鄭文隆，徐 剛，楊立榮，，吳堅(jiān)平，

(1.浙江大學(xué)杭州國際科創(chuàng)中心生物與分子智造研究院，浙江 杭州 311200；2.浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310058)

利用生物催化技術(shù)制備手性化學(xué)品具有重要意義，經(jīng)過多年努力，我國學(xué)者已經(jīng)取得了很多重要成果。如，歐陽平凱院士等主持的國家重點(diǎn)研究發(fā)展計(jì)劃(973計(jì)劃)“生物催化和生物轉(zhuǎn)化中關(guān)鍵問題的基礎(chǔ)研究”等項(xiàng)目開發(fā)了一系列利用生物法制備高值手性化學(xué)品的技術(shù)路線(d-泛酸、d-泛醇和苯基-1,2-乙二醇等)[1-5]。近年來，利用L-蘇氨酸醛縮酶(L-threonine aldolase,LTA,EC 4.1.2.X)催化合成β-羥基-α-氨基酸成為研究熱點(diǎn)之一[6]。LTA是一種磷酸吡哆醛(PLP)依賴酶，能夠可逆催化甘氨酸和多種醛(芳香醛和脂肪醛)生成β-羥基-α-氨基酸[6](圖1(a))。該過程一步反應(yīng)生成2個(gè)手性中心，在不對(duì)稱合成方面應(yīng)用潛力巨大[7]。β-羥基-α-氨基酸是一類重要的手性砌塊，在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和食品等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[8]，可用于合成多種藥物，如新冠口服藥阿茲夫定、艾滋病用藥達(dá)蘆那韋、帕金森癥特效藥屈昔多巴、獸用廣譜抗生素氟苯尼考等[9](圖1(b))。

圖1 β-羥基-α-氨基酸的制備及其在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用Fig.1 Preparation of β-hydroxy-α-amino acid and its application in pharmaceutical field

化學(xué)法合成β-羥基-α-氨基酸存在過程復(fù)雜、條件苛刻、環(huán)境污染大及產(chǎn)物光學(xué)純度低等缺點(diǎn)，不符合綠色可持續(xù)發(fā)展理念[10]。然而，生物催化過程高效綠色，利用生物法制備手性化學(xué)品具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物立體選擇性高和環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)[11-12]?；诖?，本文綜述了LTA新酶挖掘、催化機(jī)制解析、分子改造和手性砌塊合成等方面的研究進(jìn)展，以期為LTA的深入研究和應(yīng)用提供思路和借鑒，促進(jìn)結(jié)構(gòu)多樣、功能豐富的β-羥基-α-氨基酸生物合成體系的構(gòu)建。

1 LTA的來源及分類

LTA來源十分廣泛，普遍存在于微生物、動(dòng)物和植物中。該酶參與生物體內(nèi)甘氨酸和蘇氨酸代謝，可裂解蘇氨酸生成甘氨酸，是生物體內(nèi)產(chǎn)生甘氨酸的重要途徑，其中微生物來源的LTA研究最為廣泛。如，Escherichia coli(EcLTA)[13]、Aeromonas jandaei(AjLTA)[14]、Thermotoga maritima(TmLTA)[15]、Pseudomonas putida(PpLTA)[16]、Bacillus nealsonii(BnLTA)[17]、Leishmania major(LmLTA)[9]、Actinocorallia herbida(AhLTA)[18]、Streptomycessp.(SsLTA)[19]、Saccharomyces cerevisiae(ScLTA)[20]等來源的LTA(表1)。不同來源的LTA基因序列同源性差異較大，如TmLTA和BnLTA的序列同源性僅有10.95%(圖2)。

表1 部分文獻(xiàn)報(bào)道的LTA及其分類

紅色表示一致序列；藍(lán)綠色表示保守序列；白色表示不保守序列圖2 不同來源LTA多序列比對(duì)Fig.2 Multiple sequence alignment of LTAs from different microorganisms

