屈琳琳，劉彥楠，范代娣

(西北大學(xué)化工學(xué)院，陜西 西安 710069)

肝癌是全球范圍內(nèi)最常見和最具侵襲性的惡性腫瘤之一，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]，其中，肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是最常見的類型，約占所有肝癌患者的90%。HCC造成了巨大的疾病負(fù)擔(dān)，在全球許多地區(qū)是癌癥相關(guān)死亡的第四大原因。盡管在高風(fēng)險人群中實(shí)施了監(jiān)測和合理治療策略，對預(yù)防HCC和降低總體死亡率顯示出一定效果，但在許多國家，HCC的發(fā)病率和特異性死亡率仍在上升。因此，尋找安全、高效抗HCC藥物迫在眉睫。

人參是一種生長緩慢的多年生植物，屬于五加科人參屬。它含有復(fù)雜的化學(xué)成分，這些成分的組成因使用的物種、產(chǎn)地和生長條件而異[2]。人參在中國有悠久的應(yīng)用歷史。經(jīng)過檢測，人參含有多種生物活性物質(zhì)，如人參皂苷、維生素、揮發(fā)油、類黃酮、氨基酸和多糖等[3-4]。人參皂苷是人參中最主要的生物活性成分，是一類特定類型的三萜類皂苷，幾乎只存在于人參中。目前已從人參不同部位分離出150多種天然存在的人參皂苷[5]。在肝癌中，人參皂苷Rd和Rh2已被證明能夠抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲[6]，而稀有人參皂苷Rg5對HCC的抑制尚未見報道。

因此，本文以二甲基亞硝胺和四氯化碳誘導(dǎo)的原發(fā)性肝癌小鼠為模型，探究人參皂苷Rg5抑制HCC生長的效果及其作用機(jī)制，以期為新型抗HCC藥物的研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)及基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑

人參皂苷Rg5，西安巨子生物基因技術(shù)股份有限公司，其分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示。二甲基亞硝胺(DEN)、四氯化碳(CCl4)、二甲基亞砜(DMSO)和PEG300，美國Sigma公司；注射用橄欖油、吐溫80、索拉非尼(Sorafeinib)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；H&E染色試劑盒，北京索萊寶科技有限公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、透明質(zhì)酸(HA)和甲胎蛋白(AFP)酶聯(lián)免疫試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Tunel熒光試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Bax、c-Casp 3、c-PARP和GAPDH抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

圖1 人參皂苷Rg5結(jié)構(gòu)式Fig.1 Structure of ginsenoside Rg5

1.2 儀器

ES-VM25型漩渦混勻儀，翌圣生物科技(上海)股份有限公司；DW-86L388J型超低溫冰箱(-80 ℃)，青島海爾集團(tuán)；TS2型顯微鏡，日本尼康公司；Sub-Cell GT型電泳儀、Trans-Blot Turbo型全能型蛋白快速轉(zhuǎn)膜儀，Bio-Rad公司。

1.3 試劑配制

注射/灌胃用溶劑：DMSO、PEG300、吐溫80和生理鹽水按照體積比為1∶8∶1∶10配比進(jìn)行配制。以40 mL為例，取2 mL的DMSO、20 mL的生理鹽水、2 mL的吐溫80和16 mL的PEG300，加入離心管內(nèi)，并放置于超聲波清洗機(jī)中輔助混勻。每只小鼠灌胃0.2 mL。

1.4 模型建立

40只體質(zhì)量約為12～15 g的雄性C57BL/6J小鼠(江蘇集萃藥康生物科技有限公司)。將小鼠放置在潔凈鼠籠內(nèi)進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，并提供自由進(jìn)食和飲水(該實(shí)驗(yàn)已獲得西北大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號為NWU-AWC-20200813M)。

經(jīng)過一周的適應(yīng)性喂養(yǎng)后，將小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只，分為以下組別：正常組(Normal)、原發(fā)性肝癌模型組(Model)、100 mg/kg人參皂苷Rg5組(Rg5)和100 mg/kg索拉非尼組(Sorafenib)。參照文獻(xiàn)[7]的相關(guān)方法，建立原發(fā)性肝癌小鼠模型。

