耿斐

(山東建筑大學學報編輯部，山東 濟南 250101)

0 引言

蛋白質是一類兩性物質，可以與包括表面活性劑[1-2]、藥物[3-4]、染料[5-6]以及金屬離子[7]等在內的許多種類的小分子結合。 蛋白質的功能是由特定的三維空間結構決定的，與小分子的相互作用會引起分子中各級結構的變化，導致化學性質變化和生物活性喪失，最嚴重的還會引起變性。 牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)來源豐富，性質穩(wěn)定，在眾多領域都得到了廣泛的應用，是人類最早研究的蛋白質之一[1]。 GHOSH 等[8]研究發(fā)現(xiàn)表面活性劑極性頭基的疏水性在穩(wěn)定蛋白質方面發(fā)揮著重要作用，極性頭基的疏水性越強，與蛋白質結合效率越高。 胡曉熙等[9]通過熒光光譜法，從作用機理、結合常數(shù)及位點數(shù)、作用力類型等方面，研究了全氟烷基甜菜堿與BSA 的相互作用，補充了全氟表面活性劑與蛋白質相互作用的研究數(shù)據(jù)。

現(xiàn)有報道多關注傳統(tǒng)陰、陽離子表面活性劑與BSA 的相互作用，而結構可調、功能化的表面活性劑與蛋白質相互作用的研究雖有報道，但稍顯欠缺。陽離子表面活性劑1-十四烷基-3-甲基咪唑溴(1-tetradecyl-3-methylimidazolium bromide， C14mimBr)具有更高的表面活性[10]，研究其與BSA 的相互作用，有助于發(fā)掘長鏈咪唑類表面活性劑的特別之處，開拓咪唑類表面活性劑的應用領域。 文章通過測量C14mimBr/BSA 體系的表面張力值、電導率值、靜態(tài)熒光、內源熒光、圓二色及相互作用焓，考察了C14mimBr與BSA 相互作用過程中的熱力學參數(shù)、作用方式、作用參數(shù)以及BSA 結構的變化。

1 實驗材料、儀器與方法

1.1 實驗材料

C14mimBr 根據(jù)文獻[11]的方法合成，過程為:控制溫度在75 ～80 ℃范圍，在氮氣保護的條件下，甲基咪唑、過量的溴代十四烷和乙腈攪拌回流反應48 h，之后旋轉蒸發(fā)以除去過量的溴代烷烴和乙腈，減壓蒸餾以除去水，即得到最終產(chǎn)物。 C14mimBr 結構式如圖1 所示。 BSA 購自美國Amresco 公司；十四烷基三甲基溴化銨( Tetradecyl Trimethyl Ammonium Bromide， TTAB)，分析純，購自美國Sigma-Aldrich 公司；碘化鉀KI，分析純，購自上海國藥集團。

圖1 1-十四烷基-3-甲基咪唑溴結構示意圖

1.2 實驗儀器與方法

在JYW-200B 型表面張力儀上使用吊環(huán)法通過單測得到表面張力數(shù)值，至少測量2 次，直到測得的誤差＜0.2 mN/m。 使用DDS-307 型電導率儀測量體系的電導率。 以上實驗的溫度分別為25、35、45 ℃

使用LS-55 熒光光譜儀測量熒光:內源熒光測定固定激發(fā)波長為280 nm，于295 ～440 nm 范圍內掃描C14mimBr/BSA 體系；同步熒光測定固定激發(fā)和發(fā)射的波長差Δλ＝60 nm，于200 ～400 nm 范圍內掃描C14mimBr/BSA 體系。 使用J-810 遠紫外圓二色光譜儀，測量時帶寬為2 nm，通過儀器自帶的Secondary Structure 軟件計算得到BSA 二級結構。使用Thermal Activity Monitor 2277 等溫滴定微量熱儀進行實驗:注射器每次注入12 μL 表面活性劑進入裝著0.50 mL BSA 的樣品池，共注入24 次，注入后的平衡時間均為45 min。 待基線在30 r/min 的攪拌下穩(wěn)定后再啟動實驗。 攪拌熱已由程序自動扣除。 以上實驗的溫度均為25 ℃。

2 結果與討論

2.1 C14mimBr/BSA 體系表面張力

測定了25、35、45 ℃ 時C14mimBr/BSA 體系(BSA 質量濃度ρ為0.68 g/L)的表面張力，如圖2所示。 曲線有兩個明顯的拐點，根據(jù)蛋白質與表面活性劑相互作用的規(guī)律可知，第一個拐點表明BSA開始與C14mimBr結合，此時對應的C14mimBr 濃度稱為臨界聚集濃度(Critical Aggregation Concentration，CAC)。 由于BSA 的存在，增加的C14mimBr分子大都與之結合，吸附在溶液表面的C14mimBr 沒有明顯增加，所以表面張力數(shù)值的變化很小，出現(xiàn)了第一個平臺。 CAC 的出現(xiàn)說明C14mimBr 和BSA 的相互作用優(yōu)先于膠束的形成。 第二個拐點表明C14mimBr 與BSA 的結合已經(jīng)達到飽和，C14mimBr 開始形成膠束，達到了臨界膠束濃度(Critical Micelle Concentration，CMC)。

