丁海 田波 李想 王金子 張培 常文舉

骨質(zhì)疏松是因骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成和破骨細(xì)胞引起的骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡失調(diào)，表現(xiàn)為骨吸收增強(qiáng)，骨形成減弱，臨床表現(xiàn)為骨密度下降，骨折風(fēng)險(xiǎn)增加［1］。目前臨床上關(guān)于治療骨質(zhì)疏松的藥物，僅單方面抑制骨吸收或者促進(jìn)骨形成，導(dǎo)致治療效果有限［2］。另一方面，這些藥物同時(shí)伴隨著相應(yīng)的副作用，如雙膦酸鹽類和地舒單抗常導(dǎo)致肌肉疼痛，嚴(yán)重的可導(dǎo)致下頜骨壞死［3］；特立帕肽治療易導(dǎo)致高鈣血癥，有引起骨肉瘤的風(fēng)險(xiǎn)［4］。目前最新一代的抗骨質(zhì)疏松藥物羅莫珠單抗也因?yàn)闈撛诘脑黾有难芗白渲邢嚓P(guān)事件風(fēng)險(xiǎn)，限制了其在臨床的廣泛應(yīng)用［5-6］。

丹 酚 酸B（salvianolic acid B，SalB，分 子 式C36H30O16）是丹參中最具代表性的成分，具有較強(qiáng)的清除氧自由基活性，臨床可利用這一特性治療多種慢性疾?。?-8］。文獻(xiàn)報(bào)道SalB對(duì)成骨細(xì)胞的氧化損傷具有保護(hù)作用，從而促進(jìn)其成骨分化［9-12］。但SalB的化學(xué)穩(wěn)定性和生物利用度較差，導(dǎo)致其體內(nèi)治療作用有限［13］。我們之前的研究也證實(shí)通過SalB 灌胃的方式治療去卵巢骨質(zhì)疏松小鼠模型，治療效果欠佳［14］。細(xì)胞膜納米顆粒作為新一代的藥物載體，在增加藥物循環(huán)時(shí)間、提高靶向性、增加穩(wěn)定性方面具有一定的優(yōu)勢(shì)［15-16］。而破骨前體細(xì)胞膜納米顆粒（NPs）不僅能躲避內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)的清除，同時(shí)也通過其表面的RANK 蛋白發(fā)揮抑制破骨細(xì)胞的作用［17］。為此，本研究擬使用NPs負(fù)載SalB，評(píng)估其在促進(jìn)成骨分化、抑制破骨細(xì)胞形成方面的作用。

材料與方法

一、細(xì)胞培養(yǎng)

小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW 264.7）、小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞（MC3T3-E1）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生物科學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。5只6～8周齡C57BL/6小鼠購(gòu)買于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。RAW 264.7細(xì)胞置于DMEM 培養(yǎng)基（含10% FBS、100 U/mL 青霉素、100 mg/L 鏈霉素）培養(yǎng)；MC3T3-E1 細(xì)胞于α-MEM培養(yǎng)基（含10%FBS、100 U/mL青霉素、100 mg/L鏈霉素）培養(yǎng)，每3 天更換1 次成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10 nmol/L 地塞米松、50 mg/mL 抗壞血酸、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

二、主要試劑與儀器

SalB、β甘油磷酸鈉、L-抗壞血酸（上海麥克林生化科技有限公司）；BCIP/NBT 堿性磷酸酯酶（ALP）顯色試劑盒、茜素紅S 染色液（2%，pH=4.2）、地塞米松（碧云天生物技術(shù)研究所，中國(guó)）；青霉素-鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶、低糖DMEM 培養(yǎng)基（Hyclone，美國(guó)）；胎牛血清、α-MEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；重組小鼠M-CSF 蛋白、重組小鼠核因子-κB受體激活因子配體（RANKL）（R&D SYSTEMS，美國(guó)）；RNA 提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Bio-Rad，美國(guó)）；抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色試劑盒（Sigma-Alrdich，美國(guó)）；噻唑藍(lán)（蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司）；引物設(shè)計(jì)由蘇州金唯智生物科技有限公司完成。

場(chǎng)發(fā)射透射電子顯微鏡Tecnai G2 F20（FEI 公司，美國(guó)），共聚焦顯微鏡Zeiss800、熒光倒置顯微鏡（Carl-Zeiss，德國(guó)），多功能酶標(biāo)儀Varioskan Flash、離心機(jī)Micro 21R（Thermo，美國(guó)），納米粒度及ZETA電位儀NANO ZS90（Malvern，英國(guó)），Real-time PCR儀CFX96（Bio-Rad，美國(guó)），MicroCT Skyscan1176（Bruker，比利時(shí)），超聲波細(xì)胞破碎儀LD-250T（常州零點(diǎn)儀器設(shè)備有限公司，中國(guó)），超微量核酸蛋白測(cè)量?jī)xDS 11FX+（DENOVIX，美國(guó)），Ultimate 3000RS高效液相色譜儀（ThermoFisher，美國(guó)）

