張桂山,張英楠,楊樹(shù)寶,徐 晶*,姜懷志

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院 公共衛(wèi)生學(xué)院,吉林 吉林 132013;2.吉林醫(yī)藥學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 吉林 132013;3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 長(zhǎng)春 130118)

乾華肉用美利奴羊是以南非肉用美利奴羊公羊?yàn)楦副?以當(dāng)?shù)貙?dǎo)入澳美基因的東北細(xì)毛羊?yàn)槟副?采用級(jí)進(jìn)雜交方法系統(tǒng)選育而成的綿羊新品種,是一個(gè)典型的肉毛兼用型細(xì)毛羊品種,不但具有優(yōu)質(zhì)的肉用性能,同時(shí)也可產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的以毛纖維直徑19.0～21.5 μm為主體的同質(zhì)細(xì)羊毛,成年公羊、母羊的剪毛量分別可達(dá)7.51±1.65 kg和6.82±1.35 kg[1]。羊毛,尤其是細(xì)羊毛作為高檔的紡織原料,在全球紡織工業(yè)中占有重要的地位。獲得量多質(zhì)優(yōu)的細(xì)羊毛和羊肉也是目前羊品種選育追求的重要經(jīng)濟(jì)指標(biāo)。毛囊,尤其是次級(jí)毛囊直接決定了細(xì)羊毛的產(chǎn)量和羊毛質(zhì)量。miRNA作為生殖發(fā)育[2-3]、細(xì)胞增殖分化[4-6]、凋亡[7-8]、代謝[9]、毛囊發(fā)育相關(guān)信號(hào)等[10]重要的調(diào)節(jié)器,在毛囊周期性發(fā)育過(guò)程中扮演著重要的角色,其可以通過(guò)作用于對(duì)毛囊周期性發(fā)育具有重要作用的靶基因來(lái)調(diào)節(jié)毛囊的周期性發(fā)育。目前關(guān)于羊毛囊發(fā)育的研究主要集中在羊毛囊發(fā)生發(fā)育相關(guān)基因的驗(yàn)證,而有關(guān)從miRNA-靶基因mRNA-靶蛋白的角度闡述其對(duì)毛囊周期性發(fā)生發(fā)育作用的研究仍然不是很系統(tǒng)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)miRNA-1-3p的表達(dá)在絨山羊毛囊周期的生長(zhǎng)期低于休止期,miRNA-1-3p通過(guò)靶向FGF14調(diào)控遼寧絨山羊毛囊發(fā)育[11]。因此,為進(jìn)一步明確乾華肉用美利奴羊產(chǎn)毛的分子機(jī)制,本研究從乾華肉用美利奴羊次級(jí)毛囊生長(zhǎng)期和休止期呈現(xiàn)顯著差異表達(dá)的miRNA入手,通過(guò)生物信息學(xué)方法,對(duì)呈現(xiàn)差異表達(dá)且影響細(xì)胞增殖的miR-1-3p進(jìn)行了靶基因預(yù)測(cè)及驗(yàn)證,通過(guò)miRNA及其靶基因在毛囊不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)規(guī)律,進(jìn)一步明確miRNA及其靶基因在毛囊周期性發(fā)育過(guò)程中的重要作用,為明確乾華肉用美利奴羊產(chǎn)毛的分子機(jī)制奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集2周歲乾華肉用美利奴羊母羊(每個(gè)毛囊發(fā)育時(shí)期選取5只)次級(jí)毛囊生長(zhǎng)期(9月份)和休止期(5月份)的肩胛部皮膚樣品1 cm2,放入液氮中,用于總RNA及總蛋白的提取。

1.2 方法

1.2.1 乾華肉用美利奴羊皮膚毛囊總RNA的提取 按照TaKaRa Trizol說(shuō)明書提供的方法提取總RNA,用Agilent2100檢測(cè)總RNA質(zhì)量。