首先，除正常組外，其余3組小鼠單次腹腔注射1 mg/kg DEN，正常組小鼠注射PBS溶液。然后，經(jīng)過6周后，除正常組外，其余3組小鼠每周腹腔注射0.2 mL/kg CCl4，每周2次，正常組小鼠注射橄欖油。據(jù)文獻(xiàn)[7]的方法判定，經(jīng)過14周即可成功建立原發(fā)性肝癌小鼠模型[7]。最后，給藥組每天分別以100 mg/kg人參皂苷Rg5和索拉非尼灌胃，而模型組則接受灌胃溶劑處理。動物實(shí)驗(yàn)處理流程如圖2所示。

圖2 實(shí)驗(yàn)處理過程Fig.2 Experimental processing

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠稱質(zhì)量后，迅速脫頸處死，眼眶取血，解剖取小鼠肝臟組織進(jìn)行拍照，取肝臟組織置于10%中性福爾馬林內(nèi)用于切片染色。

1.5 血液生化指標(biāo)檢測

將實(shí)驗(yàn)結(jié)束后收集的小鼠血液室溫靜置2 h后離心機(jī)內(nèi)離心，離心結(jié)束后，可觀察到離心管內(nèi)血液出現(xiàn)分層，上層為血清樣本，用移液槍小心移取血清樣本于新離心管內(nèi)，置于-80 ℃冰箱保存。對于小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、透明質(zhì)酸(HA)和甲胎蛋白(AFP)等生化指標(biāo)含量，按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

1.6 組織切片染色

進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)后，臟器固定48 h。使用乙醇去除水分，透明化組織。石蠟包埋后切片。對切片進(jìn)行脫蠟、染色(H&E和免疫組化)和封片處理。切片風(fēng)干后觀察和拍照。

對組織切片進(jìn)行脫蠟、抗體處理和熒光染色。切片風(fēng)干后觀察和拍照。

1.7 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)

取冷凍的肝臟組織，冷凍后研磨成粉末。加入Radio-Immunoprecipitation Assay (RIPA)裂解液裂解并離心。檢測蛋白濃度，保存剩余樣品。制備聚丙烯酰胺凝膠電泳，倒入制膠槽中并凝固。配制濃縮膠緩沖液，倒入制膠槽中并凝固。清洗凝膠后裝入電泳裝置，進(jìn)行電泳。沖洗凝膠并轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。封閉膜，加入一抗和二抗。顯影并分析蛋白條帶灰度。

1.8 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)顯示為平均值±方差。使用SPSS軟件19.0版(SPSS Inc.)分析各組間顯著性差異。不同的字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。

2 結(jié)果與討論

2.1 Rg5對原發(fā)性肝癌小鼠腫瘤生長的影響

DEN和CCl4誘導(dǎo)的原發(fā)性肝細(xì)胞癌模型已被廣泛用來研究纖維化和肝細(xì)胞癌發(fā)展的分子機(jī)制，并試驗(yàn)新型藥物的治療效果。

首先，分析小鼠肝臟的腫瘤結(jié)節(jié)變化情況，結(jié)果見圖3(a)。由圖3(a)可知：與正常組相比，Model組觀察到明顯的大量腫瘤結(jié)節(jié)，而人參皂苷Rg5和索拉非尼給藥在宏觀上明顯減少了肝臟中的腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量。

字母不同表示顯著差異(P<0.05)，n=3圖3 人參皂苷Rg5對原發(fā)性肝癌小鼠肝臟腫瘤生長的影響Fig.3 Effects of ginsenoside Rg5 on the growth of liver tumor in mice with primary liver cancer

接著，測小鼠肝臟上最大瘤長度變化，結(jié)果見圖3(b)。由圖3(b)可知：Model組、Rg5組和Sorafenib組的最大瘤長度平均值分別為10.37、6.87和6.46 mm。經(jīng)人參皂苷Rg5處理后，小鼠肝臟表面的最大腫瘤直徑明顯減少(P<0.05)。

然后，分析小鼠肝臟/體質(zhì)量比(肝重比)的變化，結(jié)果見圖3(c)。由圖3(c)可知：正常組、Model組、Rg5組和Sorafenib組的肝重比平均值分別為3.77%、10.56%、6.98%和6.20%。與正常組相比，Model組的肝重比有明顯差異(P<0.05)，但與Model組相比，人參皂苷Rg5和Sorafenib組的這一比值明顯下降(P<0.05)。

最后，通過肝臟組織病理學(xué)染色來分析病理學(xué)特征，結(jié)果如圖3(d)所示。由圖3(d)可知：在Model組中，可觀察到肝臟中有大量的腫瘤細(xì)胞浸潤、肝臟纖維化和壞死，增殖細(xì)胞的形態(tài)和分布符合肝癌的組織病理學(xué)特征。而人參皂苷Rg5治療大大減少了腫瘤細(xì)胞的浸潤，HCC細(xì)胞增殖明顯減少。

