劉延忠 ，賈新梅 ，郭洪章 ，王雪蓮 ，劉東升 （1.甘肅省藥品監(jiān)督管理局信息中心統(tǒng)計咨詢科，蘭州 70070；.武威市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，甘肅 武威 7000；.甘肅省中醫(yī)院消化內(nèi)科，蘭州 7000；.甘肅省藥品監(jiān)督管理局審核查驗中心藥品檢查科，蘭州 70070；.甘肅省藥品檢驗研究院中成藥檢驗研究室，蘭州 70070）

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種慢性功能性胃腸道疾病，主要分為4 種類型：腹瀉型IBS、便秘型IBS（constipation-predominant irritable bowel syndrome，IBS-C）、混合型IBS 和未分類IBS[1]。其中，IBS-C 約占IBS 的三分之一，以腹痛、排便不盡、排便習慣改變等為主要表現(xiàn)，雖不造成任何器質(zhì)性病變和生化指標異常，但會嚴重影響患者（尤其是功能性腸道疾病患者）的生活質(zhì)量和工作效率[2]。研究指出，與西藥治療相比，中藥治療能更好地緩解IBS 患者的相關(guān)癥狀，同時可使其復發(fā)率更低[3]?？梢?，有必要不斷探索可有效治療IBS-C的中藥。

有“沙漠人參”之稱的中藥肉蓯蓉來源于列當科植物肉蓯蓉Cistanche deserticolaY. C. Ma 或管花肉蓯蓉Cistanche tubulosa（Schenk）Wight 的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，具有溫腎通便、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、保護神經(jīng)等藥理作用；其活性成分之一的肉蓯蓉多糖（以下簡稱“CDPS”）可調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)和組成，促進益生菌生長，對維持腸道健康具有重要作用[4]。研究表明，CDPS可通過恢復腸道微生物群失調(diào)來緩解衰老小鼠的認知能力下降[5]，但其對IBS-C的具體作用尚不明確。

神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）是一種原型神經(jīng)營養(yǎng)因子，具有維持和誘導外周神經(jīng)細胞分化的能力，可作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)；原肌球蛋白受體激酶A（tropomyosin receptor kinase A，TrkA）是受體酪氨酸激酶家族的關(guān)鍵成員，也是NGF的同源受體[6]。研究發(fā)現(xiàn)，NGF介導的TrkA信號轉(zhuǎn)導與炎癥相關(guān)的內(nèi)臟痛覺過敏的發(fā)展有關(guān)，且NGF、TrkA 在IBS 患者結(jié)腸黏膜組織中的表達均明顯上調(diào)，故抑制NGF 可能是治療該癥的重要策略[7]；另一項基于脊髓損傷白化大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，肉蓯蓉提取物中的低聚糖能通過激活NGF 前體來發(fā)揮抗炎、抗氧化應激、抗凋亡作用[8]。由此可見，肉蓯蓉的糖類提取物（如CDPS）可能對NGF 介導的信號通路具有一定的調(diào)控作用。為驗證這一假設(shè)，本研究擬基于NGF/TrkA 信號通路探討CDPS對IBS-C 大鼠的影響，以期為探索更多有效治療IBS-C的方案提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括SpectraMax iD5 型多功能微孔酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]，E100型光學顯微鏡（日本Nikon 公司），CFX96 Touch 型熒光定量聚合酶鏈反應（PCR）儀、ChemiDoc MP型全能成像系統(tǒng)[伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司]等。

1.2 主要藥品與試劑

CDPS[貨號BJ-1962，規(guī)格200 mg（每克相當于生藥12.61 g）]購自北京凱詩源生物科技有限公司；枸櫞酸莫沙必利片[陽性對照，批號20220824，規(guī)格5 mg（按C21H25ClFN3O3·C6H8O7計算）]購自江蘇豪森藥業(yè)集團有限公司；蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色試劑盒（貨號E-IR-R117）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；RNA提取試劑（Trizol法）、兩步法實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）試劑盒（貨號分別為R401-01、R232-01）均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；兔源NGF、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體和兔源TrkA 單克隆抗體（貨號分別為ab6199、ab9485、ab302524）均購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG 二抗（貨號FNab09778）購自武漢菲恩生物科技有限公司；5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（貨號EK-H12226）購自上海酶研生物科技有限公司。

1.3 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠，6周齡，體重（200±20）g，購自中國農(nóng)業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，動物生產(chǎn)許可證號為SYXK（甘）2020-0002。所有大鼠均在26 ℃、60%相對濕度的環(huán)境下飼養(yǎng)，并自由攝食、飲水。本實驗方案經(jīng)武威市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準，批號為2022倫審0003號。

