果因某種因素而導致免疫力下降,大量的病原體將會侵入宿主并繁殖,黏附于宿主細胞,分泌毒性物質破環(huán)細胞組織,感染動物使其發(fā)病。因此推測該鴨場此次發(fā)病與鴨場環(huán)境不良導致鴨群抵抗力下降有關,引起糞腸球菌及沙門氏菌混合感染對鴨群造成影響。但目前鮮有關于動物混合感染糞腸球菌及沙門氏菌的報道,對于感染發(fā)病后哪種菌是原發(fā)、哪種菌是繼發(fā)還需要更深入的研究。本試驗對2種菌進行了耐藥分析,也為該鴨場對癥用藥提供參考。

4 結 論

本試驗從死亡成年番鴨肝臟中成功分離致病性糞腸球菌和致病性沙門氏菌。沙門氏菌對多西環(huán)素、慶大霉素耐藥,且檢出四環(huán)素類TetO、TetS耐藥基因及氨基糖苷類ant(3")-Ia耐藥基因。糞腸球菌對多西環(huán)素耐藥,且檢出四環(huán)素類TetL耐藥基因。