孫秋艷，王彩霞，孫 霞，祈根兄，張興娟，宋莎莎，袁東芳，李叢叢

（山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院/山東省畜禽抗菌藥物使用減量化工程技術(shù)研究中心，山東 濰坊 261061）

互花米草作為保灘護(hù)岸、改良土壤、綠化海灘、改善海灘生態(tài)的植被[1]，由于其莖干密集粗壯、地下根莖發(fā)達(dá)，過度繁殖嚴(yán)重影響了海洋航運、沿海灘涂養(yǎng)殖，破壞了沿海濕地生態(tài)系統(tǒng)和生物多樣性的維持[2-3]。人們一直在探索改善現(xiàn)狀的經(jīng)濟有效的防控措施，但就目前的研究和實踐來看，徹底防控的希望幾乎渺茫，因此從合理開發(fā)利用資源這一角度探討互花米草防治策略變得十分必要[4]。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，互花米草含有多種維生素和礦物質(zhì)，尤其是黃酮類化合物含量較高，黃酮類化合物具有抗炎、降糖、降血脂、增強免疫等功效[5-6]。因此，將互花米草黃酮提取物高值化應(yīng)用到現(xiàn)代畜牧業(yè)，將會帶來生態(tài)和經(jīng)濟雙重效益。目前，互花米草黃酮提取物對肉雞免疫功能影響鮮有報道。為了探究互花米草黃酮提取物對肉雞免疫效果的影響，本試驗以AA 白羽肉雞為實驗動物，飼喂添加互花米草黃酮提取物的基礎(chǔ)日糧，連續(xù)飼喂7 d，各組在7 d 點眼滴鼻、20 d 飲水免疫1 頭羽份的ND La Sota+IB H120 二聯(lián)活疫苗，通過檢測血清中ND-Ab、IBAb、IgM、IgG、IgA、IFN-γ、IL-2、CD4+、CD8+含量和外周血中淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率來評價免疫增強效果，為提高肉雞健康水平和綠色養(yǎng)殖提供依據(jù)，為國家治理互花米草提供全新方案。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 疫苗 雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（La Sota 株+H120 株）購自上海海利生物技術(shù)股份有限公司[批準(zhǔn)文號：獸藥生字（2010）090202038]。

1.1.2 主要試劑 雞新城疫抗體（Newcastle disease antibody，ND-Ab）血凝抑制（Hemagglutination inhibition，HI）試驗用抗原（生產(chǎn)批號：10132101）、陽性血清（生產(chǎn)批號：10152101）與陰性血清（生產(chǎn)批號：10142101）購自青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心；雞 IgM（生產(chǎn)批號：F4554-A）、IgG（生產(chǎn)批號：F4555-A）、IgA（生產(chǎn)批號：F4658-A）、雞傳染性支氣管炎抗體（Infectious Bronchitis antibody，IB-Ab；生產(chǎn)批號：Trx4333-A）、IFN-γ（生產(chǎn)批號：F4564-A）、IL-2（生產(chǎn)批號：F4573-A）、T 淋巴細(xì)胞CD4 亞群（生產(chǎn)批號：F8182-A）、T 淋巴細(xì)胞CD8 亞群（生產(chǎn)批號：F8185-A）酶聯(lián)免疫分析試驗試劑盒購自上海泛柯實業(yè)有限公司。

1.1.3 互花米草黃酮提取物制備 新鮮互花米草9 月份采自昌邑市膠萊河入?？诤５纼?nèi)，清洗干凈，37 ℃烤箱烘烤，超微粉碎機粉碎晾干后采用醇提法提取黃酮。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)參照物，用NaNO2-Al（NO3）3法測定互花米草粗提物中黃酮的含量。提取的黃酮提取物高壓滅菌，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.4 試驗動物 120 只1 日齡AA 白羽肉雞購自山東亞太中慧集團(tuán)有限公司，隨機分成4 組，每組30 只。I～I(xiàn)II 組分別在基礎(chǔ)日糧中添加互花米草黃酮提取物，添加劑量分別為 1、1.5、2 g/kg，IV 組為飼喂基礎(chǔ)日糧對照組（CG），自1 d 開始，連續(xù)飼喂7 d。各組于7 d 點眼滴鼻、20 d 飲水免疫1 頭羽份的新城疫、雞傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（ND La Sota+IB H120 株）。分別于7、14、21、28、35、42 d 從每組隨機抽取5 只雞，檢測前禁食禁水6 h，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。試驗期間所用雞均在山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院籠養(yǎng)雞房嚴(yán)格按照籠養(yǎng)雞飼養(yǎng)管理要求進(jìn)行飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 血清采集 無菌采集雞3.0 mL 心臟血注入離心管中，22 ℃，4 000 r/min 離心25 min，取上清，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 血清中ND-Ab 效價的測定 采用中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 16550-2020）中的血凝抑制試驗（HI）進(jìn)行ND 抗體滴度的檢測，記錄結(jié)果為nlog2。