三、實(shí)驗(yàn)方法

（一）SalB-NPs的制備與表征

將1×107個(gè)RAW 264.7細(xì)胞重懸于PBS中，使用LD-250T 超聲波細(xì)胞破碎儀將細(xì)胞置于冰上裂解100 s（30 個(gè)循環(huán)，Ton=3 s，Toff=7 s），4 000 rpm×10 min，收集上清，14 800 rpm×20 mim，PBS 洗2 遍，取沉淀。使用BCA試劑盒測(cè)量膜蛋白濃度，然后重懸于1 mL PBS 中，使用擠出器擠出均勻大小的膜囊泡。將5 mmol/L SalB 溶液與獲得的RAW 264.7 細(xì)胞膜共孵育，獲得均勻的負(fù)載SalB的納米顆粒（SalBNPs）。將SalB-NPs 稀釋后滴入碳膜涂層的銅網(wǎng)晾干后，滴入磷鎢酸負(fù)染，然后滴入超純水洗滌，放入場(chǎng)發(fā)射電鏡觀察納米粒形貌；使用納米粒度及ZETA電位儀測(cè)量SalB-NPs的粒徑；采用高效液相色譜法測(cè)定SalB-NPs上SalB的負(fù)載量和藥物釋放率。

（二）Western Blot實(shí)驗(yàn)

將RAW 264.7細(xì)胞經(jīng)超聲破碎、離心、擠出獲得均一的RAW 264.7 細(xì)胞膜，于冰上裂解40 min，15 000 rpm 離心25 min，使用BCA 法蛋白定量后，加入SDS煮沸5 min變性獲得蛋白樣品。使用SDS-PAGE（10%）分離蛋白后將其轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。用5%脫脂乳在室溫下封閉2 h，在4 ℃下與特異性一抗孵育過夜：RANK 抗體（Abmart，PK05726S，1∶1 000）。使用TBST洗滌膜3次后，在相應(yīng)的二抗溶液孵育1 h。使用Image Quant LAS 4000（GE Healthcare，Silverwater，澳大利亞）和增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物（NCM Biotech，中國(guó)）檢測(cè)抗體的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。

（三）細(xì)胞活力檢測(cè)

將RAW 264.7 細(xì)胞和MC3T3-E1 細(xì)胞以5 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96 孔板中，每組設(shè)4 個(gè)副孔，培養(yǎng)24 h，然后分別使用不同濃度（0、0.5、1.5、10、15 mmol/L）的SalB 處 理RAW 264.7 細(xì) 胞 和MC3T3-E1細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，每孔加入10 mL CCK8溶液，檢測(cè)SalB對(duì)細(xì)胞活力的影響。

（四）破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化及TRAP染色

將小鼠安樂死后，收集雙側(cè)股骨及脛骨，沖洗髓腔，將獲得的骨髓細(xì)胞接種于含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 mg/mL 鏈霉素的α-MEM 中，并在5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中過夜。然后收集非貼壁細(xì)胞，以1×104個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種于96 孔板中。按照處理方式不同，分為對(duì)照組、SalB 組、SalB-NPs組。其中，SalB 組培養(yǎng)基中加入濃度400 mg/mL SalB，SalB-NPs組培養(yǎng)基中加入濃度400 mg/mL SalB-NPs 處理細(xì)胞，對(duì)照組加入等體積PBS 溶液。在含巨噬細(xì)胞集落刺激因子（M-CSF）（50 ng/mL）和RANKL（100 ng/mL）的α-MEM 完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天。使用TRAP 染色試劑盒檢測(cè)破骨細(xì)胞，4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS洗滌一次。將制備好的工作溶液添加到孔板中，室溫避光孵育40 min。用PBS沖洗兩次后，在光學(xué)顯微鏡下獲得圖像。

（五）ALP染色

按照文獻(xiàn)方法(18)，將MC3T3-E1 細(xì)胞接種于0.1%明膠預(yù)包被的12 孔板中，接種密度為1×105個(gè)細(xì)胞/孔。分對(duì)照組、SalB組、SalB-NPs組，處理方式同上。24 h后，更換為成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，隔天換液一次，誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d，根據(jù)試劑盒配置工作液，避光孵育2 h后至顯微鏡下觀察。

（六）茜素紅染色

將MC3T3-E1細(xì)胞接種于0.1%明膠預(yù)包被的12孔板中，接種密度為1×105個(gè)細(xì)胞/孔。分對(duì)照組、SalB組、SalB-NPs組，處理方式同上。成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)21 d行茜素紅染色。4%多聚甲醛固定15 min，PBS 洗滌后，每孔加入500 μL 茜素紅染液染色，室溫避光孵育15 min，PBS 洗滌后熒光倒置顯微鏡下觀察。

