白廣旭 王 郝 崔 娜

膿毒癥(sepsis)是臨床常見急危重癥,病情危重、進展迅速,年死亡人數(shù)逾百萬,90天再住院率高達30%～43%,是導致重癥患者死亡的第二大原因[1]。全球疾病負擔研究數(shù)據(jù)顯示,2017年全世界共有4890萬膿毒癥患者,死亡病例中1100萬與膿毒癥相關(guān)[2]。sepsis3.0將sepsis本質(zhì)定義為感染誘發(fā)宿主免疫失衡所導致的致死性器官功能損傷,宿主免疫失衡成為膿毒癥患者發(fā)生致死性器官功能障礙的核心機制[3]。大量研究表明,持續(xù)淋巴細胞減少與宿主免疫失衡的發(fā)生密切相關(guān),是影響膿毒癥患者預后的獨立危險因素[4,5]。因此,越來越多研究者將視線聚焦于膿毒癥患者淋巴細胞減少的病理生理機制,希望通過改善淋巴細胞增殖分化障礙來提高膿毒癥患者臨床預后[6,7]。

淋巴細胞程序性死亡是導致膿毒癥患者淋巴細胞減少的重要因素,細胞自噬和凋亡在這一過程中發(fā)揮重要作用[8,9]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)是細胞內(nèi)參與分泌作用的重要細胞器,通常被稱為蛋白質(zhì)折疊工廠,負責蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)位、折疊和翻譯后修飾,使蛋白質(zhì)進一步轉(zhuǎn)運到高爾基體。此外,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還是鈣離子儲存、脂質(zhì)合成和碳水化合物代謝的重要場所。研究表明,在膿毒癥、創(chuàng)傷、缺血、病毒感染以及某些特殊藥物引起的病理狀態(tài)下,大量未折疊或錯誤折疊蛋白積累,改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài),引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(ER stress)[10,11]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過3種超特化的前哨內(nèi)質(zhì)膜包埋蛋白來感受應激,它們分別是肌醇需求蛋白1 (inositol-requiring protein 1,IRE1)、雙鏈RNA依賴蛋白激酶(RNA-dependent protein kinase,PKR)樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(double-stranded PKR-like ER kinase,PERK)、和轉(zhuǎn)錄激活因子6(activating transcription factor 6,ATF6)。當這些傳感器識別到逐漸增強的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時,會引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈現(xiàn)精細且復雜的適應性反應,通過這些信號級聯(lián)減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的積累,重建細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài),稱為未折疊蛋白反應(unfolded protein response, UPR)[12]。而當UPR無法解決蛋白積累問題時,就會激活包括細胞凋亡和細胞自噬在內(nèi)的細胞程序性死亡(圖1)[13,14]。

圖1 ER stress引起細胞凋亡的機制

目前,大量研究證實,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與膿毒癥、神經(jīng)退行性疾病、癌癥和糖尿病等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展,在部分炎癥性疾病和腫瘤的動物研究中,通過藥物或基因治療策略來抑制T淋巴細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激已經(jīng)成功阻斷其病理進展,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和UPR信號通路的調(diào)控機制以及針對這一通路的策略越來越受到人們的關(guān)注,對T淋巴細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的研究有望揭示膿毒癥免疫治療新靶點[15～19]。

一、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其信號通路

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是由小管和扁平囊泡構(gòu)成的復雜網(wǎng)絡,為了保證蛋白質(zhì)折疊的準確性,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通過相關(guān)基因維持環(huán)境內(nèi)平衡,保證網(wǎng)內(nèi)蛋白負荷與其調(diào)控蛋白負荷的能力相匹配(表1)。蛋白質(zhì)折疊是由與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)合的伴侶蛋白介導完成,包括蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(protein disulfide isomerase,PDI)和Hsp70家族成員葡萄糖相關(guān)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78),又稱結(jié)合免疫球蛋白(binding protein,Bip)、鈣聯(lián)蛋白、鈣網(wǎng)蛋白[20]。而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是指氧化還原調(diào)節(jié)紊亂、炎癥超負荷、鈣穩(wěn)態(tài)失衡或蛋白質(zhì)過表達等一系列病理狀態(tài)所導致的蛋白質(zhì)折疊機制受損。為了保護細胞免受這種壓力,細胞通過協(xié)調(diào)和整合未折疊蛋白信號通路來恢復內(nèi)環(huán)境平衡,維系正常的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能,主要表現(xiàn)為:①內(nèi)質(zhì)網(wǎng)感受器通過抑制蛋白質(zhì)翻譯和限制準備在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中處理的mRNA池來減少蛋白質(zhì)負荷;②誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白正確折疊新生蛋白并使其轉(zhuǎn)運到高爾基體;③激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解機制(endoplasmic reticulum associated degradation,ERAD)捕獲未折疊蛋白。如果上述信號級聯(lián)反應不足以恢復內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激,則細胞功能受損,凋亡就會啟動。