2 方法

2.1 大鼠模型的建立與分組

所有大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后，將其分為對照組（20只）和造模組（90 只）。對照組大鼠正常飼養(yǎng)；造模組大鼠參照文獻方法[9]，每天上午8：00灌胃0～4 ℃生理鹽水2 mL，連續(xù)14 d，以建立IBS-C 大鼠模型。末次灌胃結(jié)束后，所有大鼠禁食禁水4 h，記錄這4 h 內(nèi)各組大鼠的糞便顆粒數(shù)，并根據(jù)Bristol糞便性狀分型量表[10]進行評分，若糞便顆粒數(shù)、Bristol 評分均顯著低于對照組則表明造模成功。由于造模期間，造模組大鼠有2只死亡，5只的糞便顆粒數(shù)、Bristol評分與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），故本研究隨機選擇造模成功的80只大鼠，分為模型組、陽性對照組、CDPS 低劑量組、CDPS高劑量組，每組20只。陽性對照組大鼠灌胃枸櫞酸莫沙必利混懸液1.35 mg/kg（以水為溶劑）[11]，CDPS低、高劑量組大鼠分別灌胃CDPS 混懸液50、100 mg/kg（以水為溶劑）[5]，對照組和模型組大鼠均灌胃等體積水，每天1次，持續(xù)28 d。

2.2 大鼠糞便含水量檢測

給藥期間，每天清理大鼠糞便；末次給藥結(jié)束后，將大鼠放入代謝籠中，收集其排泄的新鮮糞便并置于無菌管中稱重（即新鮮糞便質(zhì)量）；隨后，將糞便干燥24 h（80 ℃），再次稱重（即干燥糞便質(zhì)量）并按下式計算糞便的含水量：含水量＝（新鮮糞便質(zhì)量-干燥糞便質(zhì)量）/新鮮糞便質(zhì)量×100%。

2.3 大鼠血清中5-HT含量檢測

采用ELISA法進行檢測。糞便含水量檢測結(jié)束后，將大鼠用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，于腹主動脈采血2 mL，離心后分離上層血清，置于-20 ℃保存，備用。取各組大鼠上述血清樣品，采用ELISA法以酶標儀檢測其5-HT含量。嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.4 大鼠腸道炭末推進率檢測

采用炭末推進法進行檢測。采血后，從每組大鼠中隨機選取5只，禁食不禁水24 h后，灌胃5%活性炭和4%阿拉伯膠混懸液（二者體積比1∶2）10 mL/kg；30 min后，用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉，以頸椎脫位法處死，打開腹腔取出完整的腸道組織，平放在吸水紙上，測量腸管長度（即小腸全長）和幽門至炭末前沿的距離并按下式計算炭末推進率：炭末推進率＝幽門至炭末前沿的距離/小腸全長×100%。

2.5 大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)觀察

采用HE 染色法進行觀察。將各組剩余大鼠用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉后，以頸椎脫位法處死，取出其結(jié)腸組織于-80 ℃凍存。從每組樣品中隨機選取5只小鼠的組織樣品，放入4%多聚甲醛中固定過夜，隨后行常規(guī)石蠟包埋、切片；切片以HE 染色后，再以梯度乙醇脫水、二甲苯透明，以中性樹脂封片后，使用顯微鏡觀察各組大鼠結(jié)腸組織的病理形態(tài)。

2.6 大鼠結(jié)腸組織中NGF、TrkA mRNA表達檢測

采用qRT-PCR 法進行檢測。從“2.5”項下凍存的每組樣品中隨機選取另5 只小鼠的結(jié)腸組織樣品，利用Trizol 法提取RNA，再利用反轉(zhuǎn)錄試劑將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA；以cDNA 為模板進行PCR 擴增，反應體系包括：2×SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物（具體序列及產(chǎn)物長度見表1）各0.4 μL，cDNA 模板1 μL，加ddH2O 至20 μL。反應程序包括：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算大鼠結(jié)腸組織中NGF、TrkA mRNA的相對表達量。

