王雪梅 王怡婷 車 悅 汪潔英 門(mén) 可

非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指沒(méi)有過(guò)量飲酒史,以脂肪變性和蓄積為主要病理特征。約1/5的NAFLD患者由于炎性反應(yīng)進(jìn)展成非酒精性脂肪性肝炎,肝纖維化發(fā)生肝硬化甚至肝細(xì)胞癌[1]。NAFLD的患病率是25.24%,胰島素抵抗、2型糖尿病、肥胖等代謝性疾病也更容易發(fā)生在NAFLD患者身上[2]。NAFLD的發(fā)病機(jī)制常見(jiàn)的是“二次打擊”理論,即先是脂質(zhì)代謝紊亂、脂質(zhì)蓄積,后是炎癥和氧化應(yīng)激加重病變[3]。NAFLD的細(xì)胞模型復(fù)制方法都是打破能量代謝平衡,促進(jìn)脂肪變性和蓄積。人肝癌細(xì)胞HepG2、人胚胎肝細(xì)胞L02和小鼠肝實(shí)質(zhì)原代細(xì)胞都是良好的模型載體,干預(yù)方式常用棕櫚酸和油酸按照不同的比例混合成游離脂肪酸孵育細(xì)胞,或者用高濃度血清干預(yù),還有就是葡萄糖和胰島素共同干預(yù)[4,5]。

線粒體是細(xì)胞內(nèi)相對(duì)獨(dú)立的細(xì)胞器,有雙層膜結(jié)構(gòu)和獨(dú)立的DNA。線粒體通過(guò)呼吸鏈的氧化還原反應(yīng),完成氧化磷酸化產(chǎn)生ATP[6]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferators-activatedreceptors alpha,PPARα)是一種核激素受體,參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)分解相關(guān)酶基因的轉(zhuǎn)錄[7]。PPARα的靶基因肉毒堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶-1A(carnitine palmitoyltransferase-1A,CPT-1A)是催化脂肪酸氧化的關(guān)鍵限速酶[8]。過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α(peroxisome proliferators-activated receptors gamma co-activator 1α,PGC-1α)參與調(diào)節(jié)線粒體生物合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),其中核呼吸因子1(nuclear respiratory factor-1,NRF-1)、線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A,mtTFA)參與調(diào)控線粒體DNA的生物合成,NRF-1和mtTFA都是PGC-1α的靶基因[9,10]。線粒體功能在NAFLD脂質(zhì)蓄積中的作用有待于進(jìn)一步闡明,本研究旨在探討PGC-1α介導(dǎo)線粒體功能調(diào)控肝細(xì)胞脂質(zhì)蓄積,為尋找NAFLD治療新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)和參考。

材料與方法

1.主要試劑與材料:HepG2人肝癌細(xì)胞株由西安醫(yī)學(xué)院病理教研室贈(zèng)予;人源過(guò)表達(dá)慢病毒載體PPARGC1A,NM_001330751和陰性對(duì)照病毒(LV-control)購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司;甘油三酯(triglyceride,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)試劑盒、肝功能指標(biāo)丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)、油紅O染液均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒購(gòu)自Life Technologies公司;DNA引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;PPARα、CPT-1A、PGC-1α、NRF-1、mtTFA蛋白一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司,蛋白一抗GAPDH購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司;蛋白二抗試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光顯影液(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;1%磷酸酶抑制劑購(gòu)自美國(guó)Thermo公司;0.5%蛋白酶抑制劑、RIPA緩沖液、BCA蛋白質(zhì)分析、粒體膜電位檢測(cè)C2006、活性氧檢測(cè)S0033S購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;油酸SLB07659V、棕櫚酸SLB02406V購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

2.細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法:待HepG2生長(zhǎng)至50%～70%融合度,不同病毒感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI)轉(zhuǎn)染慢病毒LV-PPARGC1A(2×108TU/ml);陰性對(duì)照病毒LV-control(CON238,uBI-MCS-SV40-EGFP-IRES-puromycin,1×109TU/ml),加入病毒感染增強(qiáng)劑A和P,待轉(zhuǎn)染72h后觀察轉(zhuǎn)染效果。實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)PGC-1α過(guò)表達(dá)情況,引物序列:上游引物::5′-CAGAGAGTATGAGAAGCGAGAG-3′,下游引物:5′-AGCATCACAGGTATAACGGTAG-3′。GAPDH為內(nèi)參基因,引物序列:上游引物:5′-GCAAATTCCATGGCACCGT-3′, 下游引物:5′-TCGCCCCACTTGATTTTGG-3′。

