李云瑩 梁 棟 張偉華 呂亞楠 王 芳 劉 敬

腦梗死又稱為缺血性腦卒中,可誘導腦細胞損壞與凋亡[1]。近年來外泌體成為多種疾病治療的新策略[2]。有研究表明,外泌體能穿透血-腦脊液屏障,對治療腦梗死具有重要意義[3]。間充質(zhì)干細胞是一種多功能干細胞,間充質(zhì)干細胞來源的外泌體已被報道能治療多種腦部疾病,如人臍帶間充質(zhì)干細胞來源的外泌體分泌miR-146a-5p能降低缺血腦卒中后小膠質(zhì)細胞介導的神經(jīng)炎癥[4]。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSCS)來源的外泌體通過激活SphK1/S1P1信號通路,減少Aβ沉積并改善阿爾茨海默病小鼠的認知功能恢復[5]。研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-128-3p水平有助于缺血誘導的腦損傷神經(jīng)元的存活[6]。據(jù)報道,miR-128-3p在BM-MSCS外泌體中高表達,能促進骨愈合[7]。但是BM-MSCS外泌體源性miR-128-3p對于腦梗死是否具有調(diào)控作用仍有待于進一步明確。

材料與方法

1.試劑與器材:TTC染色液購自北京索萊寶科技有限公司;杜氏改良Eagle 培養(yǎng)基購自北京諾博萊德科技有限公司;TRlzol試劑、第1鏈cDNA合成試劑盒、SYBR Green預混液、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑均購自美國Thermo Fisher公司;CD9抗體、Flotillin抗體、Calnexin抗體、GSK3B抗體、β-actin抗體、IgG抗體、ELISA試劑盒(TNF-α、IL-6)均購自英國Abcam公司;LC3抗體購自武漢艾美捷科技有限公司;293T細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司;RIPA裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;雙熒光素酶報告檢測試劑盒購自上海翊圣生物科技有限公司;流式細胞儀購自美國BD公司;酶標儀購自美國REAGEN公司;7500實時熒光定量PCR儀購自美國ABI公司。

2.大腦中動脈閉塞模型(middle cerebral artery occlusion, MCAO)建立:使用5只6～7周齡C57BL/6J雄性大鼠建立MCAO模型,體質(zhì)量為192～213g。將大鼠安置在SPF級環(huán)境中,按照之前描述的線栓法制備模型[8]。大鼠腹腔注射3%戊巴比妥鈉(50mg/kg),并固定在手術(shù)臺上,消毒頸部并切開,分離右側(cè)頸總動脈,尼龍線涂上石蠟,從頸外動脈緩慢插入右頸內(nèi)動脈,閉塞2h。拔出尼龍線,24h后進行縫合與消毒。假手術(shù)組(sham組)僅分離頸動脈后便縫合傷口,未插入尼龍線。之后40mg/kg戊巴比妥鈉麻醉大鼠后將其以頸椎脫位法處死,取出梗死腦組織,切成2mm的薄片備用。

3.生物信息學分析:采用GEO數(shù)據(jù)庫進行數(shù)據(jù)挖掘,選中GSE29287數(shù)據(jù)集進行分析。R語言limma包對GSE29287中差異表達miRNA進行篩選,TargetScanHuman7.1網(wǎng)站用于預測miRNA的下游靶基因。

4. BM-MSCS和外泌體的分離與鑒定:取2周齡C57BL/6J雄性大鼠提取BM-MSCS,提取方法與鑒定如之前描述[9]。將BM-MSCS在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h。采用差速離心法分離外泌體。透射電子顯微鏡觀察外泌體形態(tài),Western blot法檢測外泌體中CD9、Flotillin、Calnexin的表達。