表1 與膿毒癥有關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)基因

因此,UPR是一把雙刃劍,適度激活對細胞有保護作用,過久則威脅細胞,可能導致細胞功能障礙、死亡和疾病。UPR由上下游兩個部分構(gòu)成。上游是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一系列特殊的應激感受器,包括IRE1、PERK和ATF6;下游則是與之相對應的特異性轉(zhuǎn)錄因子,包括eIF2α(對應PERK),碎片化的ATF6(對應ATF6)以及剪輯后的XBP1(對應IRE1),直接激活或重新編程伴侶蛋白的基因表達使其能夠適應應激或誘導凋亡。

研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激主要通過3條信號通路引起細胞凋亡(圖2)[21,22]。第1條通過IRE1、PERK、ATF6介導的轉(zhuǎn)錄性激活C/EBP同源蛋白基因(C/EBP homologous protein,CHOP)引起凋亡;第2條是由IRE1介導激活c-Jun N-端蛋白激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)信號通路,之后再進一步激活TNF受體相關(guān)因子2 (tumor necrosis factor receptor-associated factor 2,TRAF2)和凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1 (apoptosis signal regulating kinase 1,ASK1)啟動凋亡;第3條則直接通過細胞死亡程序相關(guān)的caspase-12來激活凋亡。Nagakawa等[23]研究發(fā)現(xiàn),在阿爾茨海默病實驗模型中,caspase-12缺陷小鼠對ER stress誘導的凋亡具有抵抗性,表明小鼠caspase-12是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子,可能是極具潛力治療靶點。因此,在實驗模型系統(tǒng)中研究UPR通路并監(jiān)測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激對研究膿毒癥及其他臨床相關(guān)疾病的致病機制具有重要意義。

圖2 ER stress引起細胞凋亡的信號通路

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激調(diào)控UPR也同樣通過3條信號通路。第1條信號通路是 IRE1-XBP1軸。IRE1/XBP1軸被認為是UPR進化保守的核心通路,小到酵母菌,大到人類,其廣泛存在于各類生物,對哺乳動物的發(fā)育過程至關(guān)重要[24]。IRE1是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的Ⅰ型跨膜蛋白,參與UPR信號通路中的信息傳遞。其氨基末端區(qū)域存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi),是具有兩種不同功能的結(jié)構(gòu)域。被稱為激酶域和RNA酶域。激酶域可以感知未折疊蛋白的蓄積,并跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)導信號。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中有未折疊蛋白或錯誤折疊蛋白蓄積時,IRE1位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的結(jié)構(gòu)域被誘導發(fā)生二聚化,激活胞質(zhì)的蛋白激酶域,進而發(fā)生自身磷酸化作用。而當胞質(zhì)段蛋白激酶域激活后,會進一步激活特定位點羧基末端的RNA酶域活化,從而在XBP1-U特定的內(nèi)含子和外顯子區(qū)域進行切割,產(chǎn)生具有高度轉(zhuǎn)錄活性的XBP1-S。XBP1蛋白與參與UPR和ERAD的多個基因啟動子結(jié)合,以恢復蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)并提供細胞保護。

