胡克榮 ，陳 瑞 ，班玉娟 ，黃 靜 （.貴州醫(yī)科大學藥學院，貴陽 550004；.貴州省化學合成藥物研發(fā)利用工程技術(shù)研究中心，貴陽 550004）

斑蝥酸鈉是斑蝥素的一種小分子半合成衍生物，作為一種能調(diào)節(jié)免疫并升高白細胞的廣譜抗腫瘤藥，在臨床上具有重要的應用價值，常與其他化療藥物聯(lián)合用于中晚期腫瘤治療[1]。卡培他濱是一種高效的口服氟尿嘧啶氨甲酸酯類化療藥物，在體內(nèi)可通過逐級酶聯(lián)反應最終轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟尿嘧啶，而發(fā)揮抗腫瘤作用，已廣泛用于胰腺癌、乳腺癌、胃癌等實體瘤的治療[2—4]。

臨床上斑蝥酸鈉常聯(lián)合卡培他濱用于惡性腫瘤的治療，如斑蝥酸鈉維生素B6注射液聯(lián)合卡培他濱治療結(jié)直腸癌，可有效控制患者疾病進展，療效顯著[5]。斑蝥酸鈉維生素B6注射液與卡培他濱聯(lián)合治療胃腸道腫瘤，可有效提高單藥化療的有效率，同時減輕化療所致的骨髓抑制、胃腸道反應等毒性反應[6]。由此可見，二者聯(lián)合使用可以改善患者的免疫功能，提高化療效果，改善患者的生存質(zhì)量。但有研究指出，卡培他濱在聯(lián)合其他抗腫瘤藥物時，會產(chǎn)生許多不良反應，包括厭食、腹瀉、嘔吐、口腔炎、腹痛、手足綜合征和困倦等[7]。出現(xiàn)不良反應后，患者的血液和淋巴系統(tǒng)、肝膽管系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)以及神經(jīng)系統(tǒng)可能受到損傷，臨床主要表現(xiàn)為血糖升高、肝功能異常、腎功能不全以及小腦功能障礙等[8]，因此，研究二者聯(lián)用后的藥動學參數(shù)變化具有重要意義?；诖耍疚臄M建立測定大鼠血漿中卡培他濱血藥濃度的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）法，通過測定聯(lián)用斑蝥酸鈉和未聯(lián)用斑蝥酸鈉大鼠體內(nèi)卡培他濱的血藥濃度，來計算并比較兩者主要的藥動學參數(shù)，以明確斑蝥酸鈉對卡培他濱在大鼠體內(nèi)藥動學行為的影響，旨在為二者聯(lián)用的安全性和有效性提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括1290 LC/TQ型超高效液相色譜儀、TSQ 6470型三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Agilent 公司），GENESPEED1730R 型冷凍高速離心機（香港科技有限公司），JN300-2 型氮氣吹掃儀（蘇州吉米諾儀器有限公司），F(xiàn)A805N 型十萬分之一電子天平（上海菁海儀器有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

卡培他濱對照品（批號420018-201802，純度≥99%）購自中國食品藥品檢定研究院；甲苯磺丁脲對照品（內(nèi)標，批號BD154332，純度≥98%）購自上海畢得醫(yī)藥科技有限公司；斑蝥酸鈉注射液（批號180303，規(guī)格2 mL∶0.1 mg）購自貴州金橋藥業(yè)有限公司；卡培他濱片（批號SH2902，規(guī)格0.5 g）購自上海羅氏制藥有限公司；肝素鈉（批號605K0213，純度≥99%）購自北京索萊寶科技有限公司；質(zhì)譜級甲醇、乙腈、甲酸均購自德國Merck公司；水為超純水。

1.3 動物

SPF 級健康雄性SD 大鼠，體重（230±10）g，由貴州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，生產(chǎn)許可證號為SCXK（黔）2018-0001，大鼠在（22±2） ℃的環(huán)境下飼養(yǎng)7 d，光照和黑暗各12 h循環(huán)，給藥前禁食12 h并自由飲水。

2 分析方法的建立

2.1 對照品溶液和內(nèi)標溶液的制備

分別精密稱取卡培他濱對照品或內(nèi)標適量，加入甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度均為1 mg/mL 的貯備液，用濾膜濾過后，取續(xù)濾液，置于4 ℃冰箱保存，臨用時用甲醇稀釋至所需濃度，即得對照品溶液或內(nèi)標溶液。