5.動物分組與細胞處理:尾靜脈注射100μg外泌體(3×108顆粒/微升)治療MCAO大鼠作為exo組,尾靜脈注射同劑量的外泌體抑制劑GW4869作為GW4869組。將大鼠分為sham組(假手術(shù)組)、MCAO組、exo組(MCAO大鼠尾靜脈注射BM-MSCS外泌體)、GW4869組(MCAO大鼠尾靜脈注射100μg外泌體抑制劑GW4869)、exo-miR-128mimic組(MCAO大鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)染了miR-128mimic的BM-MSCS外泌體)、exo-miR-128 inhibitor組(MCAO大鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)染了miR-128 inhibitor的BM-MSCS外泌體)、exo-miR-128 inhibitor+si-GSK3B組(MCAO大鼠尾靜脈注射轉(zhuǎn)染了miR-128 inhibitor的BM-MSCS外泌體以及si-GSK3B),以上轉(zhuǎn)染借助Lipofectamine 3000試劑盒完成。

6.RT-qPCR:TRlzol試劑用于提取組織中總RNA,使用第1鏈cDNA合成試劑盒將1μg的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用引物與SYBR Green預混液,在7500實時熒光定量PCR儀上對miR-128與GSK3B的表達量進行檢測,程序反應設定為:50℃ 2min,95℃ 2min;95℃ 15s、52℃ 15s、72℃ 1min循環(huán)40次。以GAPDH與U6作為內(nèi)部參考,采用2-ΔΔCt公式計算相對表達量。miR-128上游引物:5′-GATACGAGCAGCTACAGC-3′,下游引物:5′-AAGCTACGAGCGCGTAAAGCC-3′。GSK3B上游引物:5′-AATCGACGCGCGCGCGAAAGC-3′,下游引物:5′-CCCATCGAGGAAGGGAGATATATAC-3′。GAPDH上游引物:5′-TTAGCGCGAGAGAGTTAGATCG-3′,下游引物:5′-AATGCGCGAAGTCTATGCGGC-3′。U6上游引物:5′-TAATTAGCAGCGAGCAAACCCC-3′,下游引物:5′-CGGCGATCTATCTGCGTTCGGTGC-3′。

7.雙熒光素酶報告實驗:借助StarBase在線預測網(wǎng)站預測miR-128與GSK3B的靶向結(jié)合位點,使用雙熒光素酶報告實驗驗證miR-128與GSK3B的靶向關(guān)系。擴增GSK3B中含有miR-128序列的3′UTR片段,克隆到pmirGLO載體上,命名為GSK3B-WT,對GSK3B中含有miR-128結(jié)合位點的片段進行定點突變,擴增并克隆到pmirGLO載體上,命名為GSK3B-MUT。使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將GSK3B-WT、GSK3B-MUT分別與miR-128NC、miR-128mimic共轉(zhuǎn)染到293T細胞中,在培養(yǎng)箱中孵育48h,按照雙熒光素酶報告檢測試劑盒說明書的要求對各組細胞的熒光素酶活性進行檢測。

8.Western blot法檢測:使用RIPA裂解液裂解組織中蛋白,BCA法檢測總蛋白的濃度,將提取的蛋白用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠進行電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。使用5%脫脂牛奶進行封閉。之后加入一抗CD9(1∶2000)、Flotillin(1∶10000)、Calnexin(1∶20000)、LC3-Ⅰ(1∶2000)、LC3-Ⅱ(1∶2000)、GSK3B(1∶10000)、β-actin(1∶10000),TBST洗膜,使用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的山羊抗兔二抗IgG(1∶1000)孵育1h。TBST洗膜,使用ECL試劑檢測蛋白信號,借助Image J軟件對蛋白信號進行分析。

9.ELISA:將組織剪碎,取2ml放入玻璃勻漿器,加入10ml預冷的PBS充分研磨,超聲破碎,5000×g離心5min,收集上清液使用ELISA檢測TNF-α、IL-6的表達。檢測步驟按照ELISA試劑盒說明書進行。酶標儀測定450nm的吸光度(A)值,繪制標準曲線并計算濃度。

結(jié) 果

1.BM-MSCS外泌體鑒定:透射電子顯微鏡觀察外泌體發(fā)現(xiàn)其呈典型杯狀或囊泡狀結(jié)構(gòu)(圖1A),Western blot法實驗顯示外泌體標志物CD9、Flotillin均表達陽性,Calnexin表達陰性(圖2B)。以上實驗證實BM-MSCS源性外泌體分離成功。

