黃 冰，遲 晨，蔣玉新，洪 沫，曹 冉，崔 麗，曹云峰（.大連博源醫(yī)學(xué)檢驗實驗室有限公司質(zhì)量部，遼寧大連 6000；.上海市生物醫(yī)藥技術(shù)研究院國家衛(wèi)生健康委員會計劃生育藥具重點(diǎn)實驗室，上海 0003）

同型半胱氨酸 (homocysteine，Hcy) 是用于心腦血管等疾病檢測的常規(guī)項目[1-3]，隨著質(zhì)譜方法的發(fā)展，使用同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（isotope dilution-liquid chromatography/tandem mass spectrometry，ID-LC/MS/MS)檢測Hcy的實驗室數(shù)量也逐漸增加，各實驗室間結(jié)果的可比性成為了質(zhì)譜檢測的主要挑戰(zhàn)。

能力驗證 (proficiency testing，PT) 是能力驗證組織者 (proficiency testing provider，PTP) 組織的，利用實驗室間比對，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評價參加者能力的活動。PT對于發(fā)現(xiàn)檢測中存在的共性及特殊問題[4-8]、實現(xiàn)不同實驗室間結(jié)果互認(rèn)具有重要意義[8-10]?；谏鲜霰尘?，本單位開展基于IDLC/MS/MS的“人血清中同型半胱氨酸測定能力驗證”活動，對各參加實驗室的結(jié)果進(jìn)行評定，并提出改善建議。

1 材料與方法

1.1 實驗室 本研究對象為分布在9個省份10個城市的14家質(zhì)譜檢測實驗室。

1.2 儀器與試劑 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（愛博才思）；微量移液器（艾本德）；磁力攪拌器（アズpeas株式會社）；多管渦旋混合儀（美國萊博特）；恒溫培養(yǎng)箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；高速冷凍離心機(jī)（長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；天平（上海天美天平儀器有限公司）；甲醇，乙腈 (Merck)；甲酸 (Sigma-Aldhich)；二硫蘇糖醇(Macklin)；同型半胱氨酸 (CATO)；同型半胱氨酸-D4 (CIL) 。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集與制備：收集健康志愿者的血清基質(zhì)150ml用于制備能力驗證樣品。根據(jù)初測值將不同來源的血清基質(zhì)分為高低二種濃度 (樣品A，樣品B，μmol/L)，分別充分混合、攪拌、靜置后分裝至無菌凍存管，規(guī)格為0.5ml/支。粘貼標(biāo)簽后儲存于-70℃冰箱。

1.3.2 樣品均勻性：從樣品總體中隨機(jī)抽取每種濃度樣品10個，采用ID-LC/MS/MS法將每個樣品重復(fù)測量2次；為防止漂移，2次測量按隨機(jī)次序進(jìn)行。參考CNAS-GL003《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》[11]，采用單因素方差分析法對檢驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計處理；P>0.05時認(rèn)為能力驗證樣品均勻。

1.3.3 樣品穩(wěn)定性：考察能力樣品在凍融1次、-20℃&50天、干冰運(yùn)輸90h 3個條件下穩(wěn)定性，從每種濃度包裝單元中隨機(jī)抽取各條件下的樣本3個以上，采用ID-LC/MS/MS法將每個樣品重復(fù)測量2次，以均勻性檢驗結(jié)果為第1次穩(wěn)定性數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗。P>0.05時認(rèn)為能力驗證樣品在該條件下穩(wěn)定。

1.3.4 樣品發(fā)放與檢測：每個實驗室隨機(jī)發(fā)放2種濃度的樣品各1支。樣品用泡沫盒加裝干冰運(yùn)輸，到達(dá)參加實驗室后立即置于-20℃保存。樣品開封后，各實驗室應(yīng)按照《參試指導(dǎo)書》要求盡快檢測。