2.2 色譜與質(zhì)譜條件

本研究的色譜條件為：以Agilent XBridge Aq C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）為色譜柱，0.1%甲酸溶液（A）- 0.1%甲酸乙腈溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～1 min，5%B；1～2.5 min，60%B；2.5～3.5 min，80%B；3.5～5.0 min，5%B）；流速為0.4 mL/min；柱溫為35 ℃；進樣量為2 μL。

本研究的質(zhì)譜條件為：采用電噴霧離子源以正離子模式掃描，掃描方式為選擇反應監(jiān)測；離子源溫度為350 ℃；離子化電壓為3 500 V；氣簾氣壓為35 psi；霧化氣壓力為55 psi；輔助氣壓力為50 psi；卡培他濱、內(nèi)標定量分析的離子對（m/z）分別為360.16→174.00、271.11→91.00，碰撞能量分別為24、40 eV。

2.3 樣品的預處理

精密量取待測血漿樣品100 μL，置于1.5 mL離心管中，先加入20 μL內(nèi)標溶液（質(zhì)量濃度為200 ng/mL），再加入800 μL乙酸乙酯，渦混10 min后，于4 ℃、13 000 r/min離心10 min。將上層乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移至2.0 mL的EP管中，為使藥物萃取完全，剩余下層沉淀再加入800 μL乙酸乙酯以同樣的方式萃取第2次；合并2次上層萃取液，以37 ℃氮氣流吹干。吹干后的殘渣儲存于-80 ℃冰箱中，臨用前加入100 μL 甲醇復溶，渦混10 min 后，以13 000 r/min離心10 min，取上清液進樣分析。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性考察

精密量取“2.1”項下對照品貯備液和內(nèi)標貯備液，用甲醇稀釋，制成卡培他濱與內(nèi)標的混合對照品溶液。取大鼠空白血漿，按“2.3”項下方法預處理，不加內(nèi)標，制成空白血漿樣品。另取大鼠給藥2 h 后的血漿樣品，按“2.3”項下方法預處理，制成卡培他濱血漿樣品。將上述處理后的樣品分別按“2.2”項下條件進樣分析。如圖1所示，卡培他濱、內(nèi)標的保留時間分別為2.49、2.75 min，卡培他濱的色譜峰與內(nèi)標峰分離良好，互不干擾，兩峰在空白血漿色譜圖中相同位置處沒有內(nèi)源性雜質(zhì)峰干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 空白血漿樣品、混合對照品溶液、血漿樣品的色譜圖

2.4.2 標準曲線繪制和定量下限考察

取大鼠空白血漿，加入“2.1”項下對照品溶液，制成卡培他濱質(zhì)量濃度分別為6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 ng/mL的標準血漿溶液。按“2.3”項下方法預處理后，再按“2.2”項下條件進樣分析，記錄峰面積。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、卡培他濱與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標（y），用加權(quán)最小二乘法計算回歸方程。結(jié)果顯示，卡培他濱的回歸方程為y＝0.055 2x+0.491 9（R2＝0.999 4），線性范圍為6.25～800 ng/mL，定量下限為6.25 ng/mL，符合2020 年版《中國藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求。

2.4.3 精密度和準確度考察

取大鼠空白血漿100 μL，加入“2.1”項下對照品貯備液，制成卡培他濱質(zhì)量濃度分別為6.25、10、100、600 ng/mL（定量下限和低、中、高質(zhì)量濃度）的質(zhì)控血漿樣品。按“2.3”項下方法預處理后，再按“2.2”項下條件進樣分析，記錄峰面積。各濃度連續(xù)進樣6次考察日內(nèi)精密度，連續(xù)進樣5 d 考察日間精密度。將峰面積代入同批隨行回歸方程計算卡培他濱的質(zhì)量濃度，并與理論質(zhì)量濃度相比，計算準確度。如表1顯示，日內(nèi)和日間精密度的RSD 均不高于3.49%（n＝6 或n＝5），準確度為99.08%～104.79%，符合2020 年版《中國藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求。

