李秀娟，王明慧，喬 杰，金明杰，黃 和

(1.南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 210097；2.南京理工大學(xué)環(huán)境與生物工程學(xué)院，江蘇 南京 210094)

燃料乙醇是一種由生物質(zhì)轉(zhuǎn)化而來的可再生能源，廣泛用作汽油的替代品，其CO2排放相對(duì)較低，與傳統(tǒng)的化石燃料相比，具有更好的環(huán)境效益[1]。根據(jù)美國可再生燃料協(xié)會(huì)數(shù)據(jù)顯示，2015年以來，全球燃料乙醇產(chǎn)量一直維持小幅增長的狀態(tài)，截止2020年，在新冠肺炎疫情的影響下，全球燃料乙醇產(chǎn)量降至985億L[2]。美國和巴西是世界上最早大規(guī)模發(fā)展燃料乙醇產(chǎn)業(yè)且產(chǎn)量最大的國家[3]，主要目的是實(shí)施能源多元化和自給化，以減輕油價(jià)波動(dòng)對(duì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的沖擊。巴西作為一個(gè)高度依賴進(jìn)口石油的國家，在發(fā)展燃料乙醇之前曾面臨巨大的能源安全風(fēng)險(xiǎn)。20世紀(jì)70年代爆發(fā)的兩次石油危機(jī)對(duì)巴西經(jīng)濟(jì)造成了嚴(yán)重的沖擊。因此，巴西利用其甘蔗產(chǎn)業(yè)的成本優(yōu)勢(shì)，積極發(fā)展生物燃料乙醇產(chǎn)業(yè)并取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。根據(jù)巴西能源部的數(shù)據(jù)，2021年巴西的乙醇產(chǎn)量達(dá)到了320億L，其中大部分用于替代汽油[4]。巴西政府實(shí)施了乙醇摻混政策，要求汽油中含有一定比例的燃料乙醇，以促進(jìn)可再生能源的使用。美國是全球最大的燃料乙醇生產(chǎn)國和消費(fèi)國。根據(jù)美國能源信息管理局(EIA)的報(bào)告，美國2021年乙醇產(chǎn)量同比增長11.5%，約4 500萬t[2]。燃料乙醇的使用在美國得到了政府的支持，政府通過生物質(zhì)負(fù)擔(dān)減免稅收和可再生燃料標(biāo)準(zhǔn)等政策來促進(jìn)乙醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。歐洲在燃料乙醇的發(fā)展方面也取得了一定的進(jìn)展。根據(jù)歐洲生物燃料協(xié)會(huì)(ePURE)的數(shù)據(jù)，歐洲國家在2019年生產(chǎn)了約62億L的燃料乙醇。歐盟成員國制定了可再生能源指令，要求到2030年將可再生能源在交通領(lǐng)域的使用比例提高到14%[5]，這將促進(jìn)歐洲對(duì)燃料乙醇需求的增長。

我國生物燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的發(fā)展始于“十五”初期，當(dāng)時(shí)主要是為了解決陳化糧的再利用問題，經(jīng)國務(wù)院批準(zhǔn)同意，正式啟動(dòng)了生物燃料乙醇試點(diǎn)[6]。經(jīng)過20多年的發(fā)展，我國已經(jīng)成為全世界第三大燃料乙醇生產(chǎn)國和消費(fèi)國，為國民經(jīng)濟(jì)發(fā)展和社會(huì)可持續(xù)發(fā)展做出了產(chǎn)業(yè)貢獻(xiàn)[7]，據(jù)數(shù)據(jù)顯示，2020年中國乙醇產(chǎn)量986.45萬t，較2016年增長271.45萬t，增幅37.97%。2021年1月《2021年能源監(jiān)管工作要點(diǎn)》提到“積極支持生物液體燃料發(fā)展，扎實(shí)做好乙醇汽油推廣監(jiān)管”，這推動(dòng)了未來燃料乙醇行業(yè)的發(fā)展將從產(chǎn)能擴(kuò)張轉(zhuǎn)向技術(shù)升級(jí)[7]。

1 新時(shí)代下纖維素燃料乙醇發(fā)展的可行性與潛力

當(dāng)今，纖維素燃料乙醇作為一種可再生能源能夠?qū)崿F(xiàn)我國能源領(lǐng)域多方面的轉(zhuǎn)型和改進(jìn)，推動(dòng)其持續(xù)發(fā)展具有重大市場(chǎng)潛力和應(yīng)用前景。