1.2.2 生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和分析 采用miRNA在線靶基因預(yù)測(cè)軟件Targetscan v7.0、miRanda和RNA22對(duì)miR-1-3p靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.2.3 miR-1-3p及其候選靶基因FGF14mRNA相對(duì)表達(dá)量測(cè)定 采用SYBR法對(duì)miR-1-3p及其候選靶基因FGF14進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。采用2-△△CT計(jì)算法對(duì)熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行分析來(lái)檢測(cè)miR-1-3p及其候選靶基因FGF14mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot定量分析 按照全蛋白提取試劑盒(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品)說(shuō)明書提取乾華肉用美利奴羊皮膚毛囊組織總蛋白,將總蛋白樣品與5×上樣緩沖液混合變性,取40 μg樣品上樣。半干轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。一抗(1∶1500 TBST稀釋)4 ℃過(guò)夜,二抗(1∶2000 TBST稀釋)室溫孵育1 h,ECL化學(xué)發(fā)光,曝光。采用Image-Pro Plus 6.0分析目標(biāo)蛋白條帶的積分光密度值(IOD),利用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn) 將野生型和突變型候選靶基因靶位點(diǎn)及其兩端部分序列片段連接到雙熒光素酶報(bào)告載體psiCHECK-2上,按照優(yōu)化濃度,將mimics、脂質(zhì)體、質(zhì)粒DNA、陰性對(duì)照和100 ng/孔野生型及突變型表達(dá)載體分別加入到Opti-MEM中稀釋,陰性對(duì)照濃度參照mimics濃度,將稀釋好的mimics和陰性對(duì)照、質(zhì)粒DNA分別與脂質(zhì)體混勻,放置15～20 min,將混合物滴加到生長(zhǎng)良好的HEK293T/17細(xì)胞培養(yǎng)液中,6 h后換正常細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液,轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞檢測(cè)雙熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)整理和t檢驗(yàn),P<0.05表示差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品總RNA質(zhì)量分析

2個(gè)樣品總RNA的OD260/280分別為1.89和1.95,OD230/260分別為1.92和1.97,28S/18S分別為1.6和1.7,Agilent 2100分析RIN結(jié)果分別為8.7和8.6,濃度大于1800 ng/μL,說(shuō)明乾華肉用美利奴羊兩個(gè)次級(jí)毛囊樣品的總RNA純度高,質(zhì)量好,可以用于熒光定量PCR檢測(cè)。

2.2 miR-1-3p靶基因預(yù)測(cè)結(jié)果

由表2可見(jiàn),FGF14同時(shí)被3個(gè)在線靶基因預(yù)測(cè)軟件Targetscan v7.0、RNA22 v2.0和MiRanda(2010)預(yù)測(cè)到。

表1 總RNA質(zhì)量分析

表2 3個(gè)靶基因預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)的候選靶基因

2.3 miR-1-3p及其候選靶基因FGF14 mRNA相對(duì)定量表達(dá)

由圖1可見(jiàn),miR-1-3p相對(duì)表達(dá)量在生長(zhǎng)期低表達(dá),休止期高表達(dá);圖2顯示,FGF14mRNA在生長(zhǎng)期高表達(dá),休止期低表達(dá)。miR-1-3p與其靶基因在生長(zhǎng)期和休止期呈現(xiàn)負(fù)調(diào)控關(guān)系。

圖1 miR-1-3p的相對(duì)表達(dá)量

圖2 FGF14 mRNA相對(duì)表達(dá)量

2.4 靶基因FGF14蛋白相對(duì)定量表達(dá)

由圖3可見(jiàn),FGF14蛋白在生長(zhǎng)期高表達(dá),在休止期低表達(dá),表達(dá)趨勢(shì)與FGF14mRNA一致。

圖3 FGF14蛋白表達(dá)

2.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)

圖4顯示,共轉(zhuǎn)染miR-1-3p mimics和FGF14-Luc及miR-1-3p mimics和FGF14-Mut-Luc后,共轉(zhuǎn)染miR-1-3p mimics和FGF14-Luc組的熒光素酶活性顯著低于陰性對(duì)照組(P<0.05),而共轉(zhuǎn)染miR-1-3p mimics和FGF14-Mut-Luc組的熒光素酶活性與陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05),說(shuō)明miR-1-3p mimics能夠抑制野生型FGF14的靶位點(diǎn)報(bào)告載體的熒光素酶活性。但當(dāng)靶基因結(jié)合位點(diǎn)突變后(轉(zhuǎn)染突變型表達(dá)載體),FGF14被抑制的熒光素酶活性能夠得到恢復(fù),說(shuō)明FGF14是miR-1-3p的靶基因。

