陳 宇,趙 雅,,王 林

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽 712046;2.西安市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,陜西 西安 710002)

眼表是位于上下眼瞼緣灰線之間的眼球表面的全部黏膜上皮,包括角膜上皮、結(jié)膜上皮、淚器、淚道等[1]。眼表本身存在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的微環(huán)境,能夠刺激機(jī)體啟動(dòng)免疫應(yīng)答對(duì)抗病原菌入侵,成為眼表抗炎防線的主力軍[2]。眼表菌群處在一種動(dòng)態(tài)平衡中,在某些內(nèi)外界因素(包括衰老、佩戴隱形眼鏡、植入角膜假體、局部使用抗生素等)的干擾下,這種平衡狀態(tài)會(huì)被打破,導(dǎo)致定植在眼表的細(xì)菌進(jìn)入眼內(nèi)大量增殖[3],繼而成為感染性眼病的主要病原菌。眼部發(fā)生感染會(huì)給眼球組織帶來損傷,損害視覺功能和嚴(yán)重影響心理健康。因此,明確眼表常見定植菌群分布并且有針對(duì)性的應(yīng)用抗生素對(duì)治療眼部感染至關(guān)重要。本研究收集西安市第一醫(yī)院2021年7月至2022年9月健康體檢人群眼結(jié)膜囊標(biāo)本共93例,通過對(duì)眼表定植菌群分布特征及常見細(xì)菌抗生素耐藥性進(jìn)行分析,為臨床眼部感染的早期經(jīng)驗(yàn)用藥提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取西安市第一醫(yī)院2021年7月至2022年9月93例健康體檢人群作為研究對(duì)象,其中男45例,女48例。納入標(biāo)準(zhǔn):所有研究對(duì)象過去一個(gè)月未使用抗生素、無淚道炎、淚囊炎、瞼緣炎等眼部疾病、無干燥綜合征、糖尿病等影響眼表的全身性疾病;研究對(duì)象對(duì)本研究均知情同意。標(biāo)本由西安市第一醫(yī)院眼科醫(yī)師收集后送至檢驗(yàn)科微生物室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定及體外藥敏試驗(yàn)。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器與試劑:基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(德國布魯克公司),Vitek 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌藥敏分析儀(法國生物梅里埃公司),Vitek 2 配套藥敏卡GP67藥敏板卡(最低抑菌濃度MIC法),37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱,培養(yǎng)基為哥倫比亞血平板、巧克力平板(鄭州安圖公司),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司),電泳儀(北京六一儀器廠),Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物有限公司),2×HieffTM PCR Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司),耐藥基因分子檢測(cè)陰性對(duì)照菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923,陽性對(duì)照菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫ATCC。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定:嚴(yán)格遵循《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》操作指導(dǎo),將采集的標(biāo)本接種在哥倫比亞血平板培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基中,置于35 ℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72 h。根據(jù)細(xì)菌菌落特點(diǎn)和革蘭染色結(jié)果進(jìn)行初步鑒定,再采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.2.3 藥敏試驗(yàn):采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)藥敏分析儀進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果判定嚴(yán)格按照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2.4 mecA基因檢測(cè):將收集凍存的菌株常溫復(fù)蘇,接種于血瓊脂平板上,過夜孵育。采用生工Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA提取,引物交由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)合成,上游引物:5’-ACGAAGAATATAATAAATTAACCGAA-3’,下游引物:5’-GATTTGCCAATTAAGTTTGCAT-3’。反應(yīng)體系共20 μl:DNA模板1 μl,上、下游引物各1 μl,Master PCR Mix 10 μl,ddH2O 7 μl。熱循環(huán)參數(shù):95 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性20 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。試驗(yàn)分別采用金黃色葡萄球菌ATCC29213和ATCC25923標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽性對(duì)照和陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物通過2.0%瓊脂糖凝膠100 V電泳30 min,最終在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)資料以[例 (%)]表示,采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)膜囊標(biāo)本所分離的細(xì)菌分布和構(gòu)成比 對(duì)93例健康體檢人群結(jié)膜囊標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng),87例培養(yǎng)陽性,陽性率93.55%,其中39例培養(yǎng)出一種細(xì)菌,剩余48例培養(yǎng)出兩種或兩種以上細(xì)菌。共分離出168株細(xì)菌,G+菌150株(89.29%),G-菌15株(8.93%),真菌3株(1.79%)。具體菌株分布結(jié)果見表1。