1.1 有助于環(huán)境保護(hù)與減排

新時(shí)代下，環(huán)境保護(hù)成為全球關(guān)注的重要議題之一。與傳統(tǒng)的化石燃料相比，燃料乙醇作為可再生能源，可減少溫室氣體的排放。有研究表明，添加乙醇的燃料汽油可減少汽車尾氣中初級(jí)PM2.5和芳烴等高辛烷值組分，并從根本上減少次級(jí)PM2.5的產(chǎn)生；此外，乙醇汽油還可以減少CO、碳?xì)浠衔锏扔泻ξ镔|(zhì)的排放[8-9]。另外，發(fā)展以秸稈為原料的纖維素燃料乙醇，可以直接解決因隨意焚燒秸稈等農(nóng)林廢棄物帶來的大氣污染問題，這將是治理大氣環(huán)境的重要措施之一[10]。通過推廣燃料乙醇的使用，可以減少對(duì)空氣質(zhì)量的負(fù)面影響，降低溫室氣體的排放，有助于應(yīng)對(duì)氣候變化和改善環(huán)境質(zhì)量。

1.2 有助于改善能源結(jié)構(gòu)與安全

將燃料乙醇與傳統(tǒng)燃料混合使用或直接作為汽油替代品，可以有效增加清潔能源在交通領(lǐng)域的比重，降低碳排放和減少空氣污染。這種轉(zhuǎn)變有助于優(yōu)化我國能源結(jié)構(gòu)，使其向更可持續(xù)和環(huán)保的形式邁進(jìn)[11]。乙醇燃料生產(chǎn)主要依賴于農(nóng)作物等生物質(zhì)資源，通過發(fā)展燃料乙醇產(chǎn)業(yè)，可以減少對(duì)進(jìn)口石油的依賴，這有助于降低能源進(jìn)口風(fēng)險(xiǎn)，提升我國的能源自給能力[12-13]。此外，燃料乙醇生產(chǎn)可利用農(nóng)作物秸稈和廢棄物等資源，不僅可促進(jìn)農(nóng)村經(jīng)濟(jì)發(fā)展和農(nóng)民增收，還可進(jìn)一步增強(qiáng)能源安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的協(xié)同效應(yīng)。因此，推廣燃料乙醇是實(shí)現(xiàn)清潔、安全和可持續(xù)能源的關(guān)鍵措施之一。這有助于提升我國的能源自給能力和能源安全水平，同時(shí)也符合習(xí)近平總書記提出的“雙碳”目標(biāo)和促進(jìn)經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展全面綠色轉(zhuǎn)型的新理念。

1.3 有助于農(nóng)業(yè)發(fā)展與鄉(xiāng)村振興

燃料乙醇的生產(chǎn)需要大量的農(nóng)作物及其廢棄物作為原料，如玉米和甘蔗等，這為農(nóng)民提供了多元化的市場(chǎng)選擇，使他們通過種植農(nóng)作物就可參與燃料乙醇產(chǎn)業(yè)鏈。農(nóng)民通過銷售農(nóng)作物獲得收入，既促進(jìn)了農(nóng)業(yè)的發(fā)展，又有助于增加農(nóng)民的收入和提升農(nóng)產(chǎn)品的附加值[14]。此外，纖維素乙醇可利用農(nóng)業(yè)廢棄物，如農(nóng)作物秸稈、木材廢料等進(jìn)行生物質(zhì)能源生產(chǎn)。這不僅可以降低農(nóng)業(yè)廢棄物引起的環(huán)境污染，減少農(nóng)田秸稈焚燒帶來的空氣污染問題，還為農(nóng)民提供了廢棄物處理和再利用的機(jī)會(huì)。同時(shí)，工廠的建設(shè)需要土地、勞動(dòng)力和相關(guān)設(shè)施等，為農(nóng)業(yè)為主的地區(qū)帶來了投資、就業(yè)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的機(jī)會(huì)?？梢?，農(nóng)民可以通過參與燃料乙醇產(chǎn)業(yè)鏈獲得就業(yè)機(jī)會(huì)，提高收入水平，更可促進(jìn)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的發(fā)展。因此，燃料乙醇的發(fā)展有利于穩(wěn)定農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，提高農(nóng)產(chǎn)品的深加工水平，夯實(shí)糧食主產(chǎn)區(qū)的地位，推動(dòng)農(nóng)作物廢棄物的高值化利用[15]，更有助于鄉(xiāng)村經(jīng)濟(jì)振興。

