任婷婷，楊艷娥，馬歆花，王彥華（西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院兒科，西安 710038）

支氣管哮喘屬于常見的慢性非感染性疾病，常常影響兒童的健康[1]。支氣管哮喘可以發(fā)生于各年齡組，其發(fā)病率逐年上升[2]。支氣管哮喘的氣道慢性炎癥與氣道高反應(yīng)性相關(guān)，其急性發(fā)作期起病急、進(jìn)展快，容易出現(xiàn)氣道狹窄，難以根治，且易反復(fù)發(fā)作，不利于病情恢復(fù)[3]。因此，尋找與支氣管哮喘急性發(fā)作有關(guān)的標(biāo)志物對于指導(dǎo)臨床治療具有重要意義。囊泡相關(guān)膜蛋白2(vesicleassociated membrane protein 2，VAMP2)是可溶性N -乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(soluble N-ethtlmaleimide-sensitive fusion factor attachment protein receptors，SNAREs)的成員，是膜融合所必需的[4]。VAMP2最初是在大鼠大腦中被發(fā)現(xiàn)的，它在突觸囊泡的融合中起著關(guān)鍵作用，可能有助于離子通道蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)。有研究表明circ_CSNK1E/miRNA-34a-5p/VAMP2軸在哮喘中起重要調(diào)節(jié)作用[5]?；诖?，推測VAMP2可能參與支氣管哮喘的發(fā)病，因此，本研究探討血清VAMP2在支氣管哮喘急性期患兒中的表達(dá)及臨床意義，為臨床治療提供幫助。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2017年6月～2020年6月在西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院兒科就診的94例支氣管哮喘急性期患兒（研究組），根據(jù)《支氣管哮喘防治指南》[6]對94例急性期患兒病情嚴(yán)重程度進(jìn)行分級，其中，急性期輕度哮喘患兒36例（輕度組），中度哮喘患兒31例（中度組）和重度哮喘患兒27例（重度組）。研究組中，男性50例，女性44例，年齡3～13（6.34±3.31）歲，平均體重指數(shù)（body mass index，BMI）15.43±3.22kg/m2，膳食鈣攝入量376.32±10.34mg/天，家族過敏史35.11%，家族哮喘史32.98%。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患兒均符合中華醫(yī)學(xué)會對支氣管哮喘的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②均處于急性發(fā)作期。排除標(biāo)準(zhǔn)：①先天性心臟疾病患者；②肝腎等重要臟器功能不全者；③并發(fā)自身免疫系統(tǒng)疾病者；④有家族哮喘遺傳病史、過敏史者，在近一個月內(nèi)出現(xiàn)呼吸道感染者。另外選取同期在本院入院復(fù)查的支氣管哮喘緩解期患兒30例作為對照組，其中，男性18例，女性12例，年齡3～13（6.45±3.48）歲，BMI 15.21±3.28 kg/m2，膳食鈣攝入量377.12±11.21 mg/天，家族過敏史30.00%，家族哮喘史36.67%。兩組性別、年齡、BMI，膳食鈣攝入量、家族過敏史、家族哮喘史比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2/t=0.426，0.157，0.324，0.362，0.265，0.138，均P＞0.05），具有可比性。本研究獲得本院倫理委員會批準(zhǔn)，所有受試者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 酶標(biāo)儀[型號：SpectraMax i3x，美谷分子儀器（上海）有限公司]，肺功能檢查儀（型號：MicroLab，上海涵飛醫(yī)療器械有限公司），人VAMP2酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（批號：FYEH11229，武漢菲越生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集：抽取所有受試者入院第二日清晨空腹肘靜脈血5ml，血液室溫下自然凝固15min，以3 000r/min離心15min，收集上清血液，放置-80℃冰箱中保存待測。

1.3.2 ELISA法檢測血清VAMP2水平：嚴(yán)格按照人VAMP2 ELISA試劑盒說明書配制一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，采用酶標(biāo)儀測定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品在450 nm處的吸光度值，繪制VAMP2標(biāo)準(zhǔn)品回歸曲線。于-80℃冰箱中取適量血清樣本，解凍，測定各樣本在450 nm處的吸光度值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線計算血清VAMP2水平。