圖4 FGF14雙熒光素酶報(bào)告分析

3 討 論

miRNA在組織及細(xì)胞中時(shí)空差異性表達(dá)的特點(diǎn)決定了其在組織細(xì)胞中發(fā)揮的差異性調(diào)控作用,如調(diào)控細(xì)胞更新、分化發(fā)育、凋亡等,而miRNA正是通過(guò)對(duì)其靶基因的調(diào)控作用而發(fā)揮此功能。miRNA對(duì)毛囊發(fā)生發(fā)育的作用正是通過(guò)其對(duì)靶基因的調(diào)控作用實(shí)現(xiàn)對(duì)毛囊周期性發(fā)育的調(diào)控作用。MA等[12]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-203的表達(dá)顯著下調(diào)其靶基因酶寡糖基轉(zhuǎn)移酶(DDOST)和E1NEDD8激活酶(NAE1)的mRNA和蛋白表達(dá),從而實(shí)現(xiàn)其對(duì)遼寧絨山羊毛囊周期性發(fā)育的調(diào)控作用,這與本研究miR-1-3p通過(guò)負(fù)調(diào)控其靶基因FGF14mRNA和蛋白的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)乾華肉用美利奴羊皮膚毛囊周期性發(fā)育調(diào)控機(jī)制一致。目前研究人員多采用雙熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)驗(yàn)證miRNA與其候選靶基因的靶向調(diào)控關(guān)系,Hai等[13]采用雙熒光素梅報(bào)告試驗(yàn)確定了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β受體2 (TGF-βR2)和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2 (FGFR2)為Chi-miR-370-3p的靶基因,Chi-miR-370-3p還通過(guò)調(diào)控上皮細(xì)胞和真皮成纖維細(xì)胞中TGF-βR2和FGFR2的mRNA水平表達(dá)和蛋白水平的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)內(nèi)蒙古絨山羊不同胎兒期的毛囊發(fā)育,進(jìn)一步DNA染色、細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果表明,Chi-miR-370-3p促進(jìn)上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞遷移。Qu等[14]研究發(fā)現(xiàn)miR-125b通過(guò)負(fù)調(diào)控其靶基因MXD4和FGFR2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)毛羊和絨山羊的毛囊分化發(fā)揮作用。miRNA也可以通過(guò)其靶基因?qū)崿F(xiàn)對(duì)某些信號(hào)通路的調(diào)控作用,Zhao等[15]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-181a-5p通過(guò)作用于wnt靶向抑制劑wnt抑制因子1(WIF1)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路,從而調(diào)節(jié)通路基因和蛋白的表達(dá),實(shí)現(xiàn)抑制真皮乳頭細(xì)胞凋亡,促進(jìn)增殖;Luo[16]研究發(fā)現(xiàn)miR-203a-3p負(fù)向調(diào)控Smad1的表達(dá),促進(jìn)龍血素A誘導(dǎo)的毛囊干細(xì)胞的分化,實(shí)質(zhì)是在BMP/Smad1信號(hào)通路中,miR-203a-3p降低Smad1的表達(dá),從而減輕BMP對(duì)毛囊干細(xì)胞分化的抑制作用。Feng[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-31-5p可通過(guò)作用其靶基因RASA1,上調(diào)RASA1/MAP3K1信號(hào)通路中MAP3K1的表達(dá)水平,達(dá)到顯著促進(jìn)山羊毛囊干細(xì)胞增殖,抑制凋亡。研究發(fā)現(xiàn)FGF14同樣在某些信號(hào)通路中起著重要作用,Su[18]研究發(fā)現(xiàn)FGF14通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR通路在結(jié)直腸癌中作為腫瘤細(xì)胞抑制因子,在直腸癌細(xì)胞系中具有抑制細(xì)胞活力的作用;Pablo[19]研究發(fā)現(xiàn)FGF14是KCNQ2/3通道的正向調(diào)節(jié)器,FGF14敲除導(dǎo)致全細(xì)胞KCNQ通道電流減少,說(shuō)明FGF14在細(xì)胞中發(fā)揮了重要的功能作用。Ke[20]研究發(fā)現(xiàn)miR-1-3p可通過(guò)其靶基因STC2抑制癌細(xì)胞增殖。FGF11亞家族成員包括FGF11/12/13/14,而FGF13可能對(duì)于毛囊的自我更新有一定的作用,誘導(dǎo)毛囊從休止期向生長(zhǎng)期過(guò)渡,FGF14也是FGF11亞家族成員之一[21],目前關(guān)于FGF14與毛囊發(fā)育相關(guān)的研究文獻(xiàn)鮮有報(bào)道,前期研究發(fā)現(xiàn)FGF14在遼寧絨山羊毛囊生長(zhǎng)期高表達(dá),休止期低表達(dá),其表達(dá)規(guī)律與本研究中FGF14在乾華肉用美利奴羊表達(dá)規(guī)律一致,說(shuō)明miR-1-3p可能通過(guò)負(fù)調(diào)控FGF14的表達(dá),參與誘導(dǎo)毛囊從休止期向生長(zhǎng)期過(guò)渡[12]。

4 結(jié) 論

FGF14在乾華肉用美利奴羊毛囊生長(zhǎng)期高表達(dá),休止期低表達(dá),說(shuō)明其可以作為乾華肉用美利奴羊毛囊周期性新生的分子標(biāo)記物,而FGF14是miR-1-3p的靶基因,miR-1-3p可能正是通過(guò)負(fù)調(diào)控FGF14的表達(dá),參與誘導(dǎo)乾華肉用美利奴羊毛囊從休止期向生長(zhǎng)期過(guò)渡。