鄭暉暉，周龍玥，趙博欣，王春霞 （南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510080）

精神分裂癥是一種慢性精神障礙，屬于重性精神疾病，嚴重影響患者的正常生活。精神障礙的發(fā)病機制較為復(fù)雜，且病程較長，患者需要長期服藥控制病情[1]。然而長期服用抗精神病藥物，會導(dǎo)致患者出現(xiàn)糖脂代謝異常、體重增加、泌乳素異常升高等副作用，進而給患者帶來更大的危害[2]。

奧氮平（olanzapine，OLZ）是一種二苯丁基哌啶類藥物，該藥不僅對精神分裂癥有較好的治療效果，還能改善患者認知功能[3]。臨床實踐發(fā)現(xiàn)，服用OLZ后，患者的泌乳素水平在1～2 周內(nèi)迅速上升，并達到峰值，而長期服藥后泌乳素水平會逐漸穩(wěn)定甚至出現(xiàn)下降，但仍明顯高于正常值，最終導(dǎo)致高泌乳素血癥[4—5]。抑乳調(diào)經(jīng)顆粒（Yiru tiaojing granules，YRTJ）是南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院的院內(nèi)制劑（粵藥制字Z07022807），經(jīng)過近20年臨床研究證實，其治療高泌乳素血癥療效較好[6]。該方以張仲景《傷寒論》的芍藥甘草湯（白芍、甘草）為基礎(chǔ)，加用巴戟天和仙茅而成。方中巴戟天歸腎、肝二經(jīng)，可補腎壯陽，兼養(yǎng)精血，為君藥；仙茅補腎脾之陽，強肝健筋散寒，助巴戟天溫補腎肝，為臣藥；白芍入肝、脾二經(jīng)，甘草味甘性平、調(diào)和諸藥，兩者共為佐使藥。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，YRTJ可以治療由OLZ引起的高泌乳素血癥，但YRTJ 是否會影響OLZ 的藥動學(xué)過程尚不清楚。為此，本研究采用液相色譜-質(zhì)譜（liquid chromatographymass spectroscopy，LC-MS）技術(shù)測定了大鼠血漿中OLZ濃度，考察了YRTJ對OLZ在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響，旨在為臨床合理用藥提供依據(jù)。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括Agilent 1260 液相色譜-G6460 三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent 公司）、XW-80A 型旋渦混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）、Milli-Q 超純水純化系統(tǒng)（美國Millipore 公司）、5810R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）。

1.2 主要藥品與試劑

OLZ 對照品（批號O830525，純度≥98%）購自上海麥克林生化科技股份有限公司；奧氮平-d3 對照品（內(nèi)標，批號B71387，純度≥98%）購自上海源葉生物科技有限公司；YRTJ（批號20220413，規(guī)格10 g/袋）由南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院藥學(xué)部提供；肝素鈉溶液（批號M052787）購自北京邁瑞達科技有限公司。

1.3 動物

SD大鼠24只，雌性，6～8周齡，體重180～200 g，購自珠海百試通生物科技有限公司[動物質(zhì)量合格證明號：44822700014688；實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2020-0051]。所有大鼠于標準環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動物實驗符合南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院實驗動物倫理委員會的有關(guān)規(guī)定及要求（倫理證號：NFYY-2022-0316）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

以Agilent Poroshell EC-C18（50 mm×3.0 mm，2.7 μm）為色譜柱；以0.1%甲酸的乙腈溶液（A）-5 mmol/L甲酸銨溶液（B）為流動相進行梯度洗脫（0～0.5 min，95%B；0.5～1.7 min，50%B；1.7～2.5 min，5%B；2.5～5 min，95%B）；流速為0.5 mL/min；進樣量為5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件

采用電噴霧正離子源，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；毛細管電壓為4 000 V；噴霧氣壓力為40 psi；干燥氣體流速為10 L/min；干燥氣體溫度為340 ℃。用于定量分析的離子對（m/z）分別為313→256.1（OLZ）、316.1→87.2（內(nèi)標）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備

精密稱取OLZ 對照品2.5 mg，加入甲醇溶解，并定容至25 mL 容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的OLZ 溶液。取上述OLZ 溶液，加入甲醇稀釋，制成質(zhì)量濃度為500 μg/mL 的OLZ 儲備液；臨用時，用甲醇稀釋成所需質(zhì)量濃度的對照品溶液。

2.2.2 內(nèi)標溶液的制備

精密稱取內(nèi)標對照品2.5 mg，加入乙腈溶解，并定容至25 mL容量瓶中，制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 的內(nèi)標儲備液。取上述內(nèi)標儲備液，加入甲醇稀釋，制成質(zhì)量濃度為250 ng/mL的內(nèi)標溶液。

2.3 血漿樣品的處理

取血漿樣品50 μL，置于1.5 mL 的EP 管內(nèi)，加入“2.2.2”項下內(nèi)標溶液100 μL，快速旋渦振蕩1 min，以14 000 r/min離心15 min，取5 μL上清液進樣分析。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 專屬性考察