圖2 不同溫度下C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)表面張力圖

BSA 中共有3 個亞結構，每個亞結構是由雙胱氨酸鍵連接兩個次級區(qū)域形成的，而每個次級區(qū)域由3 段螺旋結構組成，其相互平行，形成一個槽形區(qū)域。 絕大部分疏水殘基都分布在螺旋和槽內，所以次級區(qū)域有疏水內核；在次級區(qū)域的頂端開口部分分布著一些非極性殘基，所以次級區(qū)域有極性外表。C14mimBr 疏水尾部可以進入BSA 非極性的內部，而其親水頭基則以靜電作用與BSA 極性的殘基結合。由圖2 可知，溫度改變對CAC 沒有影響。 已知靜電相互作用受溫度的影響很小，所以在CAC 時，C14mimBr主要以咪唑頭基通過靜電作用與BSA 中的極性殘基相互作用。

測量了不同溫度下C14mimBr/BSA 體系(BSA質量濃度變化)的表面張力，如圖3 所示。 CAC 不隨BSA 質量濃度的增大而變化，而CMC 隨著BSA質量濃度的增大而升高。不同溫度下體系的CMC數(shù)值見表1。

表1 不同溫度下C14mimBr/BSA 體系(BSA 質量濃度變化)CMC 值表

圖3 不同溫度下C1 4mimBr/BSA 體系(BSA 質量濃度變化)表面張力圖

CMCwithBSA-CMCwithoutBSA即為結合到BSA 上的C14mimBr 的量。 以其對BSA 質量濃度作圖，如圖4所示。 曲線隨BSA 質量濃度的增加線性增長，求得直線斜率，即為BSA 結合C14mimBr 的量。 得到每克BSA 結合C14mimBr 的量分別為1.66×10-4mol(25 ℃)、1.99×10-4mol(35 ℃)及1.80×10-4mol(45 ℃)。

圖4 CMCwith BSA-CMCwithout BSA對BSA 質量濃度作圖

2.2 C14mimBr/BSA 體系熱力學參數(shù)

測定了25、35、45 ℃ 時，C14mimBr/BSA 體系(ρBSA＝0.68 g/L)的電導率，如圖5 所示。 所得曲線雙折線的折點對應著膠束的形成。 反離子解離度α＝膠束形成后的直線斜率/膠束形成前的直線斜率；反離子結合度β＝1-α。 根據(jù)圖5，經(jīng)過計算可知，25、35、45 ℃時，C14mimBr/BSA 體系的反離子結合度β分別為0.72、0.72 和0.67。

圖5 C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)在不同溫度下的電導率圖

根據(jù)質量作用模型，熱力學參數(shù)可以由式(1)～(3)表示為

式中ΔGmic和ΔHmic分別為膠束形成的吉布斯自由能和焓，kJ/mol；ΔSmic為膠束形成的熵，kJ/(mol·K)；T為溫度，K；R為常數(shù)，取值為8.314。

不同溫度下，C14mimBr/BSA 體系的熱力學參數(shù)計算結果見表2。 ΔGmic值均為負，說明膠束的形成是自發(fā)的。ΔHmic和-TΔSmic均為負值，說明膠束的形成是熵焓共驅過程。

表2 不同溫度下C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)熱力學參數(shù)表

2.3 C14mimBr/BSA 體系遠紫外圓二色光譜

C14mimBr 與BSA 的相互作用會導致BSA 的結構發(fā)生一些變化，可以通過圓二色光譜檢測BSA 二級結構的改變。 在圓二色光譜上，α-螺旋結構的特征峰表現(xiàn)為208 及222 nm 附近的兩個負槽，β-折疊結構的特征峰表現(xiàn)為215 nm 附近的負槽。

C14mimBr/BSA 體系(ρBSA＝0. 68 g/L) 隨C14mimBr濃度變化的遠紫外圓二色光譜如圖6 所示。 可以看出:當C14mimBr 的濃度較低(1×10-8～1×10-4mol/L)時，BSA 的二級構象幾乎沒有改變，可能是因為C14mimBr 分子與BSA 的高能位點結合，穩(wěn)定了其二級結構，導致其構象更加緊密；當C14mimBr 的濃度達到1 × 10-3mol/L 時，215 和222 nm處的負槽消失，說明BSA 的二級構象被破壞。