1.2.3 血清中IB-Ab 效價的測定 按照IB-Ab ELISA 試驗盒操作步驟進(jìn)行檢測，450 nm 波長處測定OD 值，按照試劑盒結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)判斷陰陽性。

1.2.4 血清中IgM、IgG、IgA、IB-Ab、IFN-γ、IL-2、CD4+、CD8+含量的測定 均按照各試驗盒操作步驟進(jìn)行測定。

1.2.5 外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的測定 EDTA-Na真空無菌采血管采雞1 mL 心臟抗凝血，加入1 mL 的無血清RPMI-1640 稀釋，輕輕搖勻，加入4 mL 人的淋巴細(xì)胞分離液（密度為1.085），20 ℃，2 000 r/min 離心20 min，將黃白色霧狀淋巴細(xì)胞層吸出，加入到含有1 mL RPMI-1640 培養(yǎng)液中，20 ℃，2 000 r/min 離心20 min，棄上清，同上離心2 次，棄上清；沉淀細(xì)胞加入含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液懸浮，取一滴細(xì)胞懸液計數(shù)，將細(xì)胞懸液稀釋至2×106個/mL；然后將淋巴細(xì)胞懸液接種至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，0.1 mL/孔，每個樣品重復(fù)4 孔，其中3 孔加入終濃度為50 μg/mL 的刀豆蛋白（ConA），另1 孔做陰性對照，置37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中待淋巴細(xì)胞長至單層取出；每孔加5 mg/L的MTT 溶液30 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，輕輕將上清液棄去，每孔加 DMSO 溶液 200 μL，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀檢測490 nm 下的吸光度值，根據(jù)公式LTR=ODconA 刺激/OD 對照組×100%進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的計算。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 利用SPSS Statistics 19.0 統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多重比較用LSD 法進(jìn)行，試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）并進(jìn)行顯著性比較。

2 結(jié)果

2.1 黃酮提取物的含量

按照方法中所述醇提法提取黃酮，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)參照物，用NaNO2-Al（NO3）3法測定所提取的黃酮提取物含量為37.2%。

2.2 血清中ND-Ab 效價的變化

各組血清中ND-Ab 效價變化見圖1。結(jié)果顯示，I～I(xiàn)II 組血清中ND-Ab 效價顯著高于IV 組（P＜0.05）；II 組血清中ND-Ab 效價顯著高于IV組（P＜0.01），顯著高于I 和III 組（P＜0.05）；III組血清中ND-Ab 效價顯著高于I 組（P＜0.05）；各組血清中ND-Ab 效價均在雞日齡28 d 達(dá)到高峰，隨后逐漸下降。

圖1 血清中ND-Ab 效價的變化

2.3 血清中IB-Ab 效價的變化

各組血清中IB-Ab 效價變化見表1。結(jié)果顯示，所有組IB-Ab OD 值大于0.21，均為陽性。II 組血清中 IB-Ab 效價顯著高于IV 組（P＜0.01），顯著高于I 和III 組（P＜0.05）；II、III 組血清中IB-Ab 顯著高于IV 組（P＜0.05）；III 組血清中IB-Ab 效價顯著高于I 組（P＜0.05）；各組血清中IB-Ab 效價均在雞日齡28 d 達(dá)到高峰。

表1 血清中IB-Ab 效價的變化（判斷標(biāo)準(zhǔn)：陰性＜0.21，陽性＞0.21）

2.4 血清中IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量的變化

各組血清中IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量結(jié)果顯示，I～I(xiàn)II 組血清中 IgM、IgG、IgA、CD4+、CD+8 含量顯著高于 IV 組（P＜0.05）；II 組血清中IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量顯著高于IV 組（P＜0.05）；III 組血清中IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量顯著高于I組（P＜0.05）；各組血清中 IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量在28 d 后達(dá)到高峰，見表2。

