曾巧輝，林妙鑾，丁瑤，彭名軍，王敬敬*

（1.佛山科學技術學院食品科學與工程學院，廣東省食品智能制造重點實驗室，廣東佛山 528225）（2.廣州市食品檢驗所，廣東廣州 511400）

近年來，由于疫情，人們生活和工作壓力增大，許多人出現(xiàn)了生理或心理疲勞，形勢不可小覷。提高身體機能、緩解疲勞與心理壓力成為運動醫(yī)學和軍事醫(yī)學爭相研究的課題。關于運動疲勞機制的學說主要有四種，分別是能量物質消耗學說、代謝產物堆積堵塞學說、保護性抑制學說、鈣離子代謝紊亂學說等[1-3]。其中“能量物質消耗學說”認為疲勞的產生是由于體內能量物質耗竭，而“代謝產物堆積堵塞學說”則認為是由于體內代謝產物的過多累積，不能及時消除引起肌肉工作能力下降[4]。

在短時間高強度運動時，血清中乳酸、肌酸激酶（Creatine Kinase，CK）等代謝產物增加。CK是反映肌肉的重要臨床指標，如果高CK出現(xiàn)的時間太長，機體較容易出現(xiàn)局部損傷。同時，CK活性的失調也與很多嚴重的疾病的發(fā)生密切相關，比如心肌梗死、病毒性心肌炎。乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase，LDH）則是產生乳酸代謝途徑中的關鍵酶，其催化丙酮酸轉化成乳酸，從而引起肌肉收縮的效率下降導致體力衰竭。因此，對能夠抑制CK與LDH活性的多肽的篩選和鑒定，能夠為疲勞的恢復和有效抑制病理性心肌損傷提供思路。

近年來學者發(fā)現(xiàn)，食物中的一些天然活性成分具有抗疲勞效果，尤其是生物活性肽具有消除體內聚積的乳酸等物質的能力，達到恢復疲勞的效果[4]。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸脫氫酶（Nicotinamide Adenine Dinucleotide Dehydrogenase，NADH Dehydrogenase）是一種蛋白酶，由多個肽鏈（亞基）組成，它可作用于細胞呼吸生理活動中的檸檬酸循環(huán)和糖酵解，在維持細胞生長、分化以及氧化還原反應與能量代謝過程中發(fā)揮著重要作用。系列研究發(fā)現(xiàn)，從魚類、貽貝、海鰻、藻類和魷魚等海洋生物中獲取的多肽均具有較好的抗疲勞活性。陳麗麗等[5]從草魚蛋白質中獲取多肽，發(fā)現(xiàn)草魚蛋白源多肽可以延長小鼠力竭游泳時間。丁樹慧等[6]通過實驗證明，從低值海洋魚類獲取的低聚肽能夠有效地抵抗機體疲勞。陶靜等[7]在制備帶魚高F值寡肽及活性實驗中證明，高F值寡肽具有較好的抗醉酒、醒酒、抗疲勞和抗氧化作用，可用作輔助治療肝性腦病、抗疲勞和抗氧化功能食品的開發(fā)。以上事實都說明魚類蛋白水解產生的多肽對緩解機體運動疲勞具有重要作用。

近年來，分子模擬技術在物理、化學等領域得到了廣泛的應用，但在食品科學領域卻是比較新的技術[8]。傳統(tǒng)的生物活性肽篩選方法主要通過分離純化，結合體內外活性評價進行肽段的確定，整個過程費時、費力且技術難度大。隨著科學技術的發(fā)展，運用計算機輔助酶法技術，通過在線數(shù)據(jù)及虛擬篩選手段研究肽的活性，能夠快速高效的從中發(fā)現(xiàn)和預測具有較高生物活性的肽段，并能夠減少工作強度，提高鑒定成功率[9]。本研究利用計算機模擬水解5種我國常見魚類中的NADH Dehydrogenase蛋白亞基，將模擬水解得到的寡肽與LDH、CK分別進行分子對接研究，分析活性肽與兩種酶的結合能力，研究與兩種酶具有高親和力的肽對它們的抑制作用，研究結果將為提升魚類蛋白質的高值化利用程度以及開發(fā)抗疲勞功能食品提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 魚類蛋白查找與模擬胃腸道酶解