表1 87例眼部結(jié)膜囊標(biāo)本的細(xì)菌分布和構(gòu)成比(n=168)

2.2 主要革蘭陽性球菌耐藥情況 所分離的主要凝固酶陰性葡萄球菌(表皮葡萄球菌、人葡萄球菌)對(duì)多種抗生素呈現(xiàn)出耐藥性,未發(fā)現(xiàn)對(duì)莫西沙星、利福平和萬古霉素耐藥的菌株,75株凝固酶陰性葡萄球菌有39株為耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(Methicillin-resistant coagulase-negative Staphylococci,MRCoNS),占52.00%(39/75)。主要革蘭陽性球菌耐藥情況,見表2。

表2 眼部常見革蘭陽性球菌耐藥情況

2.3 MRCoNS與MSCoNS兩組耐藥率比較 MRCoNS對(duì)抗生素的耐藥率明顯高于甲氧西林敏感凝固酶陰性葡萄球菌(Methicillin-susceptible coagulase-negative staphylococci,MSCoNS),其中青霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、克林霉素、復(fù)方新諾明五種藥物耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見表3。

表3 MRCoNS與MSCoNS耐藥率比較[例(%)]

2.4 眼部和同期其他部位所分離凝固酶陰性葡萄球菌耐藥率比較 統(tǒng)計(jì)藥敏結(jié)果顯示,非眼部所分離的凝固酶陰性葡萄球抗生素耐藥率及MRCoNS所占比例總體高于眼部分離株,兩者耐藥率均較高的抗生素有青霉素、克林霉素和紅霉素。兩組對(duì)喹諾酮類藥物、慶大霉素、復(fù)方新諾明耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(均P<0.05)。見表4。

表4 眼部和非眼部葡萄球菌耐藥率比較[例(%)]

2.5 耐藥基因mecA檢測(cè)結(jié)果 耐甲氧西林耐藥基因mecA經(jīng)PCR擴(kuò)增出664 bp大小的DNA片段,對(duì)75株凝固酶陰性葡萄球菌mecA基因進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示40株mecA基因陽性,其中39例與Vitek 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌藥敏分析儀苯唑西林耐藥所預(yù)測(cè)的MRCoNS一致,1例與儀器檢測(cè)結(jié)果顯示的苯唑西林敏感不符,符合率為97.5%。剩余35株菌株mecA基因陰性,與儀器所檢測(cè)的苯唑西林敏感均相符。試驗(yàn)所設(shè)立的陰陽對(duì)照結(jié)果與預(yù)期一致,耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌mecA耐藥基因PCR產(chǎn)物電泳圖見圖1。

1～4:mecA陽性菌株;5:陽性對(duì)照;6:陰性對(duì)照

3 討 論

眼表核心微生物群是由凝固酶陰性葡萄球菌、棒狀桿菌、丙酸桿菌等革蘭陽性菌為主的多種細(xì)菌共同組成。凝固酶陰性葡萄球菌是定植在人體皮膚黏膜上一種常見的條件致病菌,也是淚囊炎、結(jié)膜炎術(shù)后眼內(nèi)炎等感染性眼病的主要致病菌[4-7]。在本研究中,結(jié)膜囊標(biāo)本培養(yǎng)陽性率是93.55%,高于國內(nèi)外報(bào)道的正常結(jié)膜囊樣本中細(xì)菌檢出率為20.60%～87.00%的水平,造成這種差異可能與培養(yǎng)時(shí)間、納入研究對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)及地理位置不同有關(guān)。在眼部定植菌分布特征方面,我們的研究結(jié)果與國內(nèi)外其他一些研究結(jié)果基本一致[8-9],葡萄球菌是眼表主要定植菌,革蘭陰性菌在我們的研究結(jié)果中占比較小,以流感嗜血桿菌和不動(dòng)桿菌為主。

