張永香 兆豐華生物科技（福州）有限公司 福州 350014

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的豬的一種繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)性的高度接觸性傳染病。 臨床上主要表現(xiàn)為妊娠母豬的繁殖障礙和各個年齡段豬只的呼吸道疾病，并導致仔豬死亡率升高，生長發(fā)育受阻，高死亡率，既能垂直傳播又能水平傳播[1-2]，疫苗免疫接種是預(yù)防該病的主要措施之一。 對于疫苗生產(chǎn)企業(yè)， 提高病毒滴度和提升疫苗的產(chǎn)能是一個極其重要的目標。 而豬繁殖與呼吸綜合征病毒（CH-1a 株）在Marc-145 細胞中培養(yǎng)大多數(shù)采用的是單次的接種與收獲，且病毒的培養(yǎng)需要添加一定量的血清，使得疫苗的產(chǎn)能和品質(zhì)都受到一定程度的限制。

本研究在豬繁殖與呼吸綜合征病毒 （CH-1a株）傳統(tǒng)培養(yǎng)工藝單次接種收獲的基礎(chǔ)上，采用高度敏感的Marc-145 克隆細胞株培養(yǎng)病毒， 通過優(yōu)化維持液中不同pH 值、 不同血清濃度等培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)以提高病毒滴度和降低臨床副反應(yīng)的發(fā)生， 同時對接毒收獲工藝進行優(yōu)化以增加病毒的收次， 為提高疫苗的產(chǎn)品品質(zhì)和增加產(chǎn)能提供參考。

1 材 料

1.1 細胞與種毒 Marc-145 克隆細胞株與PRRSV（CH-1a 株）種毒均由兆豐華生物科技（福州）有限公司保存。

1.2 主要耗材 DMEM 培養(yǎng)基、胰蛋白酶，均購自GIBCO 公司；新生牛血清，購自呼和浩特市草原綠野生物工程材料有限公司；96 孔細胞板， 購自美國Corning 公司；國產(chǎn)15 L 細胞培養(yǎng)玻璃轉(zhuǎn)瓶，購自江蘇海門市天龍實驗器材廠；Perfect Start Green qPCR Super Mix、RNA viral kit，購自O(shè)mega 公司；AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、Random primer、DL2000 DNA marker 和d NTPs（2.5 mmol/L），均購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR Master Mix（2×），購自天根生化科技有限公司。

1.3 主要儀器 倒置顯微鏡為37XB 公司生產(chǎn)；pHS-3C pH 計為雷磁公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱為三洋公司產(chǎn)品。

2 方 法

2.1 在不同pH 值維持液中培養(yǎng) 待15 L 轉(zhuǎn)瓶細胞長成致密單層后， 棄去培養(yǎng)液加入等量的含2%病毒液的維持液。 維持液pH 分別為7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.2、8.5，置37 ℃潔凈溫室培養(yǎng)。

2.2 在不同血清濃度維持液中培養(yǎng) 待15 L 轉(zhuǎn)瓶細胞長成致密單層后， 棄去培養(yǎng)液加入等量的含2%病毒液的維持液。維持液中血清濃度分別為0%、1%、2%，置37 ℃潔凈溫室培養(yǎng)。 做3 個平行重復(fù)試驗，結(jié)果取3 次的平均值。

2.3 病毒在Marc-145 克隆細胞上的產(chǎn)毒曲線 待15 L 轉(zhuǎn)瓶細胞長成致密單層后，棄去培養(yǎng)液加入等量的含2%病毒液的維持液， 對維持液中無血清培養(yǎng)進行產(chǎn)毒曲線繪制。

2.4 產(chǎn)毒工藝優(yōu)化方案 根據(jù)PRRSV（CH-1a 株）在Marc-145 細胞上轉(zhuǎn)瓶的產(chǎn)毒特性進行工藝優(yōu)化。正常生產(chǎn)工藝在細胞接毒后只進行一次收獲，而本試驗嘗試進行連續(xù)兩次收獲， 即病毒培養(yǎng)24～28 h 左右收獲一次，然后添加相應(yīng)量的維持液繼續(xù)進行培養(yǎng)，直至細胞病變達70%～80%進行第二次收獲。 每組做3 個平行重復(fù)試驗， 結(jié)果取3 次的平均值。 試驗方案與分組見表1。

表1 不同優(yōu)化工藝方案

2.5 病毒滴度測定 用含1%血清維持液的DMEM將待測樣品進行10 倍系列稀釋至10-8，對8 個稀釋度接種至長滿單層Marc-145 克隆細胞的96 孔板中。 同時設(shè)未接毒的細胞作為陰性對照， 按Reed-Muench 法計算TCID50。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同pH 對Marc-145 克隆細胞培養(yǎng)病毒增殖的影響 Marc-145 細胞培養(yǎng)最適pH 為7.0～7.3，其中pH7.2 為最佳[3]。 而對PRRSV 的增殖，維持液pH7.8～8.2 時收獲的病毒液滴度最高，見圖1。 這可能與接種時Marc-145 克隆細胞狀態(tài)有關(guān)， 接毒時致密的Marc-145 克隆細胞本身易產(chǎn)生酸性代謝產(chǎn)物。