1.4 有助于創(chuàng)新和科技進(jìn)步

纖維素燃料乙醇的發(fā)展需要在生產(chǎn)、轉(zhuǎn)化和利用等環(huán)節(jié)進(jìn)行技術(shù)創(chuàng)新和研發(fā)。為了實(shí)現(xiàn)高效的纖維素水解和發(fā)酵，需要進(jìn)行技術(shù)創(chuàng)新和工藝優(yōu)化，這推動(dòng)了相關(guān)領(lǐng)域的研究和開發(fā)，涉及廢棄物處理、生物質(zhì)轉(zhuǎn)化及發(fā)酵工程等方面的科學(xué)和工程技術(shù)[16]。隨著科技進(jìn)步的推動(dòng)，乙醇產(chǎn)業(yè)可以借助新材料、新工藝和智能化技術(shù)實(shí)現(xiàn)更高效的生產(chǎn)[17]。通過推動(dòng)纖維素燃料乙醇領(lǐng)域的創(chuàng)新，不僅可以提升能源利用效率，還可以促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和經(jīng)濟(jì)增長[18]。

總之，新時(shí)代下纖維素燃料乙醇的發(fā)展具有重大意義，它可以為環(huán)境保護(hù)和碳減排做出貢獻(xiàn)，保證我國能源安全及多元化，還能促進(jìn)農(nóng)業(yè)發(fā)展和鄉(xiāng)村振興，同時(shí)也可推動(dòng)技術(shù)創(chuàng)新和科技進(jìn)步。為了實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，各國政府、企業(yè)和研究機(jī)構(gòu)需要加強(qiáng)合作，同時(shí)加大科研投入，共同推動(dòng)纖維素燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。

2 新時(shí)代下繼續(xù)發(fā)展纖維素燃料乙醇的重大挑戰(zhàn)

2.1 原料供給的挑戰(zhàn)

第一代燃料乙醇使用玉米、甘蔗和馬鈴薯等糖/淀粉作物作為原料[19]，但其大規(guī)模生產(chǎn)對(duì)食物供應(yīng)構(gòu)成威脅，因此引發(fā)了“與人爭糧，與糧爭地”的問題[20]。為了解決這一問題，人們開始以農(nóng)業(yè)廢棄物和木質(zhì)纖維素材料為原料生產(chǎn)二代燃料乙醇。盡管(轉(zhuǎn)基因)藻類也可作為原料來生產(chǎn)生物能源，但由于藻類的收獲困難和前期成本昂貴，現(xiàn)在還無法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)[21]。相比之下，二代燃料乙醇具有原料成本低、來源廣泛、投資成本也較低且對(duì)環(huán)境的影響小等優(yōu)點(diǎn)。近年來，各國陸續(xù)建設(shè)了纖維素燃料乙醇生產(chǎn)的示范項(xiàng)目[22]。預(yù)計(jì)二代燃料乙醇工藝有望使美國乙醇年產(chǎn)量增加1倍，巴西乙醇年產(chǎn)量增加3倍以上，可見，未來二代燃料乙醇有望完全取代一代燃料乙醇[23-24]。

2.2 生產(chǎn)工藝的挑戰(zhàn)