3.HepG2細(xì)胞脂肪堆積模型和分組:取油酸和棕櫚酸按照2∶1(濃度0.66mol/L∶0.33mol/L)的比例用DMSO分別溶解,混合制成游離脂肪酸(free fatty acid,FFA)。10%胎牛血清溶于DMEM高糖培養(yǎng)基,置于CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。分為對(duì)照組、FFA模型組(1.5mmol/L FFA孵育24h)、LV-PGC-1α干預(yù)組(PPARGC1A慢病毒轉(zhuǎn)染后,1.5mmol/L FFA孵育24h)、LV-control 干預(yù)組(陰性對(duì)照慢病毒轉(zhuǎn)染后,1.5mmol/L FFA孵育24h)。

4.細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì):細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,試劑盒測(cè)定TC、TG含量,表示為mmol/(g·prot)。油紅O染色,于510nm處測(cè)定吸光度(A)值,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積情況。

5.肝損傷指標(biāo)和細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo):試劑盒檢測(cè)細(xì)胞上清液中AST、ALT的含量變化。比色法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)中SOD和GSH-PX的活性,MDA含量。

6.線粒體ATP含量和線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)復(fù)制倍數(shù):裂解細(xì)胞測(cè)定蛋白濃度和細(xì)胞內(nèi)ATP含量,單位為納摩爾/克(nmol/g)。試劑盒提取細(xì)胞DNA并測(cè)定濃度,檢測(cè)ND1基因代表線粒體mtDNA的復(fù)制倍數(shù),GAPDH是內(nèi)部參數(shù)。配置20μl反應(yīng)體系進(jìn)行DNA擴(kuò)增,用2-ΔΔct方法得出定量結(jié)果。ND1引物序列:上游引物:5′-GGAGTAATCCAGGTCGGT-3′,下游引物:5′-TGGGTACAATGAGGAGTAGG-3′。GAPDH引物序列:上游引物:5′-AAGGTGGAGGAGTGGGTGT-3′,下游引物:5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′。

7.Western blot法檢測(cè)脂質(zhì)分解相關(guān)蛋白、線粒體生物合成蛋白表達(dá):冰上裂解細(xì)胞得到蛋白上清液,BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度,蛋白變性后10%SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)40μg并轉(zhuǎn)膜。封閉1h,孵育蛋白一抗于4℃下過(guò)夜。37℃二抗體孵育1h,ECL顯影固定。使用Image J軟件分析A值,以GAPDH蛋白校正結(jié)果。比較PPARα、CPT-1、PGC-1α、NRF-1和mtTFA的蛋白表達(dá)。

結(jié) 果

1.細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率:LV-PGC-1α干預(yù)過(guò)表達(dá)PGC-1α基因,過(guò)表達(dá)效果顯著(圖1)。比較3種不同病毒感染復(fù)數(shù)MOI=30、MOI=50、MOI=100在4種轉(zhuǎn)染條件下的轉(zhuǎn)染效率,熒光倒置顯微鏡觀察顯示,隨著MOI的增加,慢病毒對(duì)HepG2的轉(zhuǎn)染效率逐步增加,并且增高程度呈線性關(guān)系,熒光強(qiáng)度隨轉(zhuǎn)染效率增高。MOI=100,72h時(shí)病毒轉(zhuǎn)染加入增強(qiáng)劑P后的轉(zhuǎn)染效率最高,MOI=50接近MOI=100時(shí)的轉(zhuǎn)染效率,因此選擇MOI=50,添加增強(qiáng)劑P,轉(zhuǎn)染72h為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定HepG2細(xì)胞中PGC-1α的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,與LV-control干預(yù)組比較,LV-PGC-1α干預(yù)組的PGC-1α顯著過(guò)表達(dá),詳見(jiàn)圖2。

圖2 慢病毒轉(zhuǎn)染后PGC-1α基因過(guò)表達(dá)

2.PGC-1α過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的作用:油紅O染色檢測(cè)細(xì)胞脂質(zhì)蓄積,與對(duì)照組比較,FFA模型組的脂質(zhì)蓄積顯著增加;與LV-control干預(yù)組比較,LV-PGC-1α干預(yù)組的脂質(zhì)負(fù)荷顯著降低。510nm處的A值組間差異顯著(F=25.431,P<0.001),詳見(jiàn)圖3。LV-PGC-1α干預(yù)顯著降低細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量,詳見(jiàn)表1。