通過NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找我國5種常見魚類（草魚、鳀魚、帶魚、三文魚、子梅魚）蛋白，得到幾種NADH Dehydrogenase蛋白亞基（結果如表1），并得到對應蛋白亞基的FASTA序列?；谟嬎銠C模擬技術運用BIOPEP-UWM數(shù)據(jù)庫中的三種腸胃酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶）[10,11]對以上蛋白進行水解，構建模擬水解NADH Dehydrogenase的小分子肽數(shù)據(jù)庫，并對各蛋白的水解度進行計算。理論水解度的計算公式為：

表1 用的魚種類及其蛋白種類與序列號Table 1 Selected fish species and their protein types and serial numbers

式中：

TDH——理論水解度，%；

d——蛋白質中肽鍵總數(shù)；

D——氫的數(shù)目。

1.2 小分子肽與LDH和CK的分子對接能力評價分析

分子對接技術可以直觀反映配體與受體的相互作用信息，已發(fā)展成為一種預測分子間相互作用結合位點的新方法[12]。本文利用PDB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）獲取LDH和CK的PDB代碼，利用HPEPDOCK（http://huanglab.phys.hust.edu.cn/hpepdock/）將經三種腸胃水解酶切后的5種蛋白質釋放的含有2~5個氨基酸殘基的短鏈寡肽與LDH（PDB代碼7EPM）和CK（PDB代碼1I0E）進行分子對接，獲得各小分子肽對接參數(shù)[13]。即在HPEPDOCK網站首頁，在受體輸入欄中分別輸入LDH和CK相關信息，在配體輸入欄中分別輸入小分子活性肽相關信息，提交之后等待結果即可。其中，評分≤-120的寡肽被認為是高親和力寡肽（見附錄）、評分≤-160的寡肽被認為是超高親和力寡肽。通過蛋白中超高親和力寡肽的頻率（F）來評估魚中NADH Dehydrogenase作為潛在的抗疲勞小分子肽的開發(fā)能力。

式中：

F——出現(xiàn)的頻率；

N——蛋白鏈內超高高親和寡肽的數(shù)量；

L——蛋白鏈的長度。

1.3 超高親和力寡肽與LDH和CK對接及相互作用力分析

江文婷等[14]通過計算機篩選得到海鱸魚抗凍多肽，并進行分子對接分析作用力，發(fā)現(xiàn)這種相互作用可以阻礙肌球蛋白在溫度變化中的結構改變，其機理可能是抗凍多肽結合在肌球蛋白重鏈的結構空腔上，影響了結合水解離后引起的疏水鍵及二硫鍵等化學鍵的形成，阻礙蛋白側鏈聚集、結構改變和冰晶的位移等，這有利于魚糜及魚糜制品在冷凍貯藏中的品質保持。同時，她們經過實驗研究證明海鱸魚源膠原蛋白的胰蛋白酶酶解物確實具有較高的抗凍活性，與計算機模擬效果相一致，該實驗為計算機模擬小分子肽和蛋白的對接準確性提供依據(jù)。

在本文中，將上述方法篩選出的對接分數(shù)和出現(xiàn)頻率較高的小分子肽，利用Pymol[15]（https://www.lfd.uci.edu/~gohlke/pythonlibs/#pymol/）處理配體和受體，構建對接口袋3D圖，明確參與分子間相互作用的氨基酸殘基種類和相互作用力類型。利用Ligplot+[16]（版本號：V.2.2）分析參與分子間相互作用的氨基酸殘基種類和相互作用力類型的2D圖，進一步揭示超高親和力寡肽與LDH、CK的對接結果。