2.2 Rg5對原發(fā)性肝癌小鼠腫瘤細(xì)胞增殖的影響

Ki-67是細(xì)胞增殖的一個典型標(biāo)志蛋白，因此對小鼠肝臟進(jìn)行了Ki-67免疫組化染色，結(jié)果見圖4。由圖4可知：與正常組相比，Model組可觀察到大量的增殖細(xì)胞呈棕黃色，表明Model組中小鼠肝臟內(nèi)HCC細(xì)胞增殖較活躍；而在Rg5和Sorafenib組中，可觀察到HCC小鼠肝臟癌細(xì)胞增殖被抑制，表明小鼠肝臟的Ki-67蛋白表達(dá)明顯降低。

圖4 原發(fā)性肝癌小鼠肝臟Ki-67免疫組化染色Fig.4 Ki-67 immunohistochemical staining of liver in mice with primary liver cancer

2.3 Rg5對原發(fā)性肝癌小鼠肝損傷、肝纖維化和肝硬化的影響

為了研究人參皂苷Rg5對HCC引起的肝損傷的影響，分別評估了小鼠血清中兩種可以反映肝損傷的主要轉(zhuǎn)氨酶(ALT和AST)的表達(dá)水平。小鼠血清ALT結(jié)果如圖5(a)所示。由圖5(a)可知：正常組、Model組、Rg5和Sorafenib組的血清ALT含量平均值分別為12.68、31.50、21.30和38.51 U/L。

字母不同表示顯著差異(P<0.05)，n=3圖5 人參皂苷Rg5對原發(fā)性肝癌小鼠肝損傷、肝纖維化和肝硬化的影響Fig.5 Effects of ginsenoside Rg5 on liver injury,liver fibrosis and cirrhosis in mice with primary liver cancer

小鼠血清AST結(jié)果如圖5(b)所示。由圖5(b)可知：正常組、Model組、Rg5和Sorafenib組的血清AST含量平均值分別為20.64、37.17、27.44和46.53 U/L。與正常組相比，Model組的小鼠血清和肝臟中的ALT和AST水平較高(P<0.05)，人參皂苷Rg5預(yù)處理使HCC小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶含量顯著降低，而Sorafenib組含量顯著升高，這些數(shù)據(jù)表明人參皂苷Rg5可以改善HCC小鼠肝損傷。

眾所周知，肝纖維化的嚴(yán)重程度與HCC的風(fēng)險呈正相關(guān)關(guān)系。HA作為基質(zhì)成分之一，可以準(zhǔn)確而敏感地反映肝臟中產(chǎn)生的纖維數(shù)量和肝細(xì)胞的損傷情況[8]。因此，接下來通過HA試劑盒評估了血清中HA的濃度。小鼠血清HA結(jié)果如圖5(c)所示。由圖5(c)可知：正常組、Model組、Rg5和Sorafenib組的血清HA含量平均值分別為190.00、359.67、243.33和249.31 ng/mL。

作為肝癌三部曲之一的肝硬化，其具有很大的概率轉(zhuǎn)變成為肝癌，因此對HCC小鼠的肝硬化水平進(jìn)行檢測。AFP作為臨床HCC的血液標(biāo)志物，可以反映肝硬化的程度。通過AFP試劑盒檢測了血液中AFP含量，小鼠血清AFP結(jié)果如圖5(d)所示。由圖5(d)可知：正常組、Model組、Rg5和Sorafenib組的血清AFP含量平均值分別為69.00、122.67、80.06和64.96 ng/mL。與正常組相比，HCC小鼠血液中AFP顯著增高(P<0.05)，而人參皂苷Rg5有效地降低了血清的AFP水平(P<0.05)。

2.4 人參皂苷Rg5對原發(fā)性肝癌小鼠肝臟腫瘤細(xì)胞凋亡的影響

以Tunel實(shí)驗(yàn)來探究人參皂苷Rg5是否能誘導(dǎo)HCC的凋亡，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：與Normal組相比，Model組Tunel紅色熒光強(qiáng)度幾乎無變化，而人參皂苷Rg5組及Sorafenib組處理后可顯著增強(qiáng)Tunel紅色熒光強(qiáng)度，表明人參皂苷Rg5可以誘導(dǎo)HCC發(fā)生細(xì)胞凋亡。