1.3.3 肺功能指標(biāo)的測定：呼氣峰流量（peak expiratory flow，PEF），第1秒用力呼氣量（forced expiratory volume in 1 second，F(xiàn)EV1），用力肺活量（forced vital capacity，F(xiàn)VC）肺功能相關(guān)指標(biāo)用肺功能檢查儀進(jìn)行測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，計量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組數(shù)據(jù)組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，三組數(shù)據(jù)組間比較進(jìn)行F檢驗(yàn)，進(jìn)一步兩兩比較行LSD-t檢驗(yàn)；計數(shù)資料用“n”描述，組間比較采用卡方檢驗(yàn)。Pearson法分析支氣管哮喘急性期患兒血清VAMP2與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性；采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線分析血清VAMP2水平對支氣管哮喘急性期患兒發(fā)作的診斷價值。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對照組與研究組血清VAMP2表達(dá)水平及肺功能指標(biāo)比較 見表1。兩組間單因素分析顯示，研究組血清VAMP2水平高于對照組，PEF，F(xiàn)EV1和FVC低于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.001）。

表1 對照組與研究組血清VAMP2表達(dá)水平及肺功能指標(biāo)比較（±s）

表1 對照組與研究組血清VAMP2表達(dá)水平及肺功能指標(biāo)比較（±s）

項目對照組（n=30）研究組（n=94）tP VAMP2（ng/L）5.23±1.218.01±2.126.8240.000 PEF（%）87.34±7.2373.45±7.129.2690.000 FEV1（%）82.45±10.3165.34±8.349.2220.000 FVC（%）89.89±10.0369.34±9.1410.4710.000

2.2 研究組中不同病情程度患兒血清VAMP2表達(dá)水平比較 多組間單因素分析顯示，重度組、中度組和輕度組患兒血清VAMP2水平依次為9.50±3.04ng/L,8.01±1.21ng/L和6.85±1.01ng/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=15.412，P<0.05）。重度組血清VAMP2水平高于中度組和輕度組（t=4.269,7.851），中度組血清VAMP2水平高于輕度組（t=4.269），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.05）。

2.3 血清VAMP2表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)的相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，血清VAMP2水平與支氣管哮喘急性期患兒PEF，F(xiàn)EV1和FVC均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.506，-0.487，-0.399，均P<0.05）。

2.4 血清VAMP2對支氣管急性期哮喘患兒發(fā)作的診斷價值分析 見圖1。血清VAMP2診斷支氣管哮喘急性期患兒發(fā)作的曲線下面積為0.909（95%CI：0.857～0.960），截斷值為6.802 ng/L，敏感度和特異度分別為77.7%，93.3%，提示血清VAMP2可以作為輔助診斷支氣管哮喘急性發(fā)作的有效指標(biāo)。

圖1 血清VAMP2水平診斷支氣管哮喘急性期患兒發(fā)作的ROC曲線

3 討論

支氣管哮喘被認(rèn)為是一種非傳染性的慢性氣道炎癥性疾病，以氣道重塑和氣道高反應(yīng)性為特征[7]。哮喘被世界衛(wèi)生組織列為疾病中的四大難治性疾病之一，也是十大死亡原因之一。臨床研究表明，支氣管哮喘多在清晨或夜間發(fā)作或加劇?？墒苓z傳、氣候轉(zhuǎn)變、空氣污染、精神狀況等多種因素的影響。支氣管哮喘在兒童中是一種發(fā)病率比較高的疾病，患兒在發(fā)病后若不及時治療，其肺部功能將遭到嚴(yán)重破壞，甚至可能會惡化發(fā)展為肺源性心臟病，從而危及生命[8]，給人類社會帶來沉重的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，積極尋找與支氣管哮喘有關(guān)的生物標(biāo)志物至關(guān)重要。