2 結果與討論

2.1 結果

2.1.1 模擬腸胃酶水解目標蛋白質的結果

利用3種腸胃酶（胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶）對5種魚類的NADH Dehydrogenase的多種蛋白亞基進行水解，結果如表2所示。所有蛋白質的TDH在30%~50%范圍內，水解產物主要為氨基酸和寡肽（含有2~5個氨基酸殘基的小分子肽），少部分為多肽（含有5個以上氨基酸殘基的肽）。結果顯示，所選用的NADH Dehydrogenase的多種蛋白亞基的水解產物主要為肽鏈長度在2~5個氨基酸殘基之間的寡肽。其中，TDH較高的NADH Dehydrogenase蛋白亞基包括三文魚中的NADH Dehydrogenase subunit 4L（54.00%）、子梅魚中的NADH Dehydrogenase subunit 3（47.86%）、草魚中的NADH Dehydrogenase subunit 4L（46.65%）。

表2 模擬水解獲得的魚類蛋白質的水解度Table 2 Degree of hydrolysis of fish proteins obtained by simulated hydrolysis

2.1.2 小分子寡肽與LDH的結合能力分析

使用HPEPDOCK數(shù)據(jù)庫研究NADH Dehydrogenase的蛋白亞基水解獲得的小分子寡肽與LDH（PDB代碼為7EPM）的分子對接能力，分子對接分數(shù)≤-120被認為是高親和力肽，對接分數(shù)≤-160被認為是超高親和力肽，F(xiàn)值用于評價小分子寡肽抗疲勞的潛力，超高親和力肽對接評分和F值如表3~7所示。

表3 草魚超高親和力寡肽結合LDH的序列和頻率Table 3 Sequence and frequency of lactate Dehydrogenase binding by ultra-high affinity oligopeptide in Ctenopharyngodon idella

表4 鳀魚超高親和力寡肽結合LDH的序列和頻率Table 4 Sequence and frequency of lactate Dehydrogenase binding by ultra-high affinity oligopeptide in Engraulis japonicus

表5 帶魚超高親和力寡肽結合LDH的序列和頻率Table 5 Sequence and frequency of lactate Dehydrogenase binding by ultra-high affinity oligopeptide in Trichiurus lepturus

表6 三文魚超高親和力寡肽結合LDH的序列和頻率Table 6 Sequence and frequency of lactate Dehydrogenase binding by ultra-high affinity oligopeptide in Oncorhynchus keta

表7 子梅魚超高親和力寡肽結合LDH的序列和頻率Table 7 Sequence and frequency of lactate Dehydrogenase binding by ultra-high affinity oligopeptide in Collichthys lucidus

結果顯示，草魚中的NADH Dehydrogenase subunit 6的F值最大（0.06），其次得到的F值較大的有子梅魚中的NADH Dehydrogenase subunit 6（0.04），草魚中的NADH Dehydrogenase subunit 4（0.04）。同樣，可以觀察到有四種蛋白水解后沒有得到對接分數(shù)≤-160的超高親和力多肽，它們分別是鳀魚中的NADH Dehydrogenase subunit 4L，三文魚中的NADH Dehydrogenase subunit 3和NADH Dehydrogenase subunit 4L，以及子梅魚中的NADH Dehydrogenase subunit 3，其余蛋白的超高親和力寡肽出現(xiàn)的頻率均在0.01~0.03的范圍內。

2.1.3 小分子寡肽與CK的結合能力分析

同樣地，使用HPEPDOCK數(shù)據(jù)庫研究NADH Dehydrogenase的蛋白亞基水解獲得的小分子寡肽與CK（PDB代碼為1I0E）的分子對接能力，結合對接分數(shù)≤-120被認為是高親和力肽，對接分數(shù)≤-160被認為是超高親和力肽，F(xiàn)值用于評價小分子寡肽抗疲勞的潛力，超高親和力肽對接評分和F值如表8~12所示。

表8 草魚超高親和力寡肽結合CK的序列和頻率Table 8 Sequence and frequency of high affinity oligopeptide binding creatine kinase in Ctenopharyngodon idella

表9 鳀魚超高親和力寡肽結合CK的序列和頻率Table 9 Sequence and frequency of high affinity oligopeptide binding creatine kinase in Engraulis japonicus