表1 大鼠血漿中卡培他濱的精密度與準確度考察結(jié)果

2.4.4 提取回收率和基質(zhì)效應考察

按“2.4.3”項下方法制備低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.2”項下條件進樣分析，計算卡培他濱與內(nèi)標峰面積比（A）。取空白血漿100 μL，按“2.3”項下方法預處理后，再加入相應質(zhì)量濃度的卡培他濱對照品溶液和內(nèi)標溶液，使質(zhì)量濃度與前者一致，按“2.2”項下條件進樣分析，計算卡培他濱與內(nèi)標峰面積比（B）。另制備卡培他濱對照品溶液和內(nèi)標溶液質(zhì)量濃度與前者一致的純?nèi)芤海ú缓獫{），按“2.2”項下條件進樣分析，計算卡培他濱與內(nèi)標峰面積比（C）。按如下公式計算提取回收率和基質(zhì)效應：提取回收率＝A/C×100%，基質(zhì)效應＝B/C×100%。每個質(zhì)量濃度樣品平行制備3 份。如表2 所示，提取回收率為85.31%～91.67%，RSD 均不高于3.02%（n＝3）；基質(zhì)效應為85.84%～95.31%，RSD 均不高于3.65%（n＝3），符合2020年版《中國藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求。

表2 大鼠血漿中卡培他濱的提取回收率和基質(zhì)效應考察結(jié)果（n＝3）

2.4.5 稀釋可靠性考察

按“2.4.3”項下方法制備質(zhì)量濃度相當于低、中、高質(zhì)量濃度質(zhì)控血漿樣品5、20、40倍的卡培他濱質(zhì)控血漿樣品，再用空白血漿進行稀釋，使3個質(zhì)量濃度質(zhì)控血漿樣品的終質(zhì)量濃度分別為10、100、600 ng/mL，按“2.3”項下方法預處理后，再按“2.2”項下條件進樣分析，記錄峰面積。每個稀釋倍數(shù)下各質(zhì)量濃度樣品平行制備3份，根據(jù)同批隨行回歸方程計算卡培他濱的質(zhì)量濃度。如表3所示，在不同稀釋倍數(shù)下，所有質(zhì)量濃度質(zhì)控血漿樣品的RSD均不高于9.84%（n＝3），符合2020年版《中國藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求。

表3 不同稀釋倍數(shù)下卡培他濱質(zhì)控血漿樣品的稀釋可靠性結(jié)果（n＝3，%）

2.4.6 穩(wěn)定性考察

按“2.4.3”項下方法制備低、中、高質(zhì)量濃度的質(zhì)控血漿樣品，每個質(zhì)量濃度樣品平行制備3份，分別于室溫（20 ℃）下存放24 h、4 ℃下存放48 h、-80 ℃下存放48 h、-80 ℃和室溫下反復凍融3次后，按“2.3”項下方法預處理，再按“2.2”項下條件進樣分析，所有樣品均按同批隨行回歸方程計算卡培他濱的質(zhì)量濃度。結(jié)果顯示，各樣品在上述不同條件下穩(wěn)定性良好，RSD 均不高于7.24%（n＝3），符合2020 年版《中國藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求。

3 藥動學研究

將24 只健康雄性SD 大鼠隨機分為4 組：對照1 組、對照2組、實驗1組、實驗2組，每組6只。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水0.5 mL/kg，實驗組大鼠腹腔注射斑蝥酸鈉注射液0.5 mL/kg（相當于25 μg/kg），考慮到臨床給藥的長期性，故連續(xù)給藥7 d。第8 天給藥后，對照1 組和實驗1組大鼠灌胃卡培他濱片5 mg/kg，對照2組和實驗2組大鼠靜脈注射卡培他濱5 mg/kg[將卡培他濱片研磨成細粉至無顆粒狀后，稱取一定量的卡培他濱細粉，采用助溶劑（N，N-二甲基乙酰胺-聚乙二醇400-水的體積比為2∶4∶1）溶解后，使卡培他濱的終質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，配制時先加入N，N-二甲基乙酰胺并超聲2 min，再加入聚乙二醇400，渦旋混勻，最后加入水，超聲至澄清透明，用于靜脈給藥]。分別于灌胃卡培他濱后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、6、8、12、16、24、30 h 和靜脈注射卡培他濱后0.033、0.15、0.5、1、1.5、2、4、6、8、12、16、24、30 h 從大鼠眼眶靜脈叢采集全血0.2 mL，置于用肝素鈉處理后的1.5 mL 離心管中，以4 ℃、3 500 r/min 離心10 min，分離血漿（血漿的采集和分離過程均在冰浴中進行），將得到的血漿置于-80 ℃冰箱中凍存，待測。取凍存的血漿樣品放置至室溫，按“2.3”項下方法預處理后，再按“2.2”項下條件進樣分析，記錄峰面積，并按隨行回歸方程計算各組大鼠給藥后不同時間點血漿中卡培他濱的質(zhì)量濃度，采用GraphPad Prism 8.0.1 軟件繪制藥-時曲線。采用DAS 2.0軟件和非房室模型統(tǒng)計矩方法計算卡培他濱的藥動學參數(shù)，計量資料以±s表示，用GraphPad Prism 8.0.1 軟件對藥動學參數(shù)進行配對t檢驗，檢驗水準α＝0.05。結(jié)果見圖2和表4。如表4所示，與對照1 組比較，實驗1 組的無窮大時間內(nèi)的平均滯留時間（mean residencetime within infinite time，MRT0-∞）、峰濃度（maximum concentration，cmax）、30 h 內(nèi)的藥-時曲線下面積（area under the concentration-time curve within 30 h，AUC0-30h）、AUC0-∞和生物利用度（bioavailability，F(xiàn)）均顯著升高，表觀清除率（apparent clearance，CLz/F）均顯著降低（P＜0.01）；與對照2 組比較，實驗2 組的半衰期（half-life time，t1/2）、MRT0-30h、MRT0-∞、AUC0-30h、AUC0-∞均顯著升高（P＜0.01）。