圖1 維持液中不同pH 對Marc-145 克隆細胞培養(yǎng)病毒滴度的影響

3.2 維持液中不同血清濃度對病毒增殖的影響在0%血清濃度維持液中接毒培養(yǎng)20 h 時， 病毒含量可達7.69lgTCID50/mL，培養(yǎng)至44 h 病毒含量可達8.28lgTCID50/mL， 與1%血清培養(yǎng)44 h 時的病毒含量接近， 說明該病毒在Marc-145 細胞上的培養(yǎng)可實現(xiàn)無血清培養(yǎng)。 在1%血清濃度維持液中接毒培養(yǎng)24 h 后， 病毒滴度增長快且很快達到最高值，而在2%血清濃度維持液中病毒增殖和釋放相對較慢， 說明維持液中1%血清濃度比較適合該病毒的培養(yǎng)。 見表2。

表2 維持液中血清濃度對病毒增殖的影響

3.3 病毒在Marc-145 克隆細胞上的產(chǎn)毒曲線 產(chǎn)毒曲線繪制試驗， 維持液中不含血清。 從產(chǎn)毒曲線可知（見圖2），病毒含量維持較高水平的時間段是在接毒后24～44 h，可維持20 h 左右，且Marc-145克隆細胞在接毒后24～28 h 未見明顯病變細胞脫落，這為實現(xiàn)病毒的多次收獲提供參考依據(jù)。

圖2 PRRSV 在Marc-145 克隆細胞上的產(chǎn)毒曲線

3.4 產(chǎn)毒工藝優(yōu)化效果3.4.1 優(yōu)化前后病毒滴度 維持液中無血清培養(yǎng)，24～28 h 更換維持液后一收、 二收的混合液病毒滴度與原液病毒滴度差異不大。 一收時的全換液與換2/3 液體，其二收時病毒滴度未見明顯差異，說明一收時可實現(xiàn)全換液（見表3）。

表3 優(yōu)化前后病毒滴度

3.4.2 優(yōu)化前后病毒載量檢測 優(yōu)化前后病毒載量與病毒滴度呈正相關(guān)，且優(yōu)化前（A 組）的原液病毒載量與優(yōu)化后（B 組、C 組）的混合液病毒載量差異不大。B 組、C 組一收時的病毒載量與A 組原液的病毒載量差異不大，說明PRRSV 在Marc-145 克隆細胞上培養(yǎng)達到一定量后， 其病毒核酸的降解與產(chǎn)生是一個動態(tài)平衡的過程（見表4）。

表4 優(yōu)化前后病毒載量檢測結(jié)果

4 討 論

從PRRSV 在Marc-145 克隆細胞上的優(yōu)化培養(yǎng)工藝看， 較高的牛血清濃度對PRRSV 在Marc-145 克隆細胞上的增殖不具有正向促進作用。 為了提高病毒滴度，應(yīng)嚴格控制培養(yǎng)液中血清的含量。從PRRSV 在Marc-145 克隆細胞上有血清與無血清培養(yǎng)結(jié)果對比來看， 無血清培養(yǎng)的病毒滴度也能滿足產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的需求， 并且還能最大程度降低疫苗中的血清蛋白， 后期還可嘗試使用無血清培養(yǎng)基進一步提高病毒的滴度。 試驗還表明維持液不同pH 值對PRRSV 在Marc-145 克隆細胞上的增殖也有較大的影響，維持液pH7.8～8.2 有利于病毒的增殖，這可能與接種時致密的Marc-145 克隆細胞產(chǎn)生大量代謝產(chǎn)物有關(guān)。

從產(chǎn)毒工藝優(yōu)化結(jié)果看，24～28 h 換液的不管是全換液還是2/3 換液的其病毒含量和病毒載量差異不顯著。 同時，從病毒載量結(jié)果看，B 組、C 組接毒后24～28h 的病毒載量與A 組原液病毒載量相比差異不大，說明PRRSV 在Marc-145 克隆細胞上達到一定量后， 其病毒核酸的降解與產(chǎn)生是一個動態(tài)平衡的過程。 是否預(yù)示著整個完整的病毒粒子也與核酸一樣，其降解與產(chǎn)生是一個動態(tài)平衡過程，需用更加準確的檢測方法進行驗證。 從工藝優(yōu)化的病毒滴度與病毒載量看， 在產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)時可以直接采用全換液的方式，不僅增加了一倍的病毒液收獲量，而且還便于操作。