表10 帶魚超高親和力寡肽結合CK的序列和頻率Table 10 Sequence and frequency of high affinity oligopeptide binding creatine kinase in Trichiurus lepturus

表11 三文魚超高親和力寡肽結合CK的序列和頻率Table 11 Sequence and frequency of high affinity oligopeptide binding creatine kinase in Oncorhynchus keta

表12 子梅魚超高親和力寡肽結合CK的序列和頻率Table 12 Sequence and frequency of high affinity oligopeptide binding creatine kinase in Collichthys lucidus

表13 雙親和高分肽及其出現(xiàn)頻數(shù)Table 13 The occurrence frequency of high peptide in both parents

結果顯示，鳀魚中的NADH Dehydrogenase subunit 6蛋白的F值最大（0.09），其次得到的F值較大的有三文魚中的NADH Dehydrogenase subunit 4L（0.07），三文魚中的NADH Dehydrogenase subunit 6（0.06），草魚中的NADH Dehydrogenase subunit 6（0.05）?？梢杂^察到其中有2種蛋白水解后并沒有得到對接分數(shù)≤-160的超高親和力多肽，它們分別是鳀魚中的NADH Dehydrogenase subunit 3和帶魚中的NADH Dehydrogenase subunit 4L，其余蛋白的超高親和力寡肽的頻率均在0.01~0.04的范圍內。

2.1.4 雙親和寡肽與LDH、CK的結合能力分析

基于以上結果，5種魚類的7種NADH Dehydrogenase蛋白亞基，經模擬水解和分子對接后共得到72個超高親和力寡肽，包括獲得頂級親和力寡肽的NADH Dehydrogenase subunit 6，但仍有少量蛋白水解后并沒有得到對接分數(shù)≤-160的寡肽，且通過觀察數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)7種蛋白源寡肽對CK的親和力比LDH的親和力高。

分析發(fā)現(xiàn)，對LDH、CK均有超高親和力的寡肽共有36種，其中，對LDH、CK分子對接分數(shù)最高的是序列為PTIW（-198.76，-204.40）的寡肽，其次是序列為IPTTW的寡肽（-195.61，-197.57），序列為IACAW的寡肽（-190.26，-191.32），序列為IQTPW的寡肽（-185.63，-180.93）。另外，5種魚類的7種蛋白經水解后獲得的小分子寡肽對LDH、CK均具有超高親和力，并且出現(xiàn)次數(shù)最多的寡肽是ICTH（-161.94，-164.09），草魚、三文魚和子梅魚中的NADH Dehydrogenase subunit 5以及鳀魚的NADH Dehydrogenase subunit 5，這4種蛋白水解后均得到了序列為ICTH的寡肽，其后出現(xiàn)3次的寡肽有PTIW（-198.76，-204.40）、IQTPW（-185.63，-180.93）、QAVIY（-184.66，-168.75）、ITAGY（-174.47，-175.59）、IIITR（-168.36，-172.36）、TGTPF（-162.42，-177.74）。

綜上所述，與LDH、CK對接分數(shù)最高且出現(xiàn)次數(shù)最多的寡肽是PTIW（-198.76，-204.40）。其來源于草魚、鳀魚、三文魚中的NADH Dehydrogenase subunit 4。所得四肽PTIW與LDH、CK兩種酶的對接圖如圖1、2所示（2D結構由LigPlot+軟件制作，版本號：V2.2；3D結構由Pymol軟件制作）。

圖1 寡胎PTIW和LDH、CK兩種酶的對接圖像和2D結構Fig.1 Docking image and 2D structure of oligofetal PTIW with lactate Dehydrogenase and creatine kinase enzymes

圖1a與圖1b分別展示了LDH、CK與PTIW計算機模擬的分子對接位點。由上圖1c知，LDH與PTIW形成了三對氫鍵，其中，在LDH氨基酸序列中Arg270（鍵長2.27，3.19）與PTIW形成了2對氫鍵，與Ser256（鍵長3.20）形成了1對氫鍵。此外，還有14個氨基酸殘基參與形成了疏水作用力，分別是Arg172、So4405、Arg270、Thr184、Pro183、Thr184、Trp189、Val271、Pro273、His272、Asp259、Asn165、Ser168、Ala169。