表1 qRT-PCR引物及產(chǎn)物長度

2.7 大鼠結(jié)腸組織中NGF、TrkA蛋白表達檢測

采用Western blot法進行檢測。從“2.5”項下凍存的每組樣品中選取剩余5只小鼠的結(jié)腸組織樣品，放入勻漿器中，加入蛋白裂解液勻漿并提取總蛋白，以BCA測定法進行蛋白定量后再作變性處理。取變性蛋白適量，以10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜上，然后以5%脫脂奶粉于4 ℃下封閉過夜；加入NGF、TrkA、GAPDH 一抗（稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶2 500），室溫孵育2 h；加入相應二抗（稀釋比例為1∶1 000），室溫孵育2 h；再以ECL試劑避光顯色后，于全能成像系統(tǒng)下成像。以GAPDH為內(nèi)參，使用Image J軟件分析目的蛋白的相對表達量。

2.8 統(tǒng)計學方法

利用GraphPad Prism 9.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 CDPS對大鼠糞便含水量的影響

與對照組比較，模型組大鼠的糞便含水量顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各藥物組大鼠的糞便含水量均顯著升高（P＜0.05），且陽性對照組和CDPS高劑量組上述指標與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠的糞便含水量、血清5-HT含量和炭末推進率比較（±s）

表2 各組大鼠的糞便含水量、血清5-HT含量和炭末推進率比較（±s）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組陽性對照組CDPS低劑量組CDPS高劑量組糞便含水量（n＝20）/%60.54±3.11 38.42±2.15a 58.83±2.64b 47.16±2.38ab 59.21±2.93b 5-HT（n＝20）/（ng/mL）40.28±2.76 63.41±4.12a 43.16±3.24b 55.62±3.41ab 42.83±3.32b炭末推進率（n＝5）/%74.65±3.41 51.34±2.38a 72.46±3.23b 63.20±2.81ab 73.79±3.26b

3.2 CDPS對大鼠血清中5-HT含量的影響

與對照組比較，模型組大鼠血清中5-HT 含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各藥物組大鼠血清中5-HT含量均顯著降低（P＜0.05），且陽性對照組和CDPS高劑量組上述指標與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

3.3 CDPS對大鼠炭末推進率的影響

與對照組比較，模型組大鼠的炭末推進率顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各藥物組大鼠的炭末推進率均顯著升高（P＜0.05），且陽性對照組和CDPS高劑量組上述指標與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

3.4 CDPS對大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響

對照組大鼠的結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整，黏膜層腺體排列整齊，無明顯炎癥細胞浸潤；與對照組比較，模型組大鼠的結(jié)腸組織黏膜肌層出現(xiàn)斷裂，腺體紊亂，炎癥細胞浸潤和細胞水腫明顯；與模型組比較，陽性對照組和CDPS低、高劑量組大鼠的結(jié)腸組織形態(tài)逐漸恢復，黏膜層腺體排列較規(guī)則，炎癥細胞浸潤和細胞水腫明顯減輕，其中陽性對照組、CDPS 高劑量組的形態(tài)與對照組較為接近。結(jié)果見圖1。

圖1 各組大鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的顯微圖

3.5 CDPS 對大鼠結(jié)腸組織中NGF、TrkA mRNA 水平的影響

與對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中NGF、TrkA mRNA 的相對表達量均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各藥物組大鼠結(jié)腸組織中NGF、TrkA mRNA的相對表達量均顯著降低（P＜0.05），且陽性對照組和CDPS高劑量組上述指標與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠結(jié)腸組織中NGF、TrkA mRNA 及蛋白的相對表達量比較（±s）

表3 各組大鼠結(jié)腸組織中NGF、TrkA mRNA 及蛋白的相對表達量比較（±s）

a：與對照組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組陽性對照組CDPS低劑量組CDPS高劑量組mRNA（n＝5）NGF 0.59±0.04 1.03±0.08a 0.63±0.04b 0.85±0.06ab 0.62±0.05b TrkA 0.48±0.03 0.99±0.07a 0.52±0.04b 0.74±0.05ab 0.51±0.03b蛋白（n＝5）NGF 0.79±0.05 1.45±0.09a 0.84±0.07b 1.16±0.08ab 0.83±0.06b TrkA 0.67±0.04 1.38±0.08a 0.71±0.06b 1.08±0.07ab 0.69±0.05b

3.6 CDPS 對大鼠結(jié)腸組織中NGF、TrkA 蛋白表達的影響

與對照組比較，模型組大鼠結(jié)腸組織中NGF、TrkA蛋白的相對表達量均升高（P＜0.05）；與模型組比較，各藥物組大鼠結(jié)腸組織中NGF、TrkA 蛋白的相對表達量均顯著降低（P＜0.05），且陽性對照組和CDPS高劑量組上述指標與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)果見表3、圖2。