圖6 C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)遠紫外圓二色光譜圖

C14mimBr/BSA 體系中，BSA 二級構象質量分數(shù)見表3。 低濃度(＜1×10-4mol/L)的C14mimBr 增加了BSA 中α-螺旋及β-折疊的量，穩(wěn)定了BSA 的二級結構；高濃度(＞1×10-4mol/L)的C14mimBr 使BSA 中α-螺旋及β-折疊的量顯著降低，破壞了BSA 的二級結構。

表3 C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)中BSA二級構象質量分數(shù)表

2.4 C14mimBr/BSA 體系熒光光譜

2.4.1 C14mimBr/BSA 體系內源熒光光譜

圖7 顯示了 C14mimBr/BSA 體系(ρBSA＝0.68 g/L)中BSA 的內源熒光隨C14mimBr 濃度的變化。 色氨酸殘基的熒光光譜對微環(huán)境的變化很敏感，其峰位一般在波長為325 ～350 nm 之間變動。由圖7 可知，體系的熒光發(fā)射峰是BSA 中色氨酸殘基的特征熒光光譜。 C14mimBr 的加入(0～1×10-3mol/L)導致最大熒光發(fā)射峰峰值的降低，色氨酸殘基的最大峰峰值從509 下降到258，同時伴隨著峰位的藍移，最大峰位置從350 nm 移到332 nm，說明色氨酸殘基暴露于更加疏水的環(huán)境中。此時，C14mimBr 還沒有形成膠束，這種現(xiàn)象只能歸因于C14mimBr 與BSA 形成了復合物。 隨著C14mimBr的濃度進一步加大，大于0.01 mol/L 時，最大熒光發(fā)射峰峰值與峰位置幾乎不再發(fā)生變化，此時造成了BSA 的變性。

圖7 C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)內源熒光光譜圖

2.4.2 C14mimBr/BSA 體系結合參數(shù)

熒光淬滅可以揭示淬滅劑對熒光物質的淬滅位置。 一般來講，表面活性劑對色氨酸殘基的淬滅是因為靜態(tài)淬滅形成了不能發(fā)射熒光的激基締合物[12]。 為了驗證C14mimBr 與BSA 的淬滅是否是靜態(tài)淬滅，應用Stern-Volmer 方程計算結合淬滅過程的反應速度Kq，方程由式(4)表示為

式中I、I0分別為不含、含有淬滅劑時的最大熒光發(fā)射峰峰值；τ為不含淬滅劑時熒光物質的壽命，對BSA 而言，τ＝6 nm[13]；cQ為淬滅劑的濃度，mol/L。

圖8 為I0/I對C14mimBr 濃度曲線，Kqτ是曲線線性部分的斜率，計算可得Kq為2.81×1011L/mol·s。對于動態(tài)淬滅反應，反應速度Kq最大為1.00×1011L/mol·s[14]，這就說明C14mimBr 對BSA 的淬滅過程是靜態(tài)淬滅。

圖8 C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)相對熒光強度對C14mimBr 濃度作圖

在靜態(tài)淬滅過程中，假設淬滅劑與熒光物質的n個獨立且相同的結合位作用，已經(jīng)結合的部位之間無相互作用，結合反應可由式(5)表示為

式中Q 與P 分別為淬滅劑與熒光物質；QnP 為激基締合物。

平衡常數(shù)K可由式(6)表示為

式中c為濃度，mol/L。

對式(6)兩側取對數(shù)，并將熒光物質與激基締合物都用其相應的最大熒光發(fā)射峰峰值表示，式(6)可變形成式(7)

將C14mimBr/BSA 體系的對lgc作圖，如圖9 所示。 通過曲線的斜率與截距，可以計算得到結合位點n與平衡常數(shù)K。 可得C14mimBr/BSA體系的n＝0.97、K＝1 000 L/mol。 推測在考察的濃度范圍內(C14mimBr 為3×10-5～1×10-3mol/L)，C14mimBr與BSA 之間為疏水相互作用。 根據(jù)2.1 部分中表面張力曲線，已知在CAC 附近時，C14mimBr與BSA 以靜電相互作用為主，可知:當C14mimBr 濃度較小時，其極性頭基先以靜電相互作用與BSA 特定的結合位點作用；當C14mimBr 濃度較大時，其疏水尾鏈再以疏水作用與BSA 的非極性殘基部分結合。

圖9 對C14mimBr 濃度作圖

BSA 分子中含有兩個色氨酸殘基，一個位于BSA 的疏水空腔內，另一個位于外層。 C14mimBr 與BSA 相互作用的結合位點n為0.97，說明一個C14mimBr只與一個色氨酸殘基作用。 為了驗證推測，即在考察的濃度范圍內(C14mimBr 濃度為3×10-5～1×10-3mol/L)，C14mimBr 與BSA 之間為疏水相互作用，在C14mimBr/BSA 體系中加入I-。 I-作為淬滅劑僅能與BSA 表面的色氨酸殘基反應，而不能進入BSA 內部淬滅色氨酸殘基[15]。 I-對色氨酸殘基的淬滅是動態(tài)淬滅，可由式(8)表示為