表4 卡培他濱的主要藥動學參數(shù)

圖2 卡培他濱灌胃和靜脈給藥的藥-時曲線

4 討論

本研究在血漿樣品前處理中，分別使用甲醇、乙腈沉淀法以及乙酸乙酯萃取法對樣品進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，樣品經(jīng)甲醇、乙腈沉淀后，使得待測成分稀釋而導致靈敏度降低；經(jīng)氮氣吹干后，管內(nèi)富集了血漿中的內(nèi)源性雜質(zhì)，這些雜質(zhì)進入儀器分析會造成較嚴重的基質(zhì)效應。而乙酸乙酯萃取法可以有效地將目標化合物從水相萃取到有機相中，并將大部分基質(zhì)組分（如磷脂、蛋白質(zhì)、無機鹽等）留在水相中，這樣提取出來的樣品更加干凈，進入儀器分析后峰形良好、基質(zhì)效應低、提取回收率高。因此，本研究最終選用乙酸乙酯萃取法對樣品進行前處理。

合適的給藥劑量、給藥時間和給藥方式是確保實驗結(jié)果準確可靠的前提。斑蝥酸鈉注射液采用連續(xù)給藥是考慮到臨床給藥的長期性，給藥時間過短可能會導致藥效發(fā)揮不夠完全，給藥時間過長則可能導致藥物在體內(nèi)產(chǎn)生蓄積，因此，綜合考慮采用連續(xù)給藥7 d 較為合適。斑蝥酸鈉注射液的給藥劑量按照人與大鼠標準體重等效劑量系數(shù)為6.10 進行換算[9]，得到大鼠給藥最小劑量為10.13 μg/kg，最大劑量為50.81 μg/kg，選取中等劑量進行給藥，最終確定斑蝥酸鈉注射液給藥劑量為25 μg/kg，即0.5 mL/kg。通過前期預實驗發(fā)現(xiàn)，卡培他濱灌胃和靜脈給藥劑量均為5 mg/kg時，進樣分析后，兩種給藥方式下不同時間點的血藥濃度均能被準確測定，且不受內(nèi)源性雜質(zhì)干擾，準確度高，偏差小。因此，最終確定給藥方案為腹腔注射斑蝥酸鈉注射液0.5 mL/kg，連續(xù)給藥7 d；第8 天給藥后，灌胃或靜脈給予卡培他濱5 mg/kg。

本研究探討了卡培他濱聯(lián)用斑蝥酸鈉后，卡培他濱在大鼠體內(nèi)的藥動學參數(shù)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，斑蝥酸鈉能增加卡培他濱在大鼠體內(nèi)的血漿暴露量，提高口服生物利用度，一定程度上提高了藥物的吸收；同時二者聯(lián)用后，能延長卡培他濱在大鼠體內(nèi)的平均滯留時間，降低清除率。由此筆者推測，臨床上二者聯(lián)用后可能會影響卡培他濱的療效及有效作用時間。