圖1 BM-MSCS與外泌體鑒定A.透射電子顯微鏡觀察出典型的外泌體形態(tài);B.Western blot法檢測外泌體標志物的表達

2.miR-128在MACO大鼠腦組織中表達下調(diào):GSE29287數(shù)據(jù)集中顯示miR-128在腦卒中神經(jīng)祖細胞中表達降低(圖2A)。由于BM-MSCS一般在疾病中發(fā)揮治療作用,因此本研究關(guān)注在腦卒中中表達下調(diào)的miRNA,查閱文獻后發(fā)現(xiàn)miR-128在腦缺血中發(fā)揮保護作用因此將其納入研究。與sham組比較,MCAO大鼠腦組織中miR-128表達下調(diào)(圖2B,P<0.05)。以上實驗說明,異常表達的miR-128可能在腦梗死發(fā)展中具有重要意義。

3.BM-MSCS外泌體能抑制MCAO大鼠自噬與炎性細胞因子分泌:與sham組比較,MCAO大鼠組織中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達以及TNF-α、IL-6濃度增高(P均<0.05)。與MCAO組比較,exo組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達下降,TNF-α、IL-6濃度降低(P均<0.05)。與exo組比較,GW4869組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達以及TNF-α、IL-6濃度升高(P均<0.05, 圖3)。

圖3 BM-MSCS外泌體能抑制MCAO大鼠自噬與炎性細胞因子分泌A、B.自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達;C.各組TNF-α、IL-6水平。與sham組比較,*P<0.05;與MCAO組比較,#P<0.05;與exo組比較,ΔP<0.05

4.BM-MSCS外泌體通過miR-128發(fā)揮治療作用:與 sham組比較,MCAO組中miR-128表達下調(diào),與MCAO組比較,exo組中miR-128表達上調(diào),加入GW4869后miR-128的表達被抑制(圖4A,P均<0.05)。功能實驗檢測結(jié)果顯示,與MCAO組比較,exo-miR-128mimic組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達下降,而exo-miR-128 inhibitor組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達升高(圖4中B、C,P均<0.05)。與MCAO組比較,exo-miR-128mimic組中TNF-α、IL-6濃度均下調(diào),而exo-miR-128 inhibitor組中TNF-α、IL-6濃度提高(圖4D,P均<0.05)。以上實驗說明,在外泌體中下調(diào)miR-128能抑制外泌體的治療作用,提示外泌體通過miR-128發(fā)揮作用。

圖4 BM-MSCS外泌體通過miR-128發(fā)揮治療作用A.qRT-PCR檢測miR-128的表達;B、C.自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達;D.各組TNF-α、IL-6水平。與sham組比較,*P<0.05;與MCAO組比較,#P<0.05;與exo組比較,ΔP<0.05

5.miR-128靶向調(diào)控GSK3B:借助Targetscan靶向關(guān)系預測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miR-128和GSK3B存在特異性結(jié)合位點,雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示較GSK3B-WT+miR-128NC組,GSK3B-WT+miR-128mimic組的熒光素酶活性下降(P<0.05,圖5A)。此外,與sham組比較,MCAO大鼠腦組織中GSK3B的mRNA和蛋白表達增強(P均<0.05,圖5中B、C)。

圖5 miR-128與GSK3B的靶向關(guān)系驗證A.GSK3B和miR-128的特異性結(jié)合位點以及靶向關(guān)系驗證結(jié)果;B、C.MCAO大鼠腦組織中GSK3B的表達檢測結(jié)果

6.敲減GSK3B能部分挽救exo-miR-128 inhibitor發(fā)揮的作用:Western blot法和ELISA結(jié)果顯示(圖6),與MCAO組比較,exo-miR-128 inhibitor組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達升高,TNF-α、IL-6濃度上調(diào),而較exo-miR-128 inhibitor組,exo-miR-128 inhibitor+si-GSK3B組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達下降,TNF-α、IL-6濃度降低(均P<0.05)。以上實驗結(jié)果證實,下調(diào)外泌體中miR-128的表達能抑制外泌體的治療作用,但轉(zhuǎn)染si-GSK3B后外泌體的治療作用得到部分恢復。