隨著新型有效的藥物不斷被推出,供眼科醫(yī)師治療眼表疾病時(shí)可選擇的藥物種類也相應(yīng)增加,但由于多重耐藥菌株在全球范圍內(nèi)普遍流行[10],這可能會(huì)降低抗生素治療感染性眼病的有效性[11]。我們的藥敏結(jié)果提示眼部凝固酶陰性葡萄球菌(表皮葡萄球菌和人葡萄球菌)對(duì)青霉素、苯唑西林、紅霉素、克林霉素的耐藥率均超過50.00%,對(duì)眼科常用藥物環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和復(fù)方新諾明的耐藥率在20%左右。同時(shí)對(duì)不同部位所分離的凝固酶陰性葡萄球菌耐藥率進(jìn)行比較,非眼部葡萄球菌對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥率遠(yuǎn)高于眼部且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有關(guān)細(xì)菌耐藥性的報(bào)道在不同地區(qū)差異性比較大,這可能與用藥習(xí)慣和生活環(huán)境有關(guān)。例如,有研究[12-14]報(bào)道,葡萄球菌對(duì)左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和莫西沙星的敏感率低,Laura 等[12]報(bào)道中指出,葡萄球菌對(duì)甲氧西林和紅霉素的耐藥率較高。本研究未發(fā)現(xiàn)眼部凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)莫西沙星、利福平和萬古霉素耐藥,這提示眼科醫(yī)師優(yōu)先使用這些藥物治療凝固酶陰性葡萄球菌引起的眼部感染可能會(huì)有比較理想的治療效果。目前,雖還未有眼部分離出耐萬古霉素葡萄球菌的報(bào)道[15-18],但隨著高級(jí)別抗生素在臨床上的使用越來越多,不免使我們對(duì)萬古霉素治療效果產(chǎn)生擔(dān)憂,這需引起臨床醫(yī)師的足夠重視,按照藥敏結(jié)果合理選擇藥物。

有文獻(xiàn)[15]指出,MRCoNS菌株會(huì)明顯增加葡萄球菌對(duì)其他抗生素的耐藥性。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)MRCoNS組對(duì)抗生素的耐藥率明顯高于MSCoNS組,其中青霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、克林霉素、復(fù)方新諾明五種藥物耐藥性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。MRS耐藥機(jī)制多由mecA基因介導(dǎo),其基因表達(dá)產(chǎn)物是低親和力的青霉素結(jié)合蛋白2a,會(huì)降低與β-內(nèi)酰胺類藥物的親和力(五代頭孢菌素除外),由它引起的眼部感染除增加治療難度外也可能會(huì)導(dǎo)致患者預(yù)后不良,同時(shí)此類細(xì)菌易在院內(nèi)進(jìn)行傳播,也是院感重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的耐藥菌[19]。我們研究中采用的PCR檢測(cè)mecA基因和VITEK 2 Compact儀器法對(duì)MRCoNS苯唑西林耐藥性預(yù)測(cè)的結(jié)果符合率是97.5%,其中1例mecA基因陽性菌株經(jīng)儀器檢測(cè)顯示對(duì)苯唑西林敏感,這可能與苯唑西林是誘導(dǎo)mecA基因表達(dá)的一種弱誘導(dǎo)劑以及mecA第二啟動(dòng)子的錯(cuò)義突變和單一突變有關(guān)[20],當(dāng)“隱形”MRCoNS接觸到β-內(nèi)酰胺類抗生素時(shí),便可能轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨饶退幘?所以將檢測(cè)耐藥表型和mecA基因或青霉素結(jié)合蛋白2a的方法聯(lián)合起來對(duì)篩選或鑒定耐甲氧西林葡萄球菌尤為重要。

綜上所述,G+球菌為眼表的主要定植菌,其中凝固酶陰性葡萄球菌為主要優(yōu)勢(shì)菌,我們應(yīng)加強(qiáng)對(duì)葡萄球菌特別是MRS耐藥性的監(jiān)測(cè),指導(dǎo)臨床根據(jù)藥敏結(jié)果合理規(guī)范使用抗生素。