患兒支氣管哮喘的發(fā)生、發(fā)展與多種細(xì)胞因子參與的氣道炎性反應(yīng)有關(guān)[9]。VAMP2是SNAREs蛋白家族成員之一，在多種組織中表達(dá)，其主要分布在囊泡膜上，在囊泡融合、神經(jīng)遞質(zhì)釋放和囊泡內(nèi)吞作用中發(fā)揮重要作用，已證明VAMP2可調(diào)節(jié)Ca2+水平在神經(jīng)遞質(zhì)釋放中發(fā)揮重要的作用[10-11]。也有研究顯示，VAMP2可在腫瘤組織中異常表達(dá)，例如在膀胱癌中的表達(dá)升高，導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞的異常進(jìn)展和侵襲，進(jìn)而導(dǎo)致膀胱癌細(xì)胞轉(zhuǎn)化為高級別腫瘤[12]。VAMP2可以在心臟、神經(jīng)纖維和骨骼肌中表達(dá)，參與軀體性和非軀體性骨骼肌的發(fā)育[13]。值得注意的是，XU等[14]研究顯示肺泡型細(xì)胞中VAMP2蛋白表達(dá)的升高會導(dǎo)致肺表面活性劑分泌的減少，而肺表面活性物質(zhì)對哮喘急性發(fā)作具有一定的治療作用[15]。先前也有研究證實(shí)SNAREs蛋白及亞型在肺部炎癥的嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞中有表達(dá)[16]，且與這些細(xì)胞的炎性釋放有關(guān)[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)支氣管哮喘急性期患兒血清VAMP2水平高于支氣管哮喘緩解期患兒，并且隨著支氣管哮喘急性期患兒病情嚴(yán)重程度的增加，血清VAMP2水平呈逐漸升高趨勢，提示VAMP2在支氣管哮喘的急性發(fā)作過程中發(fā)揮一定作用，且能夠在一定程度上反映患兒病情嚴(yán)重程度。

支氣管哮喘發(fā)作時病情進(jìn)展快，若不能及時干預(yù)可能會出現(xiàn)心律失常、呼吸衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，危及患兒生命，而肺功能指標(biāo)PEF，F(xiàn)EV1，F(xiàn)VC與患兒病程密切相關(guān)，檢測肺功能有利于幫助支氣管哮喘急性期治療方案的制定與實(shí)施[19]。李穎等[20]研究結(jié)果顯示，支氣管哮喘患者PEF，F(xiàn)EV1和FVC均低于健康組；另外，李曉剛等[21]研究報道，急性發(fā)作期支氣管哮喘患兒PEF，F(xiàn)EV1和FVC均較健康兒童低。本研究結(jié)果顯示，支氣管哮喘急性期患兒的PEF，F(xiàn)EV1和FVC明顯降低，這一結(jié)果與李穎等[20-21]研究結(jié)果具有相似性，說明處于哮喘急性期的患兒肺功能下降，提示支氣管哮喘發(fā)作對患兒肺功能有一定的影響。分析血清VAMP2水平與肺功能指標(biāo)相關(guān)性，結(jié)果顯示血清VAMP2水平與肺功能指標(biāo)PEF，F(xiàn)EV1，F(xiàn)VC呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，推測血清VAMP2與支氣管哮喘患兒肺功能密切相關(guān)，檢測血清VAMP2的水平可以反映患兒肺功能的情況。此外，ROC曲線分析顯示，血清VAMP水平對于診斷支氣管哮喘急性發(fā)作期具有一定的價值，提示檢測血清VAMP水平有利于輔助評估支氣管哮喘急性發(fā)作期情況。但本研究僅初步探討了血清VAMP2水平與支氣管哮喘急性發(fā)作的關(guān)系，其在支氣管哮喘中的作用機(jī)制，需要在今后補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)內(nèi)容進(jìn)行深入分析。

綜上所述，支氣管哮喘急性期患兒血清VAMP2水平異常升高，且血清VAMP2水平與急性期患兒發(fā)作的嚴(yán)重程度、肺功能密切相關(guān)，血清VAMP水平可以作為診斷支氣管哮喘急性發(fā)作的輔助手段。本研究的不足之處在于，所研究的樣本較少，可能會造成數(shù)據(jù)存在一定的偏差，因此在后期還需加大樣本量進(jìn)行多次重復(fù)研究。