圖6 敲減GSK3B能部分挽救exo-miR-128 inhibitor發(fā)揮的作用A、B.各組自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的蛋白表達;C.各組TNF-α、IL-6水平。與sham組比較,*P<0.05;與MCAO組比較,#P<0.05;與exo-miR-128 inhibitor組比較,ΔP<0.05

討 論

近年來BM-MSCS在缺血性腦病治療方面取得良好成效。研究表明BM-MSCS釋放的外泌體能維持缺血缺氧狀態(tài)下神經(jīng)細胞存活[10]。此外,間充質(zhì)干細胞外泌體能夠分泌miR-542-3p抑制TLR4來抑制炎癥發(fā)生并預防腦梗死[11]。本研究首先結(jié)合生物信息學篩選在急性腦梗死中差異表達的miRNA,由于BM-MSCS一般在疾病中發(fā)揮治療作用,因此本研究選擇在急性腦梗死中低表達的miRNA進行研究。Mao等[6]研究發(fā)現(xiàn),miR-128-3p表達降低會增加小鼠腦梗死體積而增強miR-128-3p的表達有利于促進缺血性腦損傷中神經(jīng)元的存活。本研究進一步對MCAO大鼠模型腦組織中miR-128的表達進行檢測,發(fā)現(xiàn)miR-128在MCAO大鼠腦組織中的表達被抑制,這與Mao等[6]的研究結(jié)果一致。此外,加入BM-MSCS外泌體后miR-128表達增強,提示BM-MSCS外泌體中miR-128高表達。

研究顯示,自噬在缺血性腦損傷中發(fā)揮重要作用,長期自噬能導致細胞死亡,也稱為Ⅱ型程序性細胞死亡[12]。已有研究證實,短暫性大腦中動脈閉塞模型和缺氧/糖剝奪/再灌注細胞模型中自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1的表達升高[13]。此外,腦梗死會誘導神經(jīng)炎癥也與腦損傷相關(guān),促炎細胞因子TNF-α、IL-6、MCP-1會促進炎性發(fā)生[14]。本研究通過功能實驗進一步證實了將外泌體注射進大鼠體內(nèi)能顯著抑制大鼠體內(nèi)自噬標志物LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的蛋白表達水平以及TNF-α和IL-6的濃度,改善MCAO大鼠的自噬與炎性反應,但下調(diào)miR-128后外泌體的治療作用被抑制,說明外泌體是通過分泌miR-128對MCAO大鼠發(fā)揮治療作用,因此本研究認為BM-MSCS外泌體中高表達的miR-128可能是腦梗死的潛在治療靶點。

本研究還發(fā)現(xiàn)miR-128能調(diào)控 GSK3B發(fā)揮作用。既往研究表明,GSK3B異常激活可觸發(fā)tau蛋白磷酸化,導致阿爾茨海默病的神經(jīng)元損傷和認知功能受損[15]。此外也有研究揭示了GSK3B抑制劑YQ138能夠通過激活Nrf2信號通路來預防谷氨酸和腦缺血引起的神經(jīng)元損傷[16]。本研究證實了GSK3B和miR-128之間存在靶向關(guān)系且GSK3B在MCAO大鼠腦組織中高表達。進一步設計挽救實驗驗證GSK3B在腦梗死中的作用發(fā)現(xiàn),當在外泌體中敲減miR-128抑制外泌體的治療作用后,下調(diào)GSK3B能部分恢復外泌體的功能。進一步揭示了BM-MSCS源性外泌體通過分泌miR-128調(diào)控GSK3B發(fā)揮細胞自噬與炎性抑制作用。

本研究仍存在一定不足,如未對大鼠體內(nèi)的自噬進行原位檢測,外泌體中發(fā)揮功能的分子除了miRNA,還有其他非編碼RNA如LncRNA或者circRNA,以及編碼RNA等,這都將是以后繼續(xù)研究的方向。

綜上所述,BM-MSCS外泌體源性miR-128可能通過靶向GSK3B抑制腦梗死自噬與炎性反應發(fā)生,過表達miR-128可能是緩解腦梗死缺血性損傷的潛在靶點。