表1 HepG2細(xì)胞內(nèi)TG和TC的含量

圖3 HepG2細(xì)胞油紅O染色觀察脂質(zhì)蓄積情況(×400)及半定量檢測(cè)510nm處的A值

3.肝細(xì)胞損傷指標(biāo):與對(duì)照組比較,FFA模型組細(xì)胞上清液中ALT和AST顯著增高,LV-PGC-1α干預(yù)組的ALT和AST較LV-control干預(yù)組降低,詳見(jiàn)表2。

表2 細(xì)胞上清液AST和ALT變化

4.肝細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo):與對(duì)照組比較,FFA模型組細(xì)胞中的SOD酶活性顯著降低、GSH-PX酶活性顯著降低,MDA含量顯著增加;與LV-control干預(yù)組比較,LV-PGC-1α干預(yù)組的SOD活性增加,GSH-PX酶活性顯著升高,MDA水平下降,提示PGC-1α可減輕高脂導(dǎo)致的氧化應(yīng)激,詳見(jiàn)表3。

表3 HepG2細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激指標(biāo)

5.PGC-1α過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞ATP含量的影響:檢測(cè)細(xì)胞ATP含量,組間差異顯著(F=21.675,P<0.001)。與對(duì)照組比較,FFA模型組的ATP含量顯著降低(3.80±0.42μmol/g vs 8.08±0.89μmol/g,P<0.001);與LV-control干預(yù)組比較,LV-PGC-1α干預(yù)組的ATP含量增加(5.30±1.10μmol/g vs 3.82±0.26μmol/g,P<0.05),詳見(jiàn)圖4。

圖4 HepG2細(xì)胞線粒體ATP含量

6.PGC-1α過(guò)表達(dá)對(duì)HepG2細(xì)胞mtDNA復(fù)制數(shù)作用:結(jié)果顯示,mtDNA復(fù)制數(shù)組間差異顯著(F=13.780,P<0.001),FFA干預(yù)降低細(xì)胞的mtDNA復(fù)制倍數(shù)。與對(duì)照組比較、FFA模型組的mtDNA復(fù)制數(shù)顯著降低;與LV-control干預(yù)組比較,LV-PGC-1α干預(yù)組的mtDNA復(fù)制數(shù)增加,詳見(jiàn)圖5。

圖5 HepG2細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)變化

7.Western blot法檢測(cè)脂質(zhì)氧化相關(guān)因子、線粒體生物合成因子的蛋白表達(dá):與對(duì)照組比較,FFA模型組的脂質(zhì)氧化相關(guān)因子PPARα和CPT-1A的表達(dá)顯著下調(diào)、線粒體生物合成相關(guān)因子PGC-1α、NRF-1、mtTFA的表達(dá)下降。與LV-control干預(yù)組比較,LV-PGC-1α干預(yù)組PPARα顯著上調(diào),PGC-1α、NRF-1、mtTFA的表達(dá)顯著增加,詳見(jiàn)圖6、表4。PGC-1α過(guò)表達(dá)通過(guò)增加線粒體的生物合成,促進(jìn)脂質(zhì)氧化分解來(lái)減輕FFA引起HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積。

表4 各組細(xì)胞脂質(zhì)分解相關(guān)因子、線粒體生物合成因子的蛋白表達(dá)

討 論

NAFLD病理表現(xiàn)為脂質(zhì)異常積聚在肝細(xì)胞,其中棕櫚酸和油酸是人體內(nèi)普遍的飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸[11,12]。多項(xiàng)機(jī)制研究表明,FFA和TG造成的肝臟脂毒性與NAFLD嚴(yán)重程度密切相關(guān)。FFA激發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體應(yīng)激,通過(guò)激活氧化應(yīng)激相關(guān)信號(hào)通路以及炎性信號(hào)通路,誘導(dǎo)脂質(zhì)代謝紊亂、炎性反應(yīng)和凋亡[13,14]。本研究用FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞造成NAFLD模型,LV-PGC-1α干預(yù)后觀察其對(duì)脂質(zhì)蓄積的作用。結(jié)果表明,PGC-1α過(guò)表達(dá),細(xì)胞內(nèi)TG和TC含量顯著降低,脂滴蓄積減少,AST和ALT水平降低,氧化應(yīng)激指標(biāo)下降,細(xì)胞ATP含量增加,mtDNA復(fù)制倍數(shù)增加,脂質(zhì)氧化和線粒體生物合成相關(guān)蛋白的表達(dá)增加。即PGC-1α通過(guò)增強(qiáng)線粒體生物合成、ATP生成、加強(qiáng)脂肪酸氧化分解,降低HepG2細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。