為了能夠與石油的成本相競爭，需要提升燃料乙醇生產(chǎn)工藝中原料轉(zhuǎn)化為糖的技術(shù)[25]。在纖維素乙醇生產(chǎn)過程中，工業(yè)友好的預(yù)處理方法以及后續(xù)的酶水解是資本密集型的步驟[26]。預(yù)處理通過破壞植物細(xì)胞壁致密結(jié)構(gòu)以提升纖維素和半纖維素的可消化性，再通過纖維素酶的協(xié)同作用進(jìn)而釋放出糖分子。然而，這些酶在水解過程中面臨非生產(chǎn)性結(jié)合、酶抑制和反應(yīng)速率低等問題，使酶解效率和糖產(chǎn)量都降低[27]。因此，降低酶的使用量和成本是一個(gè)不可避免的任務(wù)，需要尋找更經(jīng)濟(jì)高效的酶水解方法或開發(fā)更具成本效益的酶。此外，微生物利用可發(fā)酵糖進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工藝也至關(guān)重要。通過工藝流程優(yōu)化或菌株改造來提高發(fā)酵效率或?qū)崿F(xiàn)對(duì)木糖的轉(zhuǎn)化，對(duì)于木質(zhì)纖維素精煉具有重要意義。在這里，我們主要綜述幾種先進(jìn)生物技術(shù)對(duì)纖維素燃料乙醇發(fā)展的推進(jìn)作用以及未來的發(fā)展前景。

3 推動(dòng)纖維素燃料乙醇高質(zhì)量發(fā)展的先進(jìn)生物技術(shù)

隨著科學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，近年來已經(jīng)開發(fā)出諸多先進(jìn)的生物技術(shù)來推動(dòng)燃料乙醇的高效生產(chǎn)發(fā)展，將從以下4個(gè)方面(圖1)進(jìn)行具體闡述。

圖1 推動(dòng)纖維素燃料乙醇高質(zhì)量發(fā)展的先進(jìn)生物技術(shù)Fig.1 Advanced biotechnologies to drive high-quality development of cellulosic fuel ethanol

3.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化策略

發(fā)酵工藝對(duì)燃料乙醇生產(chǎn)的重要性不容忽視。木質(zhì)纖維素原料經(jīng)過預(yù)處理被轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖的過程會(huì)產(chǎn)生很多抑制物。根據(jù)預(yù)處理工藝的不同，其產(chǎn)生的抑制物類型也有差異[28]：水熱法預(yù)處理會(huì)產(chǎn)生酚類、呋喃和羧酸；酸法預(yù)處理會(huì)產(chǎn)生乙酸、糠醛和5-羥甲基糠醛(5-HMF)；堿法預(yù)處理會(huì)產(chǎn)生甲酸、乙酸和酚類物質(zhì)；機(jī)械研磨法會(huì)產(chǎn)生酚類和糠醛[29-30]。這些物質(zhì)對(duì)酶活性及發(fā)酵微生物的性能產(chǎn)生負(fù)面影響，可能引起乙醇產(chǎn)量降低甚至完全抑制乙醇生產(chǎn)。

在傳統(tǒng)的生物加工工藝中，分步酶解發(fā)酵(SHF)以及同步糖化發(fā)酵(SSF)被廣泛采用(圖2)[31]，而現(xiàn)在開發(fā)了統(tǒng)合生物加工(CBP)工藝，表1總結(jié)了這3種加工工藝的優(yōu)缺點(diǎn)。SHF工藝是根據(jù)木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化多步驟的需要，結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)的最直接的策略，將每個(gè)步驟在最佳條件下進(jìn)行。但是SHF工藝存在水解酶的反饋抑制問題，這是因?yàn)樗猱a(chǎn)生的高濃度糖對(duì)酶以及發(fā)酵微生物產(chǎn)生滲透應(yīng)激，最終影響生產(chǎn)性能[32]。由于能源需求高、酶成本昂貴以及操作成本高，SHF工藝的工業(yè)應(yīng)用受到限制。

表1 不同纖維素乙醇發(fā)酵工藝的優(yōu)勢(shì)及局限性

圖2 生產(chǎn)纖維素乙醇的方法Fig.2 Processes for cellulosic ethanol production

SSF工藝整合了酶解和發(fā)酵步驟，由于這兩個(gè)步驟是在同一個(gè)生物反應(yīng)器中進(jìn)行，因此，糖一旦被釋放出來，它們就會(huì)被轉(zhuǎn)化為乙醇，從而避免糖在抑制水平上的堆積[33]。然而，大多數(shù)微生物生產(chǎn)生化產(chǎn)品和生物燃料的最適生長溫度是中溫，而水解木質(zhì)纖維素的理想溫度超過50 ℃，因此僅適合嗜熱微生物發(fā)酵工藝。此外，還包括優(yōu)化水解和發(fā)酵工藝參數(shù)、解決發(fā)酵抑制劑等方面的挑戰(zhàn)[34]。