1.3.5 能力評定：參考CNAS-GL002 《能力驗證結(jié)果的統(tǒng)計處理和能力評價指南》[12]及GB/T28043-2019《利用實驗室間比對進(jìn)行能力驗證的統(tǒng)計方法》[6]進(jìn)行能力評定。由參加實驗室的公議值確定指定值，指定值的不確定度不可忽略時，采用能力評定統(tǒng)計量Z’比分?jǐn)?shù)進(jìn)行能力評定。評定原則為：|Z’|≤2時“滿意”；2＜|Z’|＜3時“可疑”；|Z’|≥3時“不滿意”。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用單因素方差分析法和t檢驗法分別對能力驗證樣品進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性評價。采用格拉布斯檢驗法識別離群值，要求離群值的數(shù)量不超過總數(shù)量的20%。采用穩(wěn)健算法A計算指定值和能力評定標(biāo)準(zhǔn)差[13]。使用EXCEL編制模板，驗證后完成計算。

2 結(jié)果

2.1 樣品均勻性 見表1。采用單因素方差分析時，在α=0.05的檢驗水準(zhǔn)下，樣品A和樣品B均滿足均勻性要求。

表1 同型半胱氨酸均勻性檢驗

2.2 樣品穩(wěn)定性 見表2。采用t檢驗時，在α=0.05的檢驗水準(zhǔn)下，樣品A和樣品B在穩(wěn)定性檢驗條件下均滿足穩(wěn)定性要求。

表2 同型半胱氨酸穩(wěn)定性檢驗

2.3 能力驗證結(jié)果 回報結(jié)果的14家參加實驗室反饋結(jié)果良好，沒有粗大誤差和異常值，參加實驗室結(jié)果統(tǒng)計量結(jié)果見表3；能力評定統(tǒng)計量見表4。根據(jù)能力評定原則，參加實驗室二種濃度檢測結(jié)果均為滿意，滿意率為100%。

表3 參加實驗室結(jié)果統(tǒng)計量匯總

表4 能力評定統(tǒng)計量

3 討論

由于時效、經(jīng)濟(jì)、方法學(xué)要求、指標(biāo)適用范圍、信息不暢等原因，部分實驗室參加PT活動的可及性較差[14]。培養(yǎng)有能力在ISO/IEC 17043體系運(yùn)行下，組織部分常規(guī)項目PT活動的PTP，可有效緩解臨床檢驗中心壓力、增加檢測實驗室參加頻次、保障患者權(quán)益[15-17]。

明確要求同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（ID-LC/MS/MS)是本輪PT的一大創(chuàng)新，也是對現(xiàn)有需求缺口的補(bǔ)充[18-19]。本輪PT參加實驗室數(shù)量和實際回報結(jié)果數(shù)量均較少，數(shù)量不足容易產(chǎn)生極端能力評定結(jié)果，使能力驗證效力下降[14,20]，為PTP組織PT帶來了極大的挑戰(zhàn)。經(jīng)綜合分析，參加實驗室數(shù)量較少的原因有以下4條：①質(zhì)譜法在醫(yī)學(xué)檢驗界的應(yīng)用有待普及；②參加實驗室對PT活動的重要性認(rèn)識不夠；③PTP組織PT活動的經(jīng)驗不足；④參加實驗室對非政府性質(zhì)PTP的信任度不夠。針對上述問題，PTP需要優(yōu)化專業(yè)人才布局，在PT活動運(yùn)行中不斷積累經(jīng)驗，提升自己的技能，如改進(jìn)質(zhì)量管理體系、保證計劃運(yùn)作質(zhì)量、提供更專業(yè)的指導(dǎo)意見等。此外可借力權(quán)威平臺如中國合格評定國家認(rèn)可委員會（China National Accreditation Service for Conformity Assessment，CNAS）機(jī)構(gòu)、研究院等，加大對外宣傳力度，提高PTP知名度，使各實驗室認(rèn)識到PT的重要性。

參加實驗室使用ID-LC/MS/MS法檢測人血清中同型半胱氨酸的滿意率為100%。在排除偶然因素后對各實驗室的原始記錄進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)部分實驗室存在色譜峰未保留的情況；雖然未對評定結(jié)果造成影響，但變異度較高，因此仍建議實驗室選擇合適的色譜柱和洗脫條件，以保證Hcy具有適宜的保留時間，實現(xiàn)雜質(zhì)分離。