研究表明,在T淋巴細胞中選擇性缺乏XBP1的卵巢癌小鼠表現(xiàn)出優(yōu)異的抗腫瘤免疫能力,延緩了惡性進展并提高了總生存率?？刂苾?nèi)質(zhì)網(wǎng)應激或靶向調(diào)控IRE1-XBP1信號通路可能有助于恢復腫瘤宿主T淋巴細胞的代謝適應性和抗腫瘤能力,提示XBP1在免疫應答中發(fā)揮重要作用[25]。此外,除了核糖核酸內(nèi)切酶,激活的IRE1還可作為激酶與TRAF2結(jié)合,進而招募ASK1并激活JNK和p38 MAPK的磷酸化。IRE1依賴的JNK激活是激活轉(zhuǎn)錄因子CHOP和NF-κB的重要信號機制,其改變基因表達,有助于細胞凋亡和炎性反應。IRE1還參與自噬激活。有研究指出,sXBP1占據(jù)了TF(轉(zhuǎn)錄因子)EB啟動子的-743～-523位點,而TFEB是自噬和溶酶體生物發(fā)生的主要調(diào)節(jié)因子;在小鼠中,肝臟中XBP1的缺失抑制了TFEB的轉(zhuǎn)錄和自噬,而肝臟中XBP1-S的過表達增強了TFEB的轉(zhuǎn)錄和細胞自噬[26]?？傊?IRE1/ XBP1軸是維持各種生理過程的關(guān)鍵,并在細胞死亡和適應應激方面發(fā)揮雙重功能,其功能方向取決于細胞類型和應激刺激的程度。

ER stress調(diào)控UPR的第2條信號通路是PERK信號通路。PERK的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)域與IRE1相似,同樣作為Ⅰ型跨膜蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜,感知未折疊的蛋白。然而其細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域并無RNA酶域而只具有激酶活性。簡單來說,在沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的情況下,GRP78與PERK的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)域結(jié)合,抑制其激活。在ER Stress下,PERK與GRP78分離,通過二聚化和第51位絲氨酸磷酸化激活,進而使啟動因子eIF2α失活,從而抑制一般蛋白向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)譯。這種抑制作用通過減少錯誤折疊或未折疊的蛋白質(zhì)進一步流入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激。

ER stress調(diào)控UPR的第3條信號通路是ATF6信號通路。ATF6是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ⅱ型內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白。其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)域與IRE1和PERK相同,用以感知錯誤折疊蛋白,但在胞質(zhì)部分ATF6有一個包含堿基亮氨酸拉鏈基序(bZIP)和轉(zhuǎn)錄激活的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[27]。在正常情況下,ATF6被合成為非活性前體并與GRP78結(jié)合。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激下,ATF6從GRP78中分離出來,通過囊泡運輸轉(zhuǎn)移到高爾基體。在高爾基體中,它被一對加工蛋白酶所切割,分別稱為位點1蛋白酶(S1P)和位點2蛋白酶(S2P)。這種蛋白水解導致其胞質(zhì)域ATF6f (ATF6的一個片段)的釋放,它是ATF6的一種活性形式。ATF6活性片段易位進入細胞核,強化ERAD和蛋白折疊相關(guān)的分子伴侶和多個基因,如GRP78、GRP94、鈣網(wǎng)蛋白以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激應答元件(ERSE)的表達,通過促進錯誤/未折疊蛋白的水解來降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[28]。

二、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是膿毒癥相關(guān)細胞凋亡的重要機制

隨著對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激認識的不斷加深,筆者發(fā)現(xiàn),抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可穩(wěn)定蛋白構(gòu)象,促進突變蛋白的轉(zhuǎn)運,提高內(nèi)質(zhì)網(wǎng)折疊能力,不僅是糖尿病、囊性纖維化、創(chuàng)傷出血和器官缺血性損傷等多種疾病的重要潛在發(fā)病機制,而且與膿毒癥相關(guān)細胞凋亡密切相關(guān)[29,30]。Ferlito等[31]研究發(fā)現(xiàn),凋亡因子CHOP的表達在膿毒癥小鼠中顯著增強,通過給予H2S抑制CHOP表達可提高膿毒癥實驗模型的存活率,表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激參與膿毒癥發(fā)生。Zhang等[15]研究顯示,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激成分(GRP94、CHOP和caspase-12)在膿毒癥大鼠心臟中上調(diào),抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可保護大鼠心肌免受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的凋亡。除此之外,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可導致膿毒癥小鼠淋巴細胞凋亡異常,提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導的凋亡通路可能成為臨床預防和治療膿毒癥相關(guān)淋巴細胞凋亡的新靶點[32]。這些研究大大增加了人們對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和膿毒癥病理生理機制的認識,同時也提出了膿毒癥相關(guān)免疫治療可能的新靶點和新策略。