為了克服這些限制，統(tǒng)合生物加工(CBP)工藝提供了一種可持續(xù)的策略，即將酶生產(chǎn)、酶解和發(fā)酵這3個(gè)步驟整合到單個(gè)或一組微生物中進(jìn)行[35]。利用CBP工藝可以減少或消除外源添加酶的需求，并通過在一個(gè)容器中同時(shí)執(zhí)行所有步驟來提高效率。然而，目前存在一個(gè)限制，即缺乏高效CBP微生物。盡管已經(jīng)開發(fā)了一些非常規(guī)微生物作為CBP宿主來生產(chǎn)乙醇[36-38]，但是只有釀酒酵母因其高乙醇生產(chǎn)率和遺傳適應(yīng)性能作為CBP工藝的理想宿主。通過調(diào)節(jié)釀酒酵母中纖維素酶的表達(dá)和拓展酵母可利用的底物譜[34]，將釀酒酵母改造為CBP工藝的宿主是減少對(duì)不可再生石油基化石燃料依賴的最有前景的方法之一。

3.2 代謝工程策略

利用木質(zhì)纖維素生物質(zhì)高效生產(chǎn)生物燃料主要取決于尋找和開發(fā)適合整個(gè)發(fā)酵工藝的微生物。纖維素乙醇生產(chǎn)的理想菌株應(yīng)該具備能夠完全利用由木質(zhì)纖維素生物質(zhì)原料產(chǎn)生的戊糖和己糖，承受高溫和低pH，對(duì)抑制物和乙醇表現(xiàn)出良好的耐受性以及對(duì)乙醇合成具有高代謝通量的能力[39-40]。

代謝工程是一個(gè)熱點(diǎn)的研究領(lǐng)域，它有助于針對(duì)性地重新連接細(xì)胞代謝，以提高目標(biāo)代謝物的濃度、速率和產(chǎn)量。代謝工程在細(xì)胞工廠的開發(fā)中得到了廣泛應(yīng)用，是設(shè)計(jì)代謝底盤以目標(biāo)宿主生產(chǎn)生物燃料的必要條件[41]。目標(biāo)酶的過表達(dá)、基因部件工程、輔因子工程、異源基因表達(dá)及競爭途徑阻斷等代謝工程方法是提高產(chǎn)量的關(guān)鍵解決方案[42]。釀酒酵母作為應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞工廠之一，是代謝工程改造的首選，因?yàn)獒槍?duì)它已開發(fā)出多種遺傳工具和大量可用的組學(xué)數(shù)據(jù)庫[43]。

為了達(dá)到生物燃料生產(chǎn)的最高產(chǎn)量，必須克服的關(guān)鍵問題是增強(qiáng)菌株對(duì)抑制性化合物、代謝中間體和所需最終產(chǎn)品的耐受性[44]。微生物細(xì)胞的生長對(duì)于增加生物燃料產(chǎn)量是非常重要的，因此必須設(shè)計(jì)具有高耐受性的強(qiáng)健菌株，才能實(shí)現(xiàn)燃料乙醇生產(chǎn)的高效率和可持續(xù)工業(yè)化，這可通過理性工程和自適應(yīng)進(jìn)化工程來實(shí)現(xiàn)[45]。理性工程涉及直接操縱已知的遺傳成分，如轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和已識(shí)別的途徑酶[44]。自適應(yīng)進(jìn)化工程則通過適應(yīng)或誘變導(dǎo)致菌株進(jìn)化，然后使用高通量方法篩選出具有高耐受水平的菌株[46]。利用系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù)，可以揭示產(chǎn)生增強(qiáng)菌株耐受性所涉及的因素，再進(jìn)行遺傳開發(fā)賦予菌株所需的耐受表型。如，通過重新編程基因轉(zhuǎn)錄因子Spt15p可以增強(qiáng)釀酒酵母的葡萄糖/乙醇耐受性[46]。