類似地，由圖1d可得，CK與PTIW也形成了4對氫鍵，對應的氨基酸分別是Leu193（2對，鍵長2.87，3.23），Arg292（鍵長2.40），Arg130（鍵長2.80）。12個殘基涉及到疏水接觸，分別是Glu231、Asp195、Trp228、Arg236、Ile238、Met240、His296、His191、Ser128、Ile188、Phe194、Arg132。

圖2a與圖2b分別展示了LDH、CK與PTIW在Pymol軟件上對接后的結合口袋，可以觀察到序列為PTIW很好地進入LDH、CK的立體結構中，并與周圍的氨基酸殘基形成了緊密的分子相互作用。

圖2 寡胎PTIW和LDH、CK兩種酶的對接圖像的3D結合口袋Fig.2 Oligofetal PTIW and lactate Dehydrogenase, creatine kinase two enzymes docking image of the 3D binding pocket

2.2 討論

2.2.1 運動疲勞的研究分析

運動疲勞定義最早產生于十九世紀末葉，1982年第五屆國際運動生物化學會議將運動疲勞統(tǒng)一定義為：運動性疲勞是人體腦力和體力持續(xù)活動到一定階段出現(xiàn)的生理現(xiàn)象。對于其生理產生機制，目前主要有能量物質消耗學說、代謝產物堆積堵塞學說、保護性抑制學說等[1]。

基于三類學說，本研究通過模擬篩選獲得理論上能夠有效抑制能量物質消耗，減少產物堆積堵塞以及增強中樞神經的保護性抑制的抗運動疲勞小分子活性肽。在短時間高強度運動時，由于氧供應相對不足，糖原代謝增加，血清中乳酸、CK等代謝產物增加。而LDH則是產生乳酸代謝途徑中的關鍵酶，其催化丙酮酸轉化成乳酸，從而引起肌肉收縮效率下降導致體力衰竭[1]，篩選抑制LDH活性肽對避免過度疲勞和運動損傷的發(fā)生具有重要意義。本文通過模擬實驗，利用從魚類NADH Dehydrogenase蛋白中篩選出的多肽與LDH、CK進行分子對接，理論上篩選出具有抑制LDH、CK活力的活性肽，相關成果有助于指導現(xiàn)實中的體內和體外實驗，為定向篩選抗疲勞功能活性肽提供理論指導。

2.2.2 魚類活性蛋白的研究分析

水產品經酶解后得到的多肽降低了人類的患病幾率，增強人們的免疫力的功能，這一事實已經得到了許多專家學者的關注，這類功能性多肽主要來源于藻類、魚類等。由于其結構與組成的差異性，因此，具有的生理功能活性也多種多樣，例如抗氧化活性、免疫調節(jié)、抗疲勞、抗血栓、降血壓和降低膽固醇等[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，線粒體是細胞內活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS）產生的主要部位和氧化損傷的靶細胞器，線粒體DNA（mtDNA）容易遭受ROS攻擊而受損[18,19]。還原型NADH脫氫酶是線粒體呼吸鏈電子傳遞中的關鍵酶，且是ROS產生的主要位點，線粒體DNA編碼構成NADH脫氫酶的7個亞單位（ND1~ND6，ND4L）[20]。Merlo等[21]、Ide等[22]、Piruat等[23]、彭瓊玲等[24]均對還原型NADH脫氫酶蛋白的生理活性作了研究，一致推測機體可以通過影響mtDNA的表達，調節(jié)NADH脫氫酶的組成單位及數(shù)量來適應能量代謝需要以及抑制ROS介導的組織細胞損傷，總的來說NADH脫氫酶具有抗氧化活性。另外，水產品生物多肽本身具有抗氧化活性，其能夠清除人體內自由基[25]。相關研究成果已經被廣泛報道，如通過酶解鱈魚皮得到的多肽氨基酸序列為His-Gly-Pro-Leu-Gly-Pro-Leu[26]，其抗氧化活性好；陳麗麗等[27]對草魚多肽的抗氧化活性與抗疲勞作用進行了研究，發(fā)現(xiàn)提取出的草魚多肽具有抗氧化、抗疲勞活性。Qian等[28]研究牡蠣蛋白多肽并且從中分離出一種較純的抗氧化肽，其抗氧化活性比維生素E更高。因此，本文中通過計算機模擬篩選出的來自魚類NADH Dehydrogenase的超高親和力活性肽PTIW（氨基酸序列為Pro-Thr-Ile-Trp），有可能同樣具有超高抗氧化活性，但最終結果有待進一步實驗認證。