（七）Real time-PCR實(shí)驗(yàn)

分對(duì)照組、SalB 組、SalB-NPs 組，處理方式同上。破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)5 d，用Trizol 提取各組樣品總RNA并定量，用Real time-PCR儀和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒對(duì)提取的1 μg mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄為cDNA進(jìn)行定量PCR。使用BioRad CFX 管理器軟件獲得閾值循環(huán)數(shù)。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃×2 min的一個(gè)循環(huán)，然后是95 ℃×10 s、60 ℃×30 s 和72 ℃×30 s 的40 個(gè)循環(huán)。本研究中使用的引物序列見表1。將原癌基因（c-Fos）、Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）、組織蛋白酶K（CTSK）、Ⅰ型膠原α1鏈基因（Col1A1）的相對(duì)表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化為GAPDH 的表達(dá)量，然后計(jì)算出GAPDH的變化倍數(shù)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 9 軟件（GraphPad Software公司，美國(guó)）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn)α值取雙側(cè)=0.05。

結(jié) 果

一、SalB-NPs表征

通過透射電鏡及粒徑分析，發(fā)現(xiàn)制備的SalB-NPs呈雙層膜的球形結(jié)構(gòu)，粒徑在200 nm左右，同時(shí)該納米顆粒表達(dá)RANK蛋白（圖1）。

基因GAPDH c-Fos Runx2 CTSK Col1A1引物序列（5′-3′）F:5′-AACATCAAATGGGGTGAGGCC-3′R:5′-GTTGTCATGGATGACCTTGGC-3′F:5′-TTTCAACGCGGACTACGAGG-3′R:5′-GCGCAAAAGTCCTGTGTGTT-3′F:5′-GGCAGTTCCCAAGCATTTCA-3′R:5′-GGTAAAGGTGGCTGGGTAGT-3′F:5′-AGCGAACAGATTCTCAACAGC-3′R:5′-AGACAGAGCAAAGCTCACCAT-3′F:5'-GACATGTTCAGCTTTGTGGACCTC-3'R:5'-GGGACCCTTAGGCCATTGTGTA-3'

二、細(xì)胞活力

不同濃度SalB 處理RAW 264.7 細(xì)胞和MC3T3-E1 細(xì)胞，隨著濃度增加，細(xì)胞活力逐漸增加，在5 mmol/L 的SalB 處理時(shí)兩組細(xì)胞活力最佳，再增加SalB 濃度，細(xì)胞活力開始下降，且5 mmol/L 與10 mmol/L 之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），因此選用5 mmol/L SalB濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。通過高效液相色譜法檢測(cè)，藥物釋放在96 h達(dá)到高峰并趨于穩(wěn)定，對(duì)藥物裝載發(fā)現(xiàn)當(dāng)SalB濃度達(dá)到400 mg/mL時(shí)，載藥量最高（圖2）。

三、SalB-NPs體外抑制破骨細(xì)胞形成

破骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化5 d 后，可見SalB-NPs 顯著抑制破骨細(xì)胞形成，使用Image J對(duì)破骨細(xì)胞數(shù)目及面積進(jìn)行定量分析顯示，SalB-NPs 組較對(duì)照組和單純SalB 處理組TRAP 陽性細(xì)胞數(shù)及面積明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。

圖3 TRAP 染色觀察（熒光倒置顯微鏡×100） a：對(duì) 照組；b：SalB組；c：SalBNPs 組；d、e：各組破骨細(xì)胞數(shù)目及破骨細(xì)胞面積（ns：差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，**P＜0.01）

四、SalB-NPs體外促進(jìn)成骨分化

對(duì)MC3T3-E1 成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)14 d 進(jìn)行ALP染色，發(fā)現(xiàn)SalB-NPs組染色較對(duì)照組及SalB組明顯加深，定量分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；培養(yǎng)21 d 進(jìn)行茜素紅染色，發(fā)現(xiàn)SalB-NPs 組染色強(qiáng)度及礦化結(jié)節(jié)較其余各組更強(qiáng)，定量分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖4）。

五、SalB-NPs 抑制破骨細(xì)胞分化且促進(jìn)成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)

通過對(duì)破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，SalBNPs 處理后，c-Fos、CTSK 表達(dá)較對(duì)照組和單純SalB組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SalBNPs 處理后的成骨分化基因Col1A1、Runx2 表達(dá)均顯著高于對(duì)照組和SalB 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖5）。