研究表明，LTA對(duì)β羥基-α-氨基酸的Cα具有嚴(yán)格的立體選擇性(對(duì)映體過量值(e.e.值)>99%)，而對(duì)其Cβ的立體選擇性不高[21]。根據(jù)對(duì)L型蘇氨酸Cβ的選擇性，LTA進(jìn)一步被分為L-TA(EC 4.1.2.5)、L-allo-TA(EC 4.1.2.49)和L-low-TA(EC 4.1.2.48)[25]。如：L-TA對(duì)L-syn-蘇氨酸選擇性高，包括PpLTA、BnLTA等；L-allo-TA對(duì)L-anti-蘇氨酸選擇性高，包括AjLTA、TmLTA等；而L-low-TA的構(gòu)型偏好性不明顯，包括EcLTA和ScLTA等[22]。以上分類僅基于LTA對(duì)L型蘇氨酸的非對(duì)映體選擇性[26]。同一種酶對(duì)不同的醛基底物也會(huì)產(chǎn)生不同的構(gòu)型偏好性，如PaLTA催化合成芳香類β羥基-α-氨基酸時(shí)普遍展現(xiàn)出L-syn構(gòu)型產(chǎn)物偏好性[6]。

2 LTA的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

目前，已有多個(gè)不同來源的LTA晶體結(jié)構(gòu)被解析，包括Neptunomonas marina(NmLTA,PDB：7YVR)[8]、Escherichia coli(EcLTA,PDB：4LNJ)[13]、Thermotoga maritima(TmLTA,PDB：1LW4)[15]、Aeromonas jandaei(AjLTA，PDB：3WGB)[14，27]和Pseudomonas putida(PpLTA，PDB：5VYE)[17，28]、Leishmania major(LmLTA，PDB：1SVV)[9]等。盡管它們的氨基酸序列存在較大差異，但空間結(jié)構(gòu)類似，序列比對(duì)顯示不同結(jié)構(gòu)之間的均方根偏差(RMSD)<0.25 nm，表明它們的空間結(jié)構(gòu)差異較小。LTA為同源四聚體，由4個(gè)相同的亞基聚合而成，每個(gè)單亞基由大小兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成(圖3)。在范德華力、疏水相互作用和氫鍵等作用下，4個(gè)亞基的大結(jié)構(gòu)域相互聚集，而4個(gè)小結(jié)構(gòu)域分布在外側(cè)。每個(gè)亞基具有一個(gè)活性中心，位于大小兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的交界處，該結(jié)構(gòu)特點(diǎn)導(dǎo)致LTA活性中心的空間較大，由此使得LTA底物譜十分廣泛[17,26]。LTA活性中心的結(jié)構(gòu)復(fù)雜，每個(gè)活性中心由相鄰3個(gè)亞基的氨基酸殘基組成。如，EcLTA的D亞基活性中心由A、C和D這3個(gè)亞基的相應(yīng)氨基酸組成[13]。

圖3 不同來源LTAs三維結(jié)構(gòu)比對(duì)及EcLTA的D亞基空間結(jié)構(gòu)特寫Fig.3 Structure alignments of various LTAs and the view of subunit D of EcLTA

3 LTA的催化機(jī)制

Di Salvo等[13]以EcLTA為對(duì)象初步解析了LTA的催化機(jī)制：與其他PLP依賴酶類似，EcLTA催化反應(yīng)前PLP與酶活性中心的賴氨酸殘基形成內(nèi)醛亞胺復(fù)合體(PLP-酶)。反應(yīng)過程中，甘氨酸(Gly)進(jìn)入活性中心取代賴氨酸，與PLP生成外醛亞胺復(fù)合體(PLP-Gly)。甘氨酸的Cα與PLP吡啶環(huán)垂直的碳?xì)滏I能夠與輔酶形成共軛結(jié)構(gòu)，易于斷裂去質(zhì)子化形成Cα碳負(fù)離子。當(dāng)?shù)孜锶┙咏麮α?xí)r，Cα碳負(fù)離子的電子攻擊醛的羰基碳原子，形成烷氧負(fù)離子。最后，經(jīng)過質(zhì)子傳遞，烷氧負(fù)離子獲得氫原子形成β羥基(圖4(a))。EcLTA中His83和His126能夠與Cβ的羥基形成氫鍵，這兩個(gè)殘基在LTA家族中高度保守(圖2)。由此他們推斷，His83和His126在羥基形成過程中起到質(zhì)子傳遞作用，于是構(gòu)建了一系列突變體進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：His126系列突變體的酶活保持不變或者提高，說明His126不參與催化反應(yīng)的質(zhì)子傳遞；His83系列突變體都喪失了催化活性，然而在加入過量PLP后，突變體卻能表現(xiàn)出微弱活性，由此認(rèn)為His83也沒有參與質(zhì)子傳遞，可能是活性中心的水分子參與質(zhì)子傳遞，His83僅僅起到固定水分子的作用。