表2 血清中IgM、IgG、IgA、CD4+、CD8+含量的變化

2.5 外周血中IL-2、IFN-γ 含量的變化

各組外周血中IL-2、IFN-γ 含量的變化見表3。結(jié)果顯示，II 組外周血中IL-2、IFN-γ 含量顯著高于其他各組（P＜0.05）；IV 組外周血中IL-2、IFN-γ 含量顯著低于其他各組（P＜0.05）；III組外周血中外周血中IL-2、IFN-γ 含量顯著高于I組（P＜0.05）；所有組外周血中IL-2、IFN-γ 含量均在28 d 達(dá)到高峰，然后開始下降。

表3 外周血中IL-2、IFN-γ 含量的變化

2.6 外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的變化

各組外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的變化見表4。結(jié)果顯示，II 組外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于其他各組（P＜0.05）；IV 組外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著低于其他各組（P＜0.05）；III 組外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率顯著高于I 組（P＜0.05）；各組外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率在28 d 達(dá)到高峰。

表4 外周血淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的變化（%）

3 討論與結(jié)論

機體血清抗體效價的變化能夠準(zhǔn)確、直觀地反映體液免疫的狀態(tài)[7]，日糧中添加互花米草黃酮提取物試驗組的血清中ND-Ab、IB-Ab 效價顯著高于空白對照組，可見日糧中添加互花米草黃酮提取物可提高機體的體液免疫水平。

血清免疫球蛋白在機體體液免疫中起到非常重要的作用[8]，IgG、IgM、IgA 代表血清中的免疫球蛋白的水平，含量越高說明機體體液免疫功能越強。禽類血清中IgG 含量遠(yuǎn)高于其它免疫球蛋白，且維持時間長，直接參與體液免疫反應(yīng)，是機體抗感染免疫的主力；IgM 是初次體液免疫反應(yīng)產(chǎn)生的重要免疫球蛋白，一般僅存在于血液內(nèi)，起抗原受體作用；IgA 能凝集顆粒性抗原、中和病毒，是腸道、呼吸道、泌尿生殖道等黏膜抗感染免疫的主力。T 淋巴細(xì)胞CD4 亞群作為Th 細(xì)胞，可刺激B細(xì)胞的分化和抗體的生成，CD8 亞群為Tc 細(xì)胞，在Th 細(xì)胞的輔助下可殺死或溶解靶細(xì)胞，因此CD4+和CD8+含量反映T細(xì)胞活性，對免疫功能的判斷有著重要作用。日糧中添加互花米草黃酮提取物的各組雞血清中IgG、IgM、IgA、CD4+、CD8+含量顯著高于空白對照組，可見日糧中添加互花米草黃酮提取物可提高雞體體液免疫和細(xì)胞免疫水平。

IL-2 能刺激T 輔助細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，并促進(jìn)細(xì)胞因子的繁殖以及刺激T 細(xì)胞在體外生長等功能，含量可間接反映機體的免疫水平[9]。IFN-γ 可促進(jìn)輔助T 淋巴細(xì)胞（Th）分化生成Th1，抑制Th2 的生成，對機體進(jìn)行免疫干預(yù)，實現(xiàn)免疫系統(tǒng)防御功能；可刺激自然殺傷細(xì)胞并增強其殺傷功能，有利于機體清除病毒感染；可直接促進(jìn)細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞成熟，刺激B 細(xì)胞分泌抗體，從而增強機體免疫功能，因此IFN-γ 含量可反映機體免疫水平[10]。日糧中添加互花米草黃酮提取物的各組外周血中IL-2、IFNγ 含量顯著高于空白對照組，可見日糧中添加互花米草黃酮提取物可提高雞體免疫水平。

血液淋巴細(xì)胞在機體的免疫應(yīng)答中具有重要的作用，是反映細(xì)胞免疫的指標(biāo)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加互花米草黃酮提取物的各組淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率都顯著高于空白對照組，可見日糧中添加互花米草黃酮提取物可以提高雞體的細(xì)胞免疫水平。

在雞生長日糧中添加互花米草黃酮提取物可顯著提高雞的免疫功能，本試驗條件下，互花米草黃酮提取物添加劑量為1.5 g/kg 效果最佳。