席曉霞，孫 婧，段天林，田永剛，王 芳，張麗娟，張景科，王德貴

（1.蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)室與設(shè)備管理處醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，甘肅 蘭州 730000；2.蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州）

生命科學(xué)領(lǐng)域的教學(xué)、科研、檢定、安全評(píng)價(jià)和成果鑒定，幾乎都離不開實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的重要作用無可替代。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量直接影響著科學(xué)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物從業(yè)人員的健康。目前評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的主要評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)之一是微生物質(zhì)量控制，定期對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行微生物質(zhì)量監(jiān)測是確保實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的重要手段。近年來，中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量監(jiān)測結(jié)果顯示，沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、嗜肺巴斯德桿菌、肺炎克雷伯桿菌等有陽性結(jié)果的發(fā)生，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量的控制造成困擾[1-8]。

屏障環(huán)境實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物質(zhì)量檢測主要依據(jù)GB 14922.2-2011《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物學(xué)等級(jí)及監(jiān)測》的檢驗(yàn)流程進(jìn)行操作，其主要方法是傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)、生化鑒定。該方法不僅花費(fèi)時(shí)間長、操作步驟相對(duì)繁雜、結(jié)果判定受主觀人為因素影響較大，對(duì)一些難以培養(yǎng)的致病細(xì)菌也無法進(jìn)行檢測[9]。此外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在飼養(yǎng)繁殖過程中容易感染各種易感病原，從而導(dǎo)致疾病的暴發(fā)和流行，嚴(yán)重影響經(jīng)濟(jì)效益和公共衛(wèi)生，存在很多的安全隱患。因此，建立一種快速、敏感、經(jīng)濟(jì)、易于標(biāo)準(zhǔn)化操作的檢測技術(shù)并納入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物檢測國家標(biāo)準(zhǔn)尤為重要。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌檢測的技術(shù)也隨之上升到了基因水平，其檢測、分類的方式日漸增多，特別是基于PCR 的檢測技術(shù)，因其敏感度高、快速且簡便、特異性較強(qiáng)而被廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的細(xì)菌檢測。鑒于PCR 技術(shù)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)研究中的重要性，本文對(duì)PCR 技術(shù)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌檢測中的應(yīng)用進(jìn)展綜述如下。

1 普通PCR 技術(shù)的應(yīng)用

1985 年Mullis 發(fā)明了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，通過體外模擬DNA 合成過程，可以對(duì)目的基因片段進(jìn)行指數(shù)級(jí)擴(kuò)增，使得在體外進(jìn)行核酸片段的無限擴(kuò)增成為可能[10]。1995 年唐瀏英等發(fā)現(xiàn)用PCR 方法檢查血細(xì)胞中的抗原可對(duì)布氏菌感染做到早期診斷，且該技術(shù)具有敏感性高、特異性好、快速等優(yōu)點(diǎn)[11]。2000 年唐永姣等應(yīng)用PCR技術(shù)對(duì)甘肅省阿克賽縣和玉門市的鼠疫樣品進(jìn)行檢測，均呈現(xiàn)陽性，且有較高特異性[12]。

2 多重PCR 技術(shù)的應(yīng)用

多重PCR 是以普通PCR 為基礎(chǔ)，同時(shí)加入多對(duì)引物，可同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)目的基因，從而達(dá)到對(duì)多種病原菌同時(shí)進(jìn)行檢測的目的，具有高靈敏度、高度特異敏感、低成本等優(yōu)點(diǎn)，既能節(jié)省試劑又能縮短檢測時(shí)間[13-14]。

多重PCR 實(shí)現(xiàn)了在同一反應(yīng)體系對(duì)多種病原微生物進(jìn)行檢測或具體類型的鑒別診斷，在臨床上具有很高的應(yīng)用價(jià)值。陸紅玉等建立了適合三種致病菌快速檢測的多重PCR 方法，這三種致病菌分別是沙門氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌以及食蟹猴志賀氏菌。從這三種致病菌混合感染的標(biāo)本中，檢測出不同的病原菌，且細(xì)菌檢出率高于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法，說明該方法具有很高的特異性和檢測靈敏度，且具有很強(qiáng)的實(shí)用性和潛在的發(fā)展力[15]。馮杰等針對(duì)肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌同時(shí)進(jìn)行了培養(yǎng)法和PCR 法檢測。通過比較發(fā)現(xiàn)，PCR 法檢出率略高于培養(yǎng)法，在檢測耗時(shí)方面，采用國標(biāo)推薦的分離培養(yǎng)法，其全程檢測時(shí)間至少需要3～7 d 時(shí)間，而PCR 檢測法僅需1 d 時(shí)間即可完成[16]。王鵬飛等建立了肺支原體、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的多重PCR 檢測方法，該方法對(duì)三種菌的檢測靈敏度為1～10 pg[17]。祝巖波等建立了肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌和綠膿桿菌的多重PCR 檢測方法，用該方法檢測了76 份感染的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物糞便標(biāo)本，其最低檢測靈敏度能達(dá)到10 pg[18]。張?jiān)饺A等建立的4 重PCR 方法能對(duì)同一樣品中的4種致病菌模板進(jìn)行特異性擴(kuò)增，無交叉反應(yīng)，其檢測靈敏度為3～10 ng，該方法也可以從混合感染的病料中特異性地檢測出4 種致病菌[19]。