圖4 LTA催化機(jī)制Fig.4 Catalytic mechanism of LTA

2022年，Rocha等[29]利用量子力學(xué)(QM/MM)法在原子水平上進(jìn)一步解析了LTA的催化機(jī)制(圖4(b))，該反應(yīng)可以概括為3個(gè)步驟：EA2去質(zhì)子化、C—C鍵斷裂和甘氨酸釋放；EA1在活性中心的位置非常重要，決定反應(yīng)是否發(fā)生；反應(yīng)的限速步驟是C—C鍵斷裂，需要69.9 kJ/mol能量，相比其他步驟更加困難；Lys224、PLP的磷酸基團(tuán)和水分子起著重要的質(zhì)子/電子傳遞作用，進(jìn)一步證實(shí)水分子參與反應(yīng)質(zhì)子傳遞，而非His83。

4 LTA催化特性及存在的問題

利用LTA制備手性β-羥基-α-氨基酸具有反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物對(duì)映體選擇性嚴(yán)格、醛基底物范圍廣以及原子經(jīng)濟(jì)性高等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用潛力巨大。但野生酶的應(yīng)用存在一些瓶頸，如非對(duì)映體選擇性低、氨基底物譜窄和反應(yīng)轉(zhuǎn)化率不高等問題[12,21]。在LTA催化合成β-羥基-α-氨基酸過程中，對(duì)其Cα具有嚴(yán)格的立體選擇性，而對(duì)Cβ碳原子的立體選擇性不高，得到的往往是L-syn和L-anti構(gòu)型混合物。Franz等[26]、Fesko等[23]、Steinreiber等[30]和Liu等[31]研究發(fā)現(xiàn)，該酶對(duì)乙醛等天然底物具有較高的非對(duì)映體選擇性(>90%)，而對(duì)大部分脂肪醛和芳香醛等非天然底物的非對(duì)映體選擇性較低(<65%)。由于醛縮反應(yīng)是可逆反應(yīng)，受熱力學(xué)平衡影響，體系中2種非對(duì)映體的濃度不斷接近，產(chǎn)物的非對(duì)映體過量值(d.e.值)不斷降低。有學(xué)者嘗試通過動(dòng)力學(xué)控制得到高光學(xué)純?chǔ)?羥基-α-氨基酸，然而這種策略是以犧牲轉(zhuǎn)化率為代價(jià)的，造成底物轉(zhuǎn)化率不高、催化效率降低[26]。

為了提高LTA的非對(duì)映體選擇性，有學(xué)者在反應(yīng)體系中添加有機(jī)溶劑，通過改變酶的催化環(huán)境來影響活性中心的微環(huán)境。Chen等[32]通過在反應(yīng)體系中添加體積分?jǐn)?shù)10%～20%的乙腈、丙酮、二甲基甲酰胺(DMF)和二甲基亞砜(DMSO)等溶劑，LTA的非對(duì)映體選擇性提升了20%～30%。Cech等[33]發(fā)現(xiàn)，LTA的非對(duì)映體選擇性與有機(jī)溶劑種類有關(guān)，當(dāng)反應(yīng)體系中加入甲苯時(shí)得到的產(chǎn)物是L-anti-苯絲氨酸，而加入甲基四氫呋喃時(shí)得到的是L-syn-苯絲氨酸。

酶的活性和穩(wěn)定性也是其工業(yè)化應(yīng)用的重要因素，野生LTA對(duì)非天然底物的活性較低，且穩(wěn)定性差。同時(shí)，非對(duì)映體選擇性與活性和穩(wěn)定性之間存在trade-off現(xiàn)象，當(dāng)非對(duì)映體選擇性提升時(shí)，往往伴隨著活性、穩(wěn)定性下降。Zheng等[17]利用分子改造技術(shù)將BnLTA的非對(duì)映體選擇性從65.4%提高至93.1%，而比酶活卻從2.9 U/mg降至1.2 U/mg。近年來，利用分子改造提高LTA非對(duì)映體選擇性取得了巨大進(jìn)展，詳細(xì)內(nèi)容將在下節(jié)進(jìn)行介紹。