三、T淋巴細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是改善膿毒癥免疫抑制的潛在靶點

關(guān)于T淋巴細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的研究,目前主要集中在腫瘤和自身免疫病領(lǐng)域。Thaxton等[18]研究發(fā)現(xiàn),內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以通過調(diào)節(jié)胞質(zhì)內(nèi)鈣離子來定義CD4+T淋巴細胞表型和功能,證明與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)因子具備通過T淋巴細胞免疫進行腫瘤治療的潛力。Cao等[33]研究指出,T淋巴細胞中CHOP的缺失改善CD8+T淋巴細胞自發(fā)抗腫瘤免疫特效,增強T淋巴細胞基礎(chǔ)免疫治療的療效。他們發(fā)現(xiàn),CD8+T淋巴細胞中的CHOP主要通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)激酶PERK和隨后ATF4的誘導而升高,并直接抑制效應T淋巴細胞功能主要調(diào)控因子T-bet的表達,提出CHOP在腫瘤誘導CD8+T淋巴細胞功能障礙中發(fā)揮重要作用以及阻斷CHOP或改善T淋巴細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激提高抗腫瘤免疫治療潛力的重要理念。

一項對照SLE和健康人群的研究發(fā)現(xiàn),在藥物誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激作用下,SLE患者T淋巴細胞自噬水平較健康捐獻者明顯減低,凋亡水平顯著增加,GRP78和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號分子如PERK、p-eIF2α、IRE1和ATF6的表達明顯減少,而凋亡因子CHOP的表達水平明顯增高[34];抗凋亡因子Bcl-2和Bcl-XL水平減低,而促凋亡因子Bax和caspase-6表達增加,從而推測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是導致T淋巴細胞異常自噬并參與SLE發(fā)病的重要機制。Wu等[35]通過脂多糖腹腔注射和盲腸結(jié)扎穿刺手術(shù)制造膿毒癥體內(nèi)和體外模型,利用動態(tài)相關(guān)蛋白1(dynamic related protein 1,drp1)選擇性抑制劑mdivi-1處理后,分選出CD4+T淋巴細胞,發(fā)現(xiàn)其活性氧(reactive oxygen,ROS)產(chǎn)生顯著減少,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和相關(guān)細胞凋亡受到抑制;應用tunicamycin藥物誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激后,mdivi-1對CD4+T淋巴細胞的保護作用被逆轉(zhuǎn),證明阻止內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激是mdivi-1在膿毒癥中保護CD4+T淋巴細胞的潛在機制,mdivi-1作為一種新的治療策略,可以靶向調(diào)節(jié)CD4+T淋巴細胞在膿毒癥期間的凋亡。

此外,近年來發(fā)表在《Cells》上的一篇綜述更進一步闡述了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在調(diào)節(jié)先天免疫細胞發(fā)育和功能分化中的重要作用[36]:①未成熟樹突狀細胞需要激活I(lǐng)RE1/XBP1才能在成熟樹突狀細胞中分化;②成熟的DCs在遇到損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns,DAMPs)和病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)時,通過激活PERK/CHOP通路完成IL-23合成釋放;③當巨噬細胞被Toll樣受體(toll-like receptors,TLRs)與DAMPs和PAMPs結(jié)合并釋放激活信號后,IRE1作為TLRs的下游靶點,誘導XBP1剪接和炎性小體激活,從而促進巨噬細胞釋放促炎性細胞因子IL-6和TNF-α。此外,在疾病背景下,脂質(zhì)積累對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的過度激活會導致泡沫細胞的形成、細胞死亡和分解反應受損。其證據(jù)是在中性粒細胞中發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的激活與發(fā)育過程中細胞死亡和組織損傷的增加有關(guān)。因此,可以預見的是,T淋巴細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激作為改善膿毒癥患者免疫抑制的靶點方面具備極大的潛力。

四、展 望

綜上所述,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一種對外部毒素和病原體侵襲極為敏感,可以感知細胞微環(huán)境任何變化的傳感裝置,它可以作為一個豐富的平臺來理解環(huán)境信號和生物反應之間的相互作用。T淋巴細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及其相關(guān)UPR信號的研究在膿毒癥免疫失衡方面具有極高的研究價值和研究潛力,將有助于更深入思考膿毒癥免疫失衡的發(fā)生和發(fā)展,換一個角度去理解膿毒癥T淋巴細胞免疫抑制的內(nèi)在分子機制,有助于開拓新的治療靶點,為膿毒癥新型治療手段提供理論基礎(chǔ),從實質(zhì)上推進膿毒癥免疫分子基礎(chǔ)研究的臨床應用轉(zhuǎn)化進程。