3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)的應(yīng)用

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測技術(shù)是利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，最終對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析。在PCR 反應(yīng)過程中，隨著反應(yīng)產(chǎn)物的累積，對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)。通過收集每一個(gè)循環(huán)的熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，得到熒光擴(kuò)增曲線圖。

王立鵬等分別用細(xì)菌分離培養(yǎng)生化鑒定法和Dole qPCR 法對(duì)國內(nèi)多家機(jī)構(gòu)提供的SPF 級(jí)小鼠和大鼠進(jìn)行檢測，后者不僅檢岀培養(yǎng)法檢測的所有陽性樣本，而且陽性檢岀率遠(yuǎn)高于培養(yǎng)法，Dole qPCR 方法直接檢測組織樣本的敏感度和特異度比傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法均大大提高[20]。陽成波等建立了一種基于TaqMan 探針的實(shí)時(shí)定量PCR方法，建立了一種用于快速、高效的定量檢測空腸彎曲菌的方法[21]。

4 巢式PCR 技術(shù)的應(yīng)用

巢式PCR 反應(yīng)技術(shù)一般需要兩對(duì)PCR 引物。第一對(duì)引物用于普通PCR 擴(kuò)增。第二對(duì)引物用于結(jié)合在第一次PCR 產(chǎn)物的內(nèi)部，進(jìn)行二次擴(kuò)增。該方法的優(yōu)勢(shì)是最大程度地降低擴(kuò)增錯(cuò)誤率，使得巢式PCR 保持了較高的特異性。

潘雅君等為了檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物常見肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜肺巴斯德桿菌和綠膿桿菌，提出一種可更準(zhǔn)確、靈敏、快速、簡便的多重巢式PCR 方法。根據(jù)待檢微生物16S rDNA序列的保守區(qū)和可變區(qū)分別設(shè)計(jì)通用引物和特異引物，通過兩種引物長短差異化創(chuàng)新設(shè)計(jì)，將模板富集和特異片段擴(kuò)增兩個(gè)過程整合為單個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)的一步PCR 反應(yīng)。結(jié)果表明，多重巢式PCR 方法能夠在標(biāo)準(zhǔn)株DNA 混合模板中同時(shí)擴(kuò)增出4 條待檢測片段，而在陰性對(duì)照組中未檢測出任何片段。多重巢式PCR 方法在實(shí)際檢測應(yīng)用中能夠成功檢測出細(xì)菌感染陽性樣本，且未擴(kuò)增出其他微生物的特異性條帶。建立的多重巢式PCR 體系可以同時(shí)檢測實(shí)驗(yàn)動(dòng)物咽拭子等臨床樣本中的多種病原菌，與常規(guī)多重PCR 方法相比，該方法具有特異性和靈敏度高、操作簡便、節(jié)省時(shí)間等優(yōu)點(diǎn)[22]。

5 數(shù)字PCR 技術(shù)及其應(yīng)用

數(shù)字PCR 技術(shù)是一種能夠進(jìn)行絕對(duì)定量的核酸檢測技術(shù)，目前應(yīng)用廣泛的是微滴式數(shù)字PCR，其工作原理是把DNA 稀釋至較低濃度，形成微滴狀態(tài)，隨后開始PCR 擴(kuò)增，通過計(jì)算陽性微滴的數(shù)目，依據(jù)泊松分布從而計(jì)算出樣本中的DNA 分子數(shù)[23]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，與熒光定量PCR 相比，該技術(shù)成本低、靈敏度高、定量不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)反應(yīng)抑制物的耐受能力也更高，可實(shí)現(xiàn)DNA 的絕對(duì)定量。數(shù)字PCR 對(duì)核酸含量較低的樣品檢測準(zhǔn)確率和靈敏度均較高[24-25]。