LTA催化的醛縮反應(yīng)有兩個(gè)底物，分別是醛基底物和氨基底物(圖1(a))。理論上，不同的醛基底物和氨基底物組合能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)豐富、功能各異的β-羥基-α-氨基酸。LTA醛基底物混雜性非常高，能夠識(shí)別多種脂肪醛、芳香醛等作為底物[26]。相反，野生LTA氨基底物混雜性卻很低，多數(shù)LTA只能接受甘氨酸為氨基底物，對(duì)其他的非天然氨基底物識(shí)別能力差。目前只有4個(gè)LTA能夠以D-丙氨酸或D-絲氨酸等作為氨基底物合成β-羥基-α-氨基酸，但活性普遍較低[22,27,34-35]。國內(nèi)外多個(gè)團(tuán)隊(duì)利用LTA制備β-羥基-α-氨基酸的研究也都以甘氨酸為氨基底物。如，日本Toyama Prefectural大學(xué)Yamada團(tuán)隊(duì)利用LTA催化甘氨酸和苯甲醛制備苯絲氨酸[28,36]。中科院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所朱敦明教授團(tuán)隊(duì)[32,37]、福州大學(xué)林娟教授團(tuán)隊(duì)[18]、浙江大學(xué)吳堅(jiān)平教授團(tuán)隊(duì)[9,38]和上海交通大學(xué)馮雁教授團(tuán)隊(duì)[8]等利用甘氨酸和對(duì)甲砜基苯甲醛合成對(duì)甲砜基苯絲氨酸。江南大學(xué)倪曄教授團(tuán)隊(duì)[10]利用甘氨酸和呋喃醛合成手性呋喃絲氨酸?？梢姡琇TA氨基底物混雜性低的缺陷極大限制了產(chǎn)物β-羥基-α-氨基酸的多樣性。

由于LTA催化的醛縮反應(yīng)為可逆反應(yīng)，熱力學(xué)平衡導(dǎo)致反應(yīng)轉(zhuǎn)化率不高。因此在反應(yīng)時(shí)，一般采取甘氨酸過量的辦法提高轉(zhuǎn)化率，當(dāng)甘氨酸和底物醛的摩爾比為10∶1時(shí)，轉(zhuǎn)化率超過60%[17]。此外，轉(zhuǎn)化率也受醛基底物種類和助溶劑的影響，溶解度高的醛基底物轉(zhuǎn)化率高，適當(dāng)添加助溶劑能夠增加醛基底物濃度，進(jìn)一步提高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率。Zheng等[17,39]通過添加25% DMF作為助溶劑，對(duì)甲砜基苯甲醛轉(zhuǎn)化率超過70%。Wang等[18]使用30%乙腈反應(yīng)體系，底物轉(zhuǎn)化率超過90%。Cai等[40]使用40%乙醇反應(yīng)體系，對(duì)硝基苯甲醛轉(zhuǎn)化率超過90%，但大量使用有機(jī)溶劑不符合綠色生物催化的要求。

5 LTA的分子改造

野生型LTA制備β-羥基-α-氨基酸存在非對(duì)映體選擇性低、活性和穩(wěn)定性差、氨基底物譜窄以及轉(zhuǎn)化率不高等問題，不能滿足工業(yè)化應(yīng)用需求。利用蛋白質(zhì)工程手段探究LTA結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系并對(duì)其進(jìn)行分子改造是提高該酶催化魯棒性的有效方法。最近，通過定向進(jìn)化、理性和半理性設(shè)計(jì)提高LTA非對(duì)映體選擇性、活性和穩(wěn)定性取得了巨大進(jìn)展。然而，利用分子改造擴(kuò)展氨基底物譜、提高轉(zhuǎn)化率的研究相對(duì)較少。