圖6 原發(fā)性肝癌小鼠肝臟腫瘤Tunel熒光染色Fig.6 Tunel fluorescence staining of liver tumors in mice with primary liver cancer

接下來通過Western blotting對凋亡相關(guān)蛋白(Bax、c-Casp3和c-PARP)進(jìn)行了檢測，具體結(jié)果如圖7所示。由圖7可知：與Model組相比，人參皂苷Rg5處理后，促細(xì)胞凋亡蛋白Bax、c-Casp3和c-PARP的表達(dá)在人參皂苷Rg5組均增高。

圖7 原發(fā)性肝癌小鼠肝臟凋亡相關(guān)蛋白的Western blotting結(jié)果Fig.7 Western blotting results of liver apoptosis related proteins in mice with primary liver cancer

此外，對這3種蛋白表達(dá)進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色，結(jié)果如圖8所示。由圖8可知：促凋亡相關(guān)蛋白Bax、c-Casp3和c-PARP在Model組小鼠肝臟中低表達(dá)。經(jīng)過人參皂苷Rg5治療后，與Model組相比，促凋亡相關(guān)蛋白Bax、c-Casp3和c-PARP蛋白表達(dá)顯著增高。這些數(shù)據(jù)表明，人參皂苷Rg5可以在體內(nèi)動物模型中誘導(dǎo)HCC細(xì)胞凋亡。

HCC被認(rèn)為是慢性肝臟疾病的嚴(yán)重并發(fā)癥，特別是晚期肝臟纖維化和/或肝硬化。大約80%～90%的HCC患者有肝纖維化或肝硬化[12]。因此，肝纖維化和肝硬化是導(dǎo)致HCC發(fā)生的危險因素。本文對小鼠血液中HA和AFP進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg5可以顯著改善HCC小鼠肝纖維化和肝硬化癥狀。

細(xì)胞凋亡是一種高度調(diào)控的細(xì)胞死亡機(jī)制，在平衡細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化信號途徑中起著核心作用[13]。在細(xì)胞凋亡過程中，Bcl-2家族的促凋亡蛋白成員，如Bax、c-Casp 3和c-PARP經(jīng)過蛋白質(zhì)加工和修飾，引起其他促凋亡因子如凋亡誘導(dǎo)因子的釋放，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。本文的研究結(jié)果表明，補(bǔ)充人參皂苷Rg5后，促凋亡蛋白的表達(dá)增加，這表明人參皂苷Rg5通過誘導(dǎo)肝臟腫瘤細(xì)胞的凋亡抑制HCC增殖。

2.5 討論

HCC是全世界癌癥相關(guān)死亡的第四大因素。HCC在早期是沒有癥狀的，這就是為什么80%的患者在中晚期才被診斷出來。晚期HCC患者的死亡率高達(dá)80%，中位生存期不到1年，5年生存率不到20%[9]。在過去的幾十年里，被FDA批準(zhǔn)的藥物——索拉非尼，一直被用于治療中晚期HCC患者。然而，大多數(shù)晚期HCC患者由于生存期短，不能從這種療法中長期受益。同時，其他療法，如肝移植，由于HCC術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，大大影響了肝移植的療效[10]。因此，尋找治療HCC的新策略很重要。在這項(xiàng)研究中，探究了人參皂苷Rg5抑制HCC生長的機(jī)制。

索拉非尼是第一個被批準(zhǔn)用于治療晚期HCC疾病患者的系統(tǒng)性療法，但它存在嚴(yán)重的毒副作用，包括肝毒性、白細(xì)胞減少、中性粒細(xì)胞減少、胃腸道和皮膚毒性，這在臨床實(shí)踐中很常見[11]。本文的結(jié)果顯示，通過測量小鼠的血液中肝功能指標(biāo)，人參皂苷Rg5在體內(nèi)動物研究中改善了HCC小鼠肝損傷，而索拉非尼對HCC小鼠造成了更嚴(yán)重的肝損傷。

3 結(jié)論

人參皂苷Rg5不僅可以顯著抑制原發(fā)性肝癌小鼠肝臟腫瘤的生長，而且還能顯著改善了HCC小鼠肝損傷、肝纖維化和肝硬化癥狀。從作用機(jī)制來看，人參皂苷Rg5通過誘導(dǎo)凋亡作用來抑制HCC增殖。