目前實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌檢測的“金標(biāo)準(zhǔn)”仍然是熒光定量PCR 技術(shù)，但依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct值，而在繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)缺乏統(tǒng)一的計(jì)量標(biāo)準(zhǔn)。然而數(shù)字PCR 技術(shù)綜合了熒光定量PCR 和基因芯片的高通量的高精準(zhǔn)性，并且不依賴標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定量，實(shí)現(xiàn)了單分子DNA 絕對(duì)定量，能夠?qū)δ繕?biāo)基因的濃度進(jìn)行精準(zhǔn)分析，目前已被科研人員大量應(yīng)用于難培養(yǎng)和高風(fēng)險(xiǎn)的致病菌檢測研究中，如沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副豬嗜血桿菌、結(jié)核分支枝桿菌、豬鏈球菌、豬胸膜肺炎放線桿菌、產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌等[26-33]。

6 討論

PCR 基因擴(kuò)增技術(shù)除了用于食品安全和畜牧業(yè)檢測，還廣泛應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌學(xué)的檢測。然而PCR 技術(shù)也存在很多影響因素，一方面PCR 技術(shù)提高檢測靈敏度的同時(shí)，對(duì)其檢測中的錯(cuò)誤也有放大作用，實(shí)驗(yàn)過程中的隨機(jī)誤差易導(dǎo)致假陽性和假陰性結(jié)果的出現(xiàn)；另一方面，處理樣本會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境造成污染，電泳的EB 染料會(huì)危害人的健康，因此在操作過程中要做好防護(hù)，嚴(yán)格按實(shí)驗(yàn)室的分區(qū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于PCR 檢測結(jié)果的報(bào)告要慎重，必須在有相應(yīng)嚴(yán)格質(zhì)控措施（如陰、陽性質(zhì)控等）的情況下重復(fù)測定，方可作出報(bào)告。

針對(duì)PCR 技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)，目前建立了許多檢測病原菌的新型檢測方法，均是將兩種或兩種以上的方法相結(jié)合，如PCR 技術(shù)與LAMP、基因芯片等技術(shù)結(jié)合，取長補(bǔ)短，提高動(dòng)物病原檢測的靈敏性、可重復(fù)性，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)法操作繁瑣、耗時(shí)費(fèi)力、不適用于無法培養(yǎng)的微生物、檢測周期較長、對(duì)檢測人員專業(yè)技能要求較高等缺點(diǎn)[34-35]，通過一次操作完成多種病原體的檢測，實(shí)現(xiàn)靈敏、特異、快速和高效的目的，實(shí)現(xiàn)了大批量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原樣本的檢測、混合感染樣品基質(zhì)中的多種微生物的有效檢測、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測的標(biāo)準(zhǔn)化，這些新的檢測方法必將在未來實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病原檢測中發(fā)揮很好的檢測作用。PCR 檢測方法在效率和敏感性上均具有較大優(yōu)勢(shì)，適合用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌感染的快速診斷和大規(guī)模的質(zhì)量篩查[36-39]。

目前多種多重PCR 系統(tǒng)逐步應(yīng)用于臨床，檢測耗時(shí)3～10 h，成為當(dāng)下病原菌快速診斷的主流工具[40-47]。其中在稀有突變樣本檢測、微量核酸樣本檢測、表達(dá)量差異鑒定等方面，數(shù)字PCR表現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)非常明顯。在基因表達(dá)研究、microRNA 研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、單細(xì)胞基因表達(dá)、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定等諸多方面具有廣闊研究前景[48-49]。

PCR 技術(shù)因檢測快速、高效、靈敏、特異等優(yōu)點(diǎn)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物細(xì)菌檢測方面具有較高的價(jià)值，已作為一個(gè)較為成熟的技術(shù)進(jìn)行廣泛的推廣應(yīng)用，尤其適合于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物大規(guī)模的質(zhì)量檢測和細(xì)菌感染的快速診斷。但目前尚未納入國家標(biāo)準(zhǔn)，還需要進(jìn)一步對(duì)其方案進(jìn)行改進(jìn)、細(xì)化、具體化、合理化。相信在不遠(yuǎn)的將來，PCR 技術(shù)將越來越成熟，盡早納入國家標(biāo)準(zhǔn)，應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量檢測等工作。