5.1 高通量篩選方法

定向進(jìn)化和半理性設(shè)計(jì)是LTA工程化改造的主要手段，該過程會(huì)產(chǎn)生大量的突變體。開發(fā)高通量篩選方法從大量突變體中快速獲得陽性突變是提高該酶進(jìn)化效率的關(guān)鍵。目前，針對(duì)LTA活性、穩(wěn)定性和選擇性等方面開發(fā)了多種高通量篩選方法。LTA活性改造常用生長偶聯(lián)法進(jìn)行高通量篩選。如，構(gòu)建甘氨酸營養(yǎng)缺陷型菌株，利用LTA裂解β-羥基-α-氨基酸產(chǎn)甘氨酸的特性，可以快速篩選出酶活提高的突變體。Giger等[24]和Bulut等[41]利用該方法分別對(duì)E.coliMG1655和P.putida進(jìn)行底盤細(xì)胞改造構(gòu)建甘氨酸營養(yǎng)缺陷型宿主，用于高活性LTA的篩選。Lee等[42]利用乙醛的細(xì)胞毒性構(gòu)建生長依賴型系統(tǒng)篩選活性提高的LTA突變體。因?yàn)長TA能夠催化乙醛和甘氨酸生成蘇氨酸，高活性突變株會(huì)快速消耗乙醛，降低培養(yǎng)基毒性，正常生長繁殖。該方法既能篩選突變體的活性，還可以應(yīng)用于有機(jī)溶劑耐受性、熱穩(wěn)定性等功能突變體的篩選。Chen等[32]耦聯(lián)L-TA和L-threo-苯絲氨酸脫水酶(L-threo-PSDH)構(gòu)建了活性和立體選擇性分步可視化篩選方法(圖5(a))。L-threo-苯絲氨酸脫水酶能夠催化L-threo-苯絲氨酸生成相應(yīng)的酮酸，但不能識(shí)別L-erythro-苯絲氨酸，因此在反應(yīng)過程中檢測(cè)醛基底物消耗量和酮酸的生成量，可間接計(jì)算突變體的活性和非對(duì)映體選擇性。該方法依賴L-threo-苯絲氨酸脫水酶的活性和選擇性，對(duì)不同醛基底物適配性需要進(jìn)一步優(yōu)化。Zheng等[39]和Li等[43]開發(fā)了基于醛縮反應(yīng)逆反應(yīng)的高通量篩選方法，用于篩選LTA突變體的活性和非對(duì)映體選擇性(圖5(b))。該方法利用2,4-二硝基苯肼(DNPH)顯色法檢測(cè)裂解反應(yīng)生成的醛，通過分別檢測(cè)同一個(gè)突變體對(duì)不同構(gòu)型β-羥基-α-氨基酸的催化效率，然后計(jì)算突變體的活性和選擇性。但需要注意的是，只有LTA催化合成反應(yīng)和裂解反應(yīng)的活性呈正相關(guān)時(shí)，該方法才能夠使用。Zheng等[39]利用該方法獲得了非對(duì)映體選擇性大于99%的突變體，Li等[41]利用該方法篩選到的突變體的非對(duì)映體選擇性是野生型的5.1倍。