由于釀酒酵母天然不能利用木糖，導(dǎo)致木質(zhì)纖維素水解產(chǎn)物中糖的利用不完全，這是纖維素乙醇生產(chǎn)效率較低的問題之一[47]。盡管釀酒酵母不能將木糖轉(zhuǎn)化為乙醇，但在木糖異構(gòu)酶(XI)存在的條件下，木糖被轉(zhuǎn)化為木酮糖，而木酮糖可以被釀酒酵母轉(zhuǎn)化利用[48]。因此通過挖掘、改造出具有高活性的木糖異構(gòu)酶十分重要。南京理工大學(xué)金明杰教授團(tuán)隊(duì)利用大數(shù)據(jù)挖掘與合理改造的XI，構(gòu)建并進(jìn)化出多個(gè)能高效利用木糖的釀酒酵母，最終利用經(jīng)過預(yù)處理的無需脫毒或洗滌的玉米秸稈和玉米芯來發(fā)酵，乙醇產(chǎn)量分別高達(dá)85.95 和94.76 g/L[49]。

3.3 固定化策略

3.3.1 細(xì)胞固定化

對(duì)纖維素乙醇發(fā)酵的細(xì)胞固定化方法主要有5種，分別是吸附法、包埋法、膜隔離法、交聯(lián)法和絮凝法[50]。原則上，使用固定化細(xì)胞的連續(xù)過程比間歇過程需要更小的反應(yīng)體積，可以降低成本[51]。固定化已被證明可以提高反應(yīng)器的生產(chǎn)效率，有助于細(xì)胞與液體產(chǎn)物的分離，并促進(jìn)系統(tǒng)長時(shí)間的連續(xù)運(yùn)行[52]。大多數(shù)乙醇生產(chǎn)工藝都受到乙醇生產(chǎn)效率低和回收率低的限制以及與所使用的微生物有關(guān)的分離問題。在連續(xù)系統(tǒng)中，利用固定化細(xì)胞可以使生物反應(yīng)器內(nèi)細(xì)胞密度更高，進(jìn)而增加乙醇產(chǎn)量并降低生產(chǎn)成本[53]。

此外，當(dāng)存在抑制劑時(shí)，與游離形式相比，多種模式下的固定化細(xì)胞都表現(xiàn)出更好的性能[50]。因此，當(dāng)培養(yǎng)基中存在抑制劑時(shí)，細(xì)胞固定化已被證明是一種快速且簡便的應(yīng)用策略，可以保護(hù)細(xì)胞并有助于纖維素乙醇的生產(chǎn)。細(xì)胞固定化為纖維素乙醇生產(chǎn)帶來了許多優(yōu)勢(shì)，包括工藝穩(wěn)定性、高生產(chǎn)效率、改進(jìn)污染物控制以及改善的抗抑制劑性能等。細(xì)胞固定化由于存在更高的傳質(zhì)限制，細(xì)胞形態(tài)、代謝和生理特性的改變，細(xì)胞的異質(zhì)分布，成本高等缺點(diǎn)，其大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用還遠(yuǎn)未成為現(xiàn)實(shí)[54-56]。未來針對(duì)更多其他載體(如生物炭或多物種生物膜)的深入研究將會(huì)給燃料乙醇生產(chǎn)帶來更大的工業(yè)潛力。

3.3.2 纖維素酶固定化

纖維素酶固定化是一種將纖維素酶固定在載體上的技術(shù)，在生物燃料、紙漿和纖維素降解等領(lǐng)域的具有廣泛潛力。固定化酶技術(shù)可以給酶提供更好的保護(hù)，提高酶的穩(wěn)定性，降低酶的失活率，并使酶在不同溫度和pH條件下保持較高的催化活性和效率，操作更靈活和重復(fù)使用性高，從而促進(jìn)可持續(xù)能源生產(chǎn)和資源回收。常見的載體包括多孔材料、凝膠、微膠囊和納米顆粒等。

基于酶-酶相互作用的四大類固定化策略已經(jīng)被廣泛研究，即共價(jià)鍵、包封(或包埋)、吸附和交聯(lián)[57]。固定化技術(shù)的正確選擇對(duì)于特定應(yīng)用非常重要，因?yàn)樗苯佑绊懤w維素酶的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和催化活性。載體材料的結(jié)構(gòu)以及疏水性/親水性、官能度、孔徑分布和其他表面特性的信息在固定化技術(shù)的選擇中起著不可或缺的作用[58]。此前，纖維素酶已成功固定在海藻酸鹽、氧化石墨烯、多孔陶瓷珠和硅溶膠-凝膠等材料上，應(yīng)用于食品、制藥和洗滌劑行業(yè)[59-61]。在應(yīng)用這些固定化纖維素酶時(shí)，最關(guān)鍵的因素是保留酶再利用的催化活性以及更長的使用時(shí)間[62-63]。與傳統(tǒng)的支撐材料相比，納米材料在提高纖維素酶的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性、回收率、活性和回收能力方面顯示出巨大的潛力[64]。然而，仍需要考慮到實(shí)際系統(tǒng)的操作穩(wěn)定性、優(yōu)化參數(shù)、遺傳操作以及利用微生物聯(lián)合等方面，才能進(jìn)行有效的低成本生物燃料生產(chǎn)。