2.2.3 雙超高親和力寡肽

本研究共分析了來源于5種魚類的NADH Dehydrogenase的7個亞單位，共23種不同結構的蛋白，水解后通過分子對接共獲得72個具有超高親和寡肽，具有雙超高親和力寡肽的有36種。其中對接分數(shù)均在-180~-160的寡肽共有31個分別為DQTW、ESTSF、ETSW、GPDW、ICTH、IIITR、IITSN、IITTM、IPTM、ITAAY、ITAGY、ITASY、PAIIH、PAPY、PATVH、PAVIH、PDPR、PEAW、PEGW、PTGTF、PTPY、QAPSF、QAVIY、QTW、SETGW、TATW、TAVW、TGTPF、VIQY、VISAW、VSGQY；對接分數(shù)均在-200~-180的寡肽共有5個，分別為IACAW、IPITW、IQTPW、PESW、PTIW，其中對接分數(shù)最高的肽是PTIW。根據(jù)分析結果，觀察到雙超高親和寡肽的對接評分主要在-180到-160之間，對接評分-200到-180也有多個，這些寡肽都為低分子量且具有較好功能活性的肽，具有良好的生物利用度，更易于通過腸道發(fā)揮功能，也是選出的對LDH、CK具有理論抑制作用的生物活性肽，這些成果提示魚類蛋白源多肽可能是抗疲勞功能性食品和保健品研發(fā)的重要資源。

2.2.4 重復的雙超高親和力寡肽

23種不同結構的NADH Dehydrogenase蛋白模擬水解后的雙超高親和力寡肽有36種共143個多肽，其中，ICTH是重復出現(xiàn)次數(shù)（4次）最多的寡肽，其次是寡肽PTIW、IIITR、IQTPW、ITAGY、QAVIY、TGTPF（重復出現(xiàn)3次），以及重復次數(shù)為2個的寡肽，分別是PAPY、PAVIH、QTW。在出現(xiàn)重復的雙超高親和力肽中，QTW為含有3個氨基酸序列的寡肽；含有5個氨基酸序列的寡肽最多，有6種，分別是IIITR、IQTPW、ITAGY、QAVIY、TGTPF、PAVIH；含有4個氨基酸的寡肽3種，分別是ICTH、PTIW、PAPY。重復出現(xiàn)的雙超高親和力寡肽表明，不同結構的蛋白質水解后可以得到相同的超高親和力寡肽序列，說明這些寡肽在魚類蛋白中的來源較廣，為該類物質的開發(fā)利用奠定前提條件。

3 結論

LDH和CK活性的抑制有助于運動疲勞的恢復，并能有效減輕疲勞引起的病理性心肌損傷。本研究利用計算機模擬水解5種我國常見魚類中的NADH Dehydrogenase亞基，得到的小分子寡肽分別與疲勞產生相關的LDH和CK兩種酶進行分子對接，共獲得72個超高親和力寡肽，其中，與LDH、CK均具有超高親和力的寡肽共36種，對接分數(shù)最高且出現(xiàn)次數(shù)最多的寡肽是PTIW，研究結果為提升魚類蛋白質的高值化利用以及開發(fā)抗疲勞功能食品提供理論參考。