討 論

骨質(zhì)疏松導(dǎo)致骨代謝穩(wěn)態(tài)失衡，容易引發(fā)脆性骨折，是一種嚴(yán)重的公共健康問題。許多原因可破壞這種平衡狀態(tài)，如衰老、雌激素下降、糖皮質(zhì)激素類藥物、自身免疫性疾?。?7-19］。根據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約50%的女性在絕經(jīng)后至少經(jīng)歷過一次骨質(zhì)疏松骨折，導(dǎo)致疼痛，降低病人生活質(zhì)量?，F(xiàn)有的抗骨質(zhì)疏松藥物僅單一促進(jìn)骨形成，如特立帕肽，或者單純抑制骨吸收［4］，如地舒單抗、雙磷酸鹽類，臨床治療效果有限。目前關(guān)于骨質(zhì)疏松藥物的開發(fā)仍是一個(gè)難題［20］。為此，我們從維持骨穩(wěn)態(tài)平衡的角度出發(fā)，基于細(xì)胞膜納米顆粒技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，開發(fā)了負(fù)載SalB的NPs，促進(jìn)成骨活力，抑制過度活化的破骨細(xì)胞，扭轉(zhuǎn)骨質(zhì)疏松的骨穩(wěn)態(tài)失衡問題。

細(xì)胞膜作為體內(nèi)各細(xì)胞之間相互識(shí)別和調(diào)節(jié)的關(guān)鍵細(xì)胞結(jié)構(gòu)，對(duì)其內(nèi)部?jī)?nèi)容物的保留起著至關(guān)重要的作用［21］。雖然人工合成脂質(zhì)體也可用于藥物遞送［18］，但細(xì)胞膜衍生的囊泡作為細(xì)胞自身的物質(zhì)，用于封裝特定材料，除了增強(qiáng)其生物相容性和治療效果以外，既往的研究還發(fā)現(xiàn)應(yīng)用細(xì)胞膜作為偽裝，可躲避自身免疫系統(tǒng)（主要是巨噬細(xì)胞）對(duì)生物材料的清除［22-23］。我們?cè)O(shè)計(jì)的SalB-NPs明顯提高了SalB的穩(wěn)定性，為發(fā)揮其藥物活性作用提供了前提條件。體外釋放實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SalB-NPs 可有效延長(zhǎng)SalB 的滯留時(shí)間，有利于進(jìn)一步發(fā)揮SalB的藥物療效。與此同時(shí)，通過將SalB-NPs 加入到破骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，我們發(fā)現(xiàn)破骨細(xì)胞分化明顯受到抑制，這可能與我們所使用的破骨前體細(xì)胞膜表面所攜帶的RANK蛋白相關(guān)。Zhou 等［17］使用RAW 264.7 細(xì)胞膜包裹聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米顆粒制作的一種納米誘餌，躲避了單核巨噬細(xì)胞對(duì)材料的吞噬，進(jìn)而通過材料表面的RANK 蛋白，清除血清中上調(diào)的RANKL，實(shí)現(xiàn)抑制破骨細(xì)胞分化的效果。我們的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。同時(shí)，在對(duì)破骨分化相關(guān)基因的PCR 檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，SalB-NPs 較單純SalB 明顯下調(diào)c-Fos、CTSK破骨細(xì)胞分化相關(guān)基因的表達(dá)，未發(fā)現(xiàn)SalB 對(duì)破骨細(xì)胞分化基因有顯著抑制作用。SalB 作為丹參中最主要的活性成分，其具有極強(qiáng)的抗氧化作用。同時(shí)，許多文獻(xiàn)報(bào)道了SalB在促進(jìn)成骨方面具有一定的效果［10-12］。我們通過ALP染色、茜素紅染色證實(shí)，SalB-NPs顯著增加MC3T3-E1 ALP活性和鈣鹽沉積，且染色深度較單純SalB 更加明顯。在成骨分化相關(guān)基因的檢測(cè)中，Runx2 和Col1A1 在SalB-NPs 組中顯著上調(diào)，且比SalB 組上調(diào)幅度更加明顯。導(dǎo)致這種現(xiàn)象的原因除了SalB-NPs穩(wěn)定性較SalB更好以外，也有文獻(xiàn)報(bào)道，RAW 264.7細(xì)胞膜納米顆粒能改善腫瘤壞死因子α對(duì)成骨細(xì)胞活力的抑制，發(fā)揮促成骨作用。

綜上所述，我們?cè)O(shè)計(jì)的NPs 負(fù)載SalB 在體外顯著促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，具有廣闊的應(yīng)用前景。未來我們將在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)一步研究其在骨質(zhì)疏松動(dòng)物模型中改善骨穩(wěn)態(tài)的效果，并進(jìn)一步探討關(guān)于SalB 促進(jìn)成骨分化的具體機(jī)制，以及其對(duì)破骨細(xì)胞的作用。