圖5 LTA高通量篩選方法Fig.5 High throughput screening method for LTA

5.2 非對(duì)映體選擇性改造

非對(duì)映體選擇性低是阻礙LTA廣泛應(yīng)用的主要因素。近年來，多個(gè)研究團(tuán)隊(duì)致力于研究和解決這一問題。利用蛋白質(zhì)工程手段對(duì)LTA活性中心的底物結(jié)合位點(diǎn)、活性口袋和底物通道進(jìn)行改造提高LTA的非對(duì)映體選擇性取得顯著進(jìn)展。Fesko等[27]利用生物信息學(xué)技術(shù)將AjLTA與多種來源的PLP依賴型酶進(jìn)行比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，家族特異性位點(diǎn)(family-specific positions，F(xiàn)SP)能夠通過控制PLP在活性中心的位置來影響酶的底物特異性，因此家族特異性位點(diǎn)可以作為探究LTA非對(duì)映體選擇性的重點(diǎn)。Chen等[32]對(duì)來源于Pseudomonassp的LTA進(jìn)行同源建模，并對(duì)底物結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：突變體D93F/E147D、D93H/E147D和D93N/E147D能夠?qū)崿F(xiàn)非對(duì)映體選擇性的提高甚至反轉(zhuǎn)，其中D93和E147兩個(gè)位點(diǎn)不同程度影響了2個(gè)非對(duì)映體的β-羥基與催化氨基酸(組氨酸)的距離，從而導(dǎo)致選擇性改變，為LTA的非對(duì)映體選擇性改造提供了新的思路。Wang等[44]對(duì)AhLTA的底物結(jié)合口袋進(jìn)行改造獲得了突變體N16A/E98S/Y314R，使非對(duì)映體選擇性從23%提高至81%。Li等[43]利用易錯(cuò)PCR對(duì)PpLTA隨機(jī)突變，從4 000多個(gè)突變體中獲得了A9V/Y13K/Y312R，該突變體的非對(duì)映體選擇性是野生酶的5.1倍，達(dá)到86%；分子動(dòng)力學(xué)模擬表明，與野生型相比，該突變體中存在額外的氫鍵、鹽橋、疏水相互作用和π-陽離子相互作用，底物結(jié)合口袋得到重塑。Zha等[11]從黑熊腸道微生物宏基因組中分離出LTA(Sz-1-2)并進(jìn)行了同源建模，在模型結(jié)構(gòu)的指導(dǎo)下對(duì)酶的活性中心進(jìn)行虛擬篩選獲得了突變體R318L/H128N，該突變體的非對(duì)映體選擇性從31.2%提高至93.7%。Zheng等[39]在LTA改造過程中提出了影響非對(duì)映體選擇性的路徑假說：認(rèn)為醛從不同的路徑進(jìn)入活性中心導(dǎo)致不同構(gòu)型β-羥基-α-氨基酸的形成(圖6)；并提出阻礙anti式產(chǎn)物路徑，強(qiáng)化syn式路徑的改造策略，獲得了非對(duì)映體選擇性>99%的突變體RS1?；谠摷僬f，他們利用空間位阻、靜電作用、π-π相互作用對(duì)LmLTA的底物進(jìn)出通道微環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)，獲得的突變體WFH非對(duì)映體選擇性從26.8%提高至96.3%[9]。隨后，Xu等[1]應(yīng)用Prelog規(guī)則解釋了LTA非對(duì)映體選擇性的形成機(jī)制(圖6(b))：當(dāng)Cα負(fù)離子的電子攻擊底物醛re-face時(shí)，形成anti式產(chǎn)物；相反，當(dāng)Cα負(fù)離子的電子攻擊底物醛的si-face，形成syn式產(chǎn)物。Prelog規(guī)則對(duì)指導(dǎo)催化碳-碳鍵不對(duì)稱合成酶的立體選擇性改造具有普適性，如轉(zhuǎn)醛酶、轉(zhuǎn)酮醇酶等。在路徑假說和Prelog規(guī)則的共同指導(dǎo)下，結(jié)合突變景觀分析和CAST/ISM突變策略對(duì)CpLTA進(jìn)行改造，獲得的突變體H305L/Y8H/V143R對(duì)L-syn-MTPS的非對(duì)映體選擇性從37.2%提高至99.4%，突變體H305Y/Y8I/W307E對(duì)L-anti-MTPS的非對(duì)映體選擇性反轉(zhuǎn)至97.2%。He等[8]使用同樣的策略對(duì)Neptunomonas marine來源的NmLTA進(jìn)行改造，突變體N18S/Q39R/Y319L的非對(duì)映體選擇性>99%。

圖6 LTA中的Prelog規(guī)則和路徑假說[1,39]Fig.6 Prelog rule and path hypothesis in LTA[1,39]