圖2 各組大鼠結(jié)腸組織中NGF、TrkA蛋白表達的電泳圖

4 討論

IBS是一種常見的胃腸道疾病，其特征以腹部不適、腹痛反復發(fā)作并伴排便習慣改變?yōu)橹?，嚴重降低了患者的生活質(zhì)量[12]。學界普遍認為，IBS-C 的發(fā)病機制與自主神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙、內(nèi)臟高敏感性、腸道細菌過度生長和腸道炎癥等有關(guān)，然而能有效改善IBS-C患者癥狀的上市治療方案很少[13]。IBS-C 屬中醫(yī)“便秘”范疇，病因為脾虛氣弱、肝郁不暢、郁而化火，從而致大腸傳導功能異常[14]。肉蓯蓉是一種可增強機體腸道蠕動、提升免疫力、抗衰老、抗氧化的功能性藥用植物。CDPS作為其主要活性成分，不僅具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化和抗炎等多種生物活性，而且在改善老年人便秘方面也有較大潛力[15]，但該組分對IBS-C 的作用尚不明確。枸櫞酸莫沙必利是消化道促動力劑，常用于改善功能性消化不良、慢性胃炎伴燒心、噯氣、惡心、嘔吐、早飽、上腹脹、上腹痛等消化道癥狀[16]。基于此，本研究建立了IBS-C 大鼠模型，并以枸櫞酸莫沙必利為陽性對照，結(jié)果顯示，模型組大鼠的糞便含水量和炭末推進率均較對照組顯著降低，結(jié)腸組織黏膜肌層出現(xiàn)斷裂，腺體紊亂，炎癥細胞浸潤和細胞水腫明顯；而各藥物組大鼠的糞便含水量和炭末推進率均較模型組顯著升高，結(jié)腸組織損傷有所減輕，上述指標（CDPS低劑量組除外）與對照組相當，組織形態(tài)（CDPS低劑量組除外）逐漸接近于對照組。這提示CDPS可軟化IBS-C模型大鼠的糞便，促進糞便排出，從而緩解結(jié)腸組織的病理改變，高劑量CDPS 的作用與陽性對照藥物相當。

內(nèi)臟超敏反應是IBS 的重要病理生理變化之一，與腹痛有關(guān)，可涉及神經(jīng)系統(tǒng)的多個層次，如包括NGF 在內(nèi)的多種神經(jīng)內(nèi)分泌介質(zhì)[17]。NGF 是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族的重要成員，參與了內(nèi)臟超敏反應過程，可導致內(nèi)臟疼痛閾值降低[18]。研究顯示，NGF可誘導腸道干細胞增生，并驅(qū)動其擴增、分化為分泌細胞，從而促進神經(jīng)遞質(zhì)5-HT 高表達，最終導致內(nèi)臟痛覺敏感和胃腸道運動加劇[18]。TrkA 是NGF 的高親和力受體，兩者結(jié)合后可調(diào)節(jié)下游信號通路（如促分裂原活化的蛋白激酶/胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路等），從而促進神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸受體的表達和神經(jīng)可塑性的改變[19]。研究顯示，通瀉安腸湯可通過抑制NGF/TrkA 信號通路來減輕腹瀉型IBS 大鼠的內(nèi)臟高敏感性[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中5-HT含量和結(jié)腸組織中NGF、TrkA mRNA 及蛋白的相對表達量均顯著高于對照組，而各藥物組大鼠血清中5-HT 含量和結(jié)腸組織中NGF、TrkA mRNA 及蛋白的相對表達量均顯著低于模型組，且陽性對照組和CDPS 高劑量組上述指標與對照組比較差異均無統(tǒng)計學意義。這提示CDPS可抑制NGF/TrkA 信號通路的激活，減少5-HT 的產(chǎn)生，減輕IBS-C大鼠的內(nèi)臟高敏感性和胃腸道運動，從而抑制IBS-C的發(fā)展。

綜上所述，CDPS能夠緩解IBS-C大鼠的癥狀，其作用可能與NGF/TrkA信號通路被抑制有關(guān)。本研究初步證實了CDPS 對IBS-C 具有潛在的治療作用，并提供了相關(guān)理論依據(jù)。然而有研究發(fā)現(xiàn)，CDPS 能夠通過激活Wnt/β-聯(lián)蛋白信號通路來預防骨質(zhì)疏松，同時該通路的激活增加了NGF的分泌[20—21]。但關(guān)于這兩種信號途徑在IBS-C發(fā)生發(fā)展中的級聯(lián)反應還有待深入探索。