總之，纖維素酶固定化技術(shù)為纖維素降解和生物燃料生產(chǎn)提供了一種經(jīng)濟(jì)可行的方法。隨著對(duì)固定化酶系統(tǒng)的深入研究和技術(shù)改進(jìn)，實(shí)現(xiàn)更高效、穩(wěn)定和可持續(xù)的纖維素降解過程，能夠?yàn)榭稍偕茉搭I(lǐng)域的發(fā)展做出更大貢獻(xiàn)。

3.4 酶工程策略

以可再生和可持續(xù)的方式，使用定制的纖維素酶混合物來水解木質(zhì)纖維素生物質(zhì)，這在能源和增值化學(xué)品等生產(chǎn)方面具有巨大的潛力。為了使生物催化劑的使用在工業(yè)上更加經(jīng)濟(jì)可行，需要對(duì)生物催化劑進(jìn)行定制，使其能承受溫度、pH和鹽度等惡劣的工藝條件。

酶工程技術(shù)是通過改造酶特性進(jìn)而推動(dòng)燃料乙醇發(fā)展的一個(gè)重要研究領(lǐng)域。利用基因工程和生物化學(xué)方法，酶工程技術(shù)可以改變酶的結(jié)構(gòu)和功能來提高燃料乙醇的生產(chǎn)效率和質(zhì)量，從而推動(dòng)燃料乙醇產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。其中，定向進(jìn)化和(半)理性設(shè)計(jì)是酶工程技術(shù)中改善酶特性的強(qiáng)大技術(shù)。如：通過設(shè)計(jì)纖維素酶的催化位點(diǎn)和底物入口來提升酶活性[65-66]；利用序列比對(duì)[67]、折疊自由能分析[68]和B因子引導(dǎo)方法[69]進(jìn)行合理設(shè)計(jì)來提高纖維素酶熱穩(wěn)定性；通過定向進(jìn)化和電荷工程提高纖維素酶在非常規(guī)溶劑(離子液體、高鹽濃度、有機(jī)溶劑)中的耐受性[70-73]和pH穩(wěn)定性[74-75]等。每種纖維素酶在纖維素降解中都有著特定的作用，利用蛋白質(zhì)工程可改善纖維素酶在工業(yè)應(yīng)用中缺乏的特性(活性、熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性)或?qū)⒗w維素酶的應(yīng)用擴(kuò)展到更為復(fù)雜的酶解環(huán)境中。在這方面，有必要注意到，高通量篩選平臺(tái)的開發(fā)及應(yīng)用是纖維素酶定向進(jìn)化的瓶頸。一些新的計(jì)算設(shè)計(jì)方法，如通過Framework for rapid enzyme stabilization by computational libraries(FRESCO)[76]、Protein repair one stop shop(PROSS)[77]、FoldX[78]和Constraint network analysis(CAN)[79]進(jìn)行深入的分析，以預(yù)測(cè)“小而精”的突變文庫，從而定制具有所需特性的纖維素酶混合物。