5.3 穩(wěn)定性和活性改造

酶的穩(wěn)定性和活性是生產(chǎn)應(yīng)用的重要指標(biāo)，提高LTA的穩(wěn)定性和活性有助于降低生產(chǎn)成本，減少三廢排放，進(jìn)一步增強(qiáng)該酶的工業(yè)應(yīng)用潛力。Baik等[19]對(duì)S.coelicolor來源的LTA熱穩(wěn)定性進(jìn)行改造，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：H177Y、A169T、D104N和F18I這4個(gè)突變體在60 ℃處理20 min后殘余酶活大幅提升，分別為85.7%、67.6%、62.1%和58.6%，是野生酶(10.6%)的5～8倍。Wieteska等[15]通過向TmLTA亞基間引入鹽橋或二硫鍵提高其穩(wěn)定性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：突變體P56C在80 ℃時(shí)的熱穩(wěn)定性提高了15%，且酶活不受影響；在改造過程中還獲得了活性提高的突變體W86E。Cai等[40]對(duì)PpLTA不穩(wěn)定的loop區(qū)域進(jìn)行改造，獲得的18點(diǎn)突變體EM-ALDO031在40%乙醇中的穩(wěn)定性是野生酶的30倍。Fang等[45]以BnLTA為研究對(duì)象探究了該酶非對(duì)映體選擇性和活性trade-off的問題，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)其活性中心微環(huán)境改造，獲得的突變體RS1-VR(T92V/E123R)比酶活達(dá)到18.65 U/mg，是原始酶的2倍，同時(shí)保持了較高的非對(duì)映體選擇性(94.21%)。He等[8]在改造NmLTA非對(duì)映體選擇性過程中獲得的突變體N18S/Q39R/Y319L，不僅其非對(duì)映體選擇性得到提高，同時(shí)酶活也從64.8 U/mg提高至95.7 U/mg，為目前報(bào)道的最高酶活。

6 LTA在手性合成中的應(yīng)用

利用LTA制備手性β-羥基-α-氨基酸原子經(jīng)濟(jì)性高，應(yīng)用前景廣。生物法制備氟苯尼考前體L-syn-對(duì)甲砜基苯絲氨酸是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。Zheng等[17]通過分子改造提高了BnLTA的非對(duì)映體選擇性，首次實(shí)現(xiàn)生物法制備L-syn-對(duì)甲砜基苯絲氨酸且d.e.值>99%，當(dāng)反應(yīng)體系中添加了25% DMF后，100 mmol/L底物的轉(zhuǎn)化率超過70%。Wang等[18]使用AhLTA突變體，在30%乙腈體系中進(jìn)行反應(yīng)，底物濃度為300 mmol/L，轉(zhuǎn)化率超過90%，產(chǎn)物d.e.值達(dá)到93.7%；隨后使用該產(chǎn)物制備L-syn-對(duì)甲砜基苯絲氨酸乙酯，產(chǎn)物純度超過99%。He等[8]在10% DMF反應(yīng)體系中催化100 mmol/L底物制備L-syn-對(duì)甲砜基苯絲氨酸，時(shí)空產(chǎn)率達(dá)到9.0 g/(L·h),工業(yè)應(yīng)用潛力巨大。

L-syn-3,4-二羥基苯絲氨酸(藥用名屈昔多巴)，是一種治療帕金森綜合征的特效藥。LTA可以一步催化3,4-二羥基苯甲醛和甘氨酸制備L-syn-3,4-二羥基苯絲氨酸，應(yīng)用潛力巨大。Zha等[11]利用全細(xì)胞催化制備l-syn-3,4-二羥基苯絲氨酸，其產(chǎn)物d.e.值達(dá)到95.4%，時(shí)空產(chǎn)率為1.6 g/(L·h)。相比于LTA制備l-syn-對(duì)甲砜基苯絲氨酸，該反應(yīng)有進(jìn)一步提升的空間。

L-syn-對(duì)硝基苯絲氨酸是氯霉素的中間體，余進(jìn)海等[46]利用重組表達(dá)LTA的大腸桿菌全細(xì)胞催化100 mmol/L對(duì)硝基苯甲醛和甘氨酸制備L-syn-對(duì)硝基苯絲氨酸，實(shí)現(xiàn)43%的轉(zhuǎn)化率。Cai等[40]使用PpLTA突變體在40%乙醇體系中反應(yīng)，底物質(zhì)量濃度為150 g/L(約815 mmol/L)，轉(zhuǎn)化率超過90%，但產(chǎn)物d.e.值僅為85%。Gong等[10]利用磁性材料(Fe3O4@MCM-41/SO2-4)制備固定化酶催化糠醛和甘氨酸縮合制備β-(2-呋喃)絲氨酸。該方法不僅能夠?qū)ι镔|(zhì)降解液進(jìn)行預(yù)處理降低糠醛生物毒性，還實(shí)現(xiàn)了高價(jià)值非天然氨基酸制備。