式中f為可以被淬滅的殘基占總殘基的比例。

含有與不含有C14mimBr 時，I-對BSA 熒光強度的影響如圖10 所示。 通過對圖10 中曲線的截距計算可知:不含有C14mimBr 時，f為58.74%；含有C14mimBr時，f為90.09%。 可見隨著C14mimBr 的加入，BSA 表面的色氨酸殘基所占比例增大。 表面色氨酸殘基的數(shù)量不會增加，所以f增大只能是由于C14mimBr的加入，使BSA 內部的色氨酸殘基的數(shù)量降低，由此可知C14mimBr 只能通過疏水作用與BSA內部的色氨酸殘基作用。

圖10 I-濃度對BSA 熒光強度的影響圖

2.4.3 C14mimBr/BSA 體系同步熒光光譜

C14mimBr/BSA 體系(BSA 為0.68 g/L)的同步熒光光譜如圖11 所示。 Δλ＝60 nm 時的同步熒光是色氨酸殘基的。 隨著C14mimBr 的加入，色氨酸殘基的最大發(fā)射峰峰值降低，但是最大峰位置未發(fā)生變化，表明C14mimBr 與BSA 的相互作用沒有影響色氨酸殘基的微環(huán)境。 當C14mimBr 的濃度＞0.01 mol/L時，BSA 熒光光譜不再發(fā)生變化，此時BSA 發(fā)生變性，這與遠紫外圓二色光譜及內源熒光光譜的結果相吻合。

圖11 C14mimBr/BSA 體系(ρBSA ＝0.68 g·L-1)同步熒光光譜圖

2.5 C14mimBr/BSA 體系等溫滴定微量熱

蛋白質與表面活性劑作用的等溫滴定微量熱控制實驗包括膠束及蛋白質的稀釋熱，已有實驗證明蛋白質的稀釋熱可以忽略[16]。 扣除控制實驗之后，C14mimBr/BSA及TTAB/BSA 體系(BSA 均為0.68 g/L)的等溫滴定微量熱曲線如圖12 所示。 兩體系曲線的變化趨勢類似，可以按反應進程將曲線劃分為3 部分。第一進程(c＜c1)，BSA 的高能位點與表面活性劑分子結合， BSA 的熱穩(wěn)定性增強。 此階段作用焓隨著表面活性劑濃度的增大逐漸減小，說明隨著相互作用，BSA 上特定的高能位點逐漸減少。根據(jù)2.1及2.4部分分析，此時表面活性劑的極性頭基先通過靜電作用與BSA 帶負電荷的氨基酸殘基作用，尾鏈再通過疏水作用與BSA 的疏水氨基酸殘基作用。 第二進程(c1＜c＜c2)，BSA 的二級結構遭到破壞，分子逐步展開，最終發(fā)生變性。 此階段作用焓隨著表面活性劑濃度的增大逐漸變大，c2所對應的作用焓最大值是BSA 發(fā)生變性時產(chǎn)生的熱量[16]。 此階段C14mimBr/BSA體系的熱量變化比TTAB/BSA 體系的明顯， 說明在破壞BSA 的二級結構方面，C14mimBr要強于TTAB。 這主要由于C14mimBr 分子的咪唑頭基之間有氫鍵，當與BSA 作用時，要先克服氫鍵作用。 第三進程(c＞c2)，表面活性劑開始形成膠束，熱量急劇減小至零。

圖12 C14mimBr/BSA 及TTAB/BSA 體系熱流曲線圖

3 結論

通過上述研究，得到以下結論:

(1) 咪唑型表面活性劑C14mimBr 與BSA 的相互作用與其濃度有著密切的關系。 當C14mimBr 濃度較低時，作用方式為靜電相互作用，C14mimBr 的加入穩(wěn)定了BSA 的二級結構；當C14mimBr 濃度較大時，作用方式為疏水相互作用，C14mimBr 的加入破壞了BSA 的二級結構并最終導致其變性。

(2) C14mimBr 與BSA 內部空腔里的色氨酸殘基的作用方式為疏水相互作用，對色氨酸殘基的淬滅是導致BSA 內源熒光改變的原因。

(3) 通過計算可知，每克BSA 可以結合的C14mimBr的量約為2×10-4mol，不同溫度下的結合量略有差別。

(4) 對比C14mimBr/BSA、TTAB/BSA 體系作用焓可知，在破壞BSA 的二級結構方面，C14mimBr 要強于傳統(tǒng)的陽離子表面活性劑TTAB。