目前，隨著人工智能技術(shù)的迅速發(fā)展，酶工程技術(shù)與人工智能的有效結(jié)合為該領(lǐng)域帶來了許多新的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。首先，人工智能可以在酶的設(shè)計(jì)和優(yōu)化中發(fā)揮重要作用。通過機(jī)器學(xué)習(xí)和深度學(xué)習(xí)算法，可以分析大量的酶結(jié)構(gòu)和功能數(shù)據(jù)，以預(yù)測(cè)新酶的性能并進(jìn)行合理的設(shè)計(jì)[80]。其次，人工智能可以幫助預(yù)測(cè)和優(yōu)化酶的反應(yīng)條件和催化機(jī)制。通過建立模型和算法，可以對(duì)酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)進(jìn)行準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，以優(yōu)化反應(yīng)條件和提高反應(yīng)效率。這種預(yù)測(cè)能力對(duì)于酶催化的燃料乙醇生產(chǎn)過程的優(yōu)化非常重要[81]。最后，通過分析大規(guī)模的基因組和代謝組數(shù)據(jù)，人工智能可以揭示酶與代謝途徑的關(guān)系，從而指導(dǎo)燃料乙醇生產(chǎn)的優(yōu)化和調(diào)控[82]。因?yàn)橄嚓P(guān)算法可以幫助識(shí)別潛在的酶基因和代謝途徑，進(jìn)而設(shè)計(jì)更高效的代謝工程策略。

綜上所述，通過人工智能在酶設(shè)計(jì)、反應(yīng)條件優(yōu)化和代謝工程中的應(yīng)用，可以提高燃料乙醇的生產(chǎn)效率和質(zhì)量，促進(jìn)可持續(xù)能源的開發(fā)和利用。隨著酶工程和人工智能技術(shù)的不斷進(jìn)步，研究人員將獲得更多創(chuàng)新成果和技術(shù)突破以推動(dòng)燃料乙醇等生物產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

4 結(jié)論與展望

選擇合適的預(yù)處理方法是提高酶解效率的首要前提，從商業(yè)化角度來說，高效且經(jīng)濟(jì)的預(yù)處理必須滿足減少水用量和降低能源需求、減少抑制劑的產(chǎn)生、實(shí)現(xiàn)低成本的催化劑回收和減少廢物產(chǎn)生等要求。

預(yù)處理之后的酶解步驟成本占纖維素燃料乙醇生物精煉廠總成本的近25%，酶工程技術(shù)的快速發(fā)展可以加速實(shí)現(xiàn)所需酶特性的提升從而極大地減少酶的用量。因此，需要尋找合適的宿主并通過基因編輯來調(diào)整酶產(chǎn)量以經(jīng)濟(jì)生產(chǎn)高效的酶混合物，進(jìn)而將纖維素生物質(zhì)原料轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖，最終供微生物生產(chǎn)燃料乙醇和其他高值化學(xué)品。

微生物是燃料乙醇生產(chǎn)的主要參與者，因此微生物代謝工程對(duì)于生物燃料生產(chǎn)行業(yè)的進(jìn)步是不可或缺的，通過代謝工程可以增加微生物的耐受性、利用底物的能力、提高代謝通量、設(shè)計(jì)新的代謝途徑。為了實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)，研究人員必須開發(fā)全基因組測(cè)序、生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)等新技術(shù)來充分了解釀酒酵母或非常規(guī)微生物中的重要代謝途徑并確定相關(guān)的酶。再通過利用計(jì)算工具和先進(jìn)技術(shù)進(jìn)行微生物的篩選和代謝途徑改造，最終以提高纖維素燃料乙醇的工業(yè)生產(chǎn)效率，降低生產(chǎn)成本。

如今，隨著各種先進(jìn)生物技術(shù)的發(fā)展，纖維素乙醇工藝的各個(gè)單元(預(yù)處理、酶解、發(fā)酵等)效能都得到了有效的提升，但是如何將各種工藝技術(shù)集成到一個(gè)乙醇工程中也是一個(gè)重大挑戰(zhàn)。由于CBP工藝對(duì)于微生物菌株的要求極高，一種將酶生產(chǎn)和糖化步驟整合的綜合生物糖化(CBS)工藝被提出。該方法將發(fā)酵步驟分開，可以利用生產(chǎn)的糖來生產(chǎn)除了燃料乙醇之外的其他增值產(chǎn)品。當(dāng)然，CBP或CBS工藝在商業(yè)規(guī)模上的實(shí)現(xiàn)需要高活性穩(wěn)健催化劑的存在。未來，也需要越來越多的實(shí)驗(yàn)室規(guī)模研究轉(zhuǎn)向工業(yè)規(guī)模的放大研究，以評(píng)估這些工藝在工業(yè)生產(chǎn)中的可行性，最終實(shí)現(xiàn)具有經(jīng)濟(jì)效益的燃料乙醇規(guī)?；a(chǎn)。