Chai等[47]將LTA應(yīng)用于DNA文庫編碼技術(shù)(DNA encoded library technology，DEL)，利用LTA底物譜廣的催化特性增加DNA的多樣性。

Ligibel等[48]利用Vanrija humicolaAKU4586來源的LTA催化了一系列芳香類、氮雜環(huán)類以及不同取代基團(tuán)的醛基底物制備多種β-羥基-α-氨基酸，其轉(zhuǎn)化率為0.7%～95%，大大豐富了LTA的應(yīng)用場(chǎng)景。Fesko等[22]通過擴(kuò)展氨基底物，利用D-丙氨酸、D-絲氨酸等代替甘氨酸與醛進(jìn)行縮合制備tertiary-α-氨基酸，盡管轉(zhuǎn)化率較低，但擴(kuò)大了LTA在手性化學(xué)品制備中的應(yīng)用潛力。

此外，LTA還可以用于其他藥物中間體制備，如新冠口服藥阿茲夫定、艾滋病用藥達(dá)蘆那韋等。由于這些藥物結(jié)構(gòu)復(fù)雜，雙手性C—C鍵合成難度大，使用LTA進(jìn)行手性砌塊制備有望提高該類藥物的生產(chǎn)效率。

7 總結(jié)與展望

LTA來源多樣、底物譜廣，利用LTA制備手性β-羥基-α-氨基酸反應(yīng)條件溫和、原子經(jīng)濟(jì)性高、環(huán)境污染小，應(yīng)用前景廣闊。目前，LTA非對(duì)映體選擇性機(jī)制得到初步解析，路徑假說和Prelog規(guī)則能夠有效指導(dǎo)LTA非對(duì)映體選擇性改造。因?yàn)橛绊慙TA非對(duì)映體選擇性的因素較多，如有機(jī)溶劑、底物種類等，所以需要進(jìn)一步探索LTA非對(duì)映體選擇性機(jī)制，并不斷完善該酶非對(duì)映體選擇性改造策略。醛縮反應(yīng)為可逆反應(yīng)，熱力學(xué)平衡導(dǎo)致該反應(yīng)轉(zhuǎn)化率較低，雖添加過量甘氨酸推動(dòng)反應(yīng)平衡能提高轉(zhuǎn)化率，但導(dǎo)致生產(chǎn)成本增加、經(jīng)濟(jì)效益降低。

盡管在反應(yīng)體系中添加DMF、乙醇和乙腈等有機(jī)溶劑能一定程度提高轉(zhuǎn)化率，但大量使用有機(jī)溶劑不符合綠色生物發(fā)展理念。可見，提高醛縮反應(yīng)轉(zhuǎn)化率是當(dāng)前LTA工業(yè)應(yīng)用面臨的一個(gè)新挑戰(zhàn)。此外，雖然LTA醛基底物譜廣，但是氨基底物譜窄，僅能接受甘氨酸、丙氨酸等小型氨基酸，這極大限制了β-羥基-α-氨基酸的結(jié)構(gòu)多樣性。因此，解析LTA氨基底物識(shí)別機(jī)制，擴(kuò)展LTA氨基底物譜范圍能夠進(jìn)一步豐富該酶的應(yīng)用場(chǎng)景提高其工業(yè)應(yīng)用潛力。

基于計(jì)算機(jī)軟件和硬件性能不斷提升，生物信息學(xué)、計(jì)算生物學(xué)和人工智能等學(xué)科飛速發(fā)展，為LTA的分子改造提供了巨大便利。利用分子動(dòng)力學(xué)模擬、QM/MM等傳統(tǒng)方法指導(dǎo)LTA的理性改造是非常有效的手段，但是依然面臨設(shè)計(jì)效率低、準(zhǔn)確性差等難題。今后,進(jìn)一步利用人工智能指導(dǎo)LTA功能改造，可望大幅度提高LTA的改造效率，有助于解決非對(duì)映體選擇性低、轉(zhuǎn)化率低和氨基底物譜窄等問題，實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)豐富、功能多樣β-羥基-α-氨基酸的綠色生物制造。

謹(jǐn)以本文紀(jì)念歐陽院士多年來在我國生物催化領(lǐng)域所做出的重要貢獻(xiàn)。