NAFLD患者肝臟以TG的形式堆積脂肪,而TG主要來(lái)源于FFA等的酯化作用[15]。核激素受體包括調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的遺傳網(wǎng)絡(luò)的配體激活的轉(zhuǎn)錄因子,包括PPARα,固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白等[16,17]。核激素受體不僅能作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)基因表達(dá),還可以結(jié)合脂質(zhì)分子作為細(xì)胞內(nèi)受體。固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c主要控制脂肪酸生物合成基因,PPARα參與調(diào)節(jié)脂肪酸的氧化,CPT-1是催化脂肪酸氧化的關(guān)鍵限速酶,促進(jìn)脂肪酸分解。肝臟脂質(zhì)的分解途徑有脂肪酸氧化,以極低密度脂蛋白將TG運(yùn)出肝臟[18]。脂代謝吸收、合成和分解過(guò)程中的任何一個(gè)環(huán)節(jié)異常,都可能導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)過(guò)度蓄積。本研究結(jié)果顯示,PGC-1α過(guò)表達(dá)后,脂質(zhì)分解相關(guān)基因PPARα和CPT-1上調(diào)。

NAFLD病理情況下,TG分解時(shí)脂肪酸β氧化作用加強(qiáng)。線粒體氧化磷酸化過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species,ROS),適量的ROS被機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)清除,但是過(guò)量的ROS引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激[19]。mtDNA是獨(dú)立的雙鏈DNA,因?yàn)槿狈NA修復(fù)酶,更容易受到ROS的攻擊[20]。線粒體既是ROS的主要來(lái)源,也是ROS攻擊的主要靶標(biāo)。首先,ROS攻擊mtDNA發(fā)生氧化損傷,氧化應(yīng)激通過(guò)形成氧自由基破壞細(xì)胞蛋白質(zhì)和核酸分子(DNA/RNA)的結(jié)構(gòu)與功能。8-羥基脫氧鳥(niǎo)嘌呤核苷是mtDNA損傷的一種分子標(biāo)志物[21]。氧化應(yīng)激加速細(xì)胞膜脂質(zhì)過(guò)氧化,期間伴隨著MDA的含量增加,抗氧化酶SOD和GSH-PX經(jīng)過(guò)消耗其活性降低[22,23]。其次,線粒體PGC-1α調(diào)控mtDNA的生物合成,表現(xiàn)為其靶基因下調(diào)后,mtDNA的拷貝數(shù)減少,氧化磷酸化速率減慢,使得ATP含量下降[24]。

本研究中PGC-1α過(guò)表達(dá)減輕脂質(zhì)氧化應(yīng)激,線粒體生物合成增加,ATP含量上調(diào),脂質(zhì)氧化分解增強(qiáng),降低肝細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積[25]。先前研究證實(shí),在PGC-1α基因缺乏小鼠的主動(dòng)脈中NRF-1和mtTFA蛋白表達(dá)下降,加速小鼠主動(dòng)脈血管的老化,這與本研究結(jié)果一致[26,27]。

綜上所述,FFA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞形成過(guò)量的TG,造成脂質(zhì)蓄積,引起細(xì)胞氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙,脂質(zhì)氧化速率減緩。本研究進(jìn)一步明確,PGC-1α過(guò)表達(dá)促進(jìn)脂質(zhì)分解相關(guān)因子PPARα和CPT-1上調(diào),線粒體生物合成因子NRF-1、mtTFA的表達(dá)顯著增加,增強(qiáng)肝細(xì)胞線粒體的β氧化,降低肝臟的氧化應(yīng)激損傷和脂質(zhì)蓄積,為非酒精性脂肪肝病的治療找到新的作用靶點(diǎn)提供了思路和參考依據(jù)。

本研究也存在一定局限性,如僅探討了NAFLD病變中線粒體生物合成相關(guān)的因子和肝臟脂質(zhì)氧化分解相關(guān)的基因的表達(dá),有待于全面系統(tǒng)探討肝臟脂質(zhì)合成和代謝的其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況。肝臟作為人體脂質(zhì)代謝的核心器官,通過(guò)調(diào)節(jié)TG和TC的代謝,影響作用于循環(huán)系統(tǒng)的的脂質(zhì)水平,深入探討肝臟線粒體對(duì)于脂質(zhì)的調(diào)節(jié)機(jī)制,對(duì)于預(yù)防和治療高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病具有重要的參考價(jià)值。