分別取不同來源的大鼠空白血漿、空白血漿+OLZ（質(zhì)量濃度為500 ng/mL）、大鼠單次給藥后1 h的血漿樣品各50 μL，分別按“2.3”項下方法處理（其中空白血漿不加內(nèi)標溶液），再按“2.1”項下條件進樣分析，記錄色譜圖。如圖1所示，OLZ及內(nèi)標在分析物保留時間處均無雜質(zhì)干擾，空白血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾OLZ及內(nèi)標的測定，表明本方法專屬性較好。

圖1 空白血漿、空白血漿+OLZ、大鼠給藥后血漿樣品的MRM色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系及定量下限考察

取大鼠空白血漿，加入“2.2.1”項下對照品溶液，制成OLZ 質(zhì)量濃度分別為5、50、150、300、500、750、1 000 ng/mL 的質(zhì)控樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積。以O(shè)LZ質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、OLZ 與內(nèi)標峰面積比值為縱坐標（y），采用加權(quán)最小二乘法作回歸分析。結(jié)果顯示，OLZ的回歸方程為y＝0.006x（R2＝0.993 2），表明OLZ在5～1 000 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。定量下限為5 ng/mL。

2.4.3 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率考察

將不同來源的大鼠空白血漿，按“2.3”項下方法處理后，加入“2.2.1”項下對照品溶液，制成低、中、高質(zhì)量濃度（10、500、750 ng/mL）的樣品，每個質(zhì)量濃度樣品平行制備6 份，再按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積為A。分別制備OLZ和內(nèi)標質(zhì)量濃度與前者一致的標準溶液，按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積為B。按“2.4.2”項下方法制備OLZ 質(zhì)量濃度與前者一致的質(zhì)控樣品，每個質(zhì)量濃度樣品平行制備6 份，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積為C。按以下公式計算基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率：基質(zhì)效應(yīng)（%）＝A/B×100%，提取回收率（%）＝C/A×100%。結(jié)果見表1。由表1 可知，低、中、高質(zhì)量濃度樣品的基質(zhì)效應(yīng)為70.56%～82.43%，RSD 不超過3.52%（n＝6）；OLZ 的平均提取回收率為86.71%～93.65%、RSD 不超過2.79%（n＝6），內(nèi)標的平均回收率為91.56%、RSD 為1.57%（n＝6），均符合生物樣品定量分析方法要求。

表1 基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率結(jié)果

2.4.4 精密度與準確度考察

按“2.4.3”項下方法制備OLZ 質(zhì)量濃度分別為5、10、500、750 ng/mL（定量下限及低、中、高質(zhì)量濃度）的質(zhì)控樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下條件進樣分析。每個分析批平行操作5 個樣品，連續(xù)操作3個分析批，再根據(jù)同批隨行回歸方程計算OLZ的實際質(zhì)量濃度，考察批內(nèi)、批間精密度。將實際質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度進行比較，以相對誤差（relative error，RE）考察準確度，結(jié)果見表2。由表2 可見，OLZ 的批內(nèi)、批間RSD 均不超過7.69%，RE 為-3.11%～3.05%，均符合生物樣品定量分析方法要求。

表2 精密度與準確度考察結(jié)果

2.4.5 穩(wěn)定性考察

按“2.4.3”項下方法制備OLZ 質(zhì)量濃度分別為10、500、750 ng/mL（低、中、高質(zhì)量濃度）的質(zhì)控樣品，每個質(zhì)量濃度樣品平行制備6份，考察室溫（25 ℃）放置8 h、凍融（-80 ℃～室溫）循環(huán)3 次、4 ℃冰箱中存放24 h、-80 ℃冷凍1個月的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，各樣品在上述條件下的RSD均不超過8.62%（n＝6），表明樣品穩(wěn)定性良好。

2.5 藥動學(xué)實驗

2.5.1 給藥劑量的確定

根據(jù)現(xiàn)有的研究及美國FDA藥量轉(zhuǎn)換原則，大鼠灌胃OLZ 劑量一般為2～20 mg/kg，但由于10 mg/kg 以上的劑量會使大鼠出現(xiàn)明顯的鎮(zhèn)靜效果，且根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果，故將大鼠灌胃OLZ 的劑量設(shè)定為5 mg/kg[7]。YRTJ 臨床使用中按每人每天2 次、每次1 袋、每袋10 g 計，參照FDA 藥量轉(zhuǎn)換原則及本課題組前期藥理毒理學(xué)研究結(jié)果，將大鼠灌胃YRTJ 的劑量設(shè)定為0.972 g/kg。

2.5.2 單劑量給藥實驗

將SD 大鼠隨機分為A 組和B 組，每組6 只，給藥前所有大鼠禁食12 h，自由飲水。A 組大鼠灌胃OLZ（5 mg/kg）；B 組大鼠先灌胃OLZ（5 mg/kg），1 min 后再灌胃YRTJ（0.972 g/kg）。分別在給藥前及給藥后5、15、30 min和1、2、3、6、8、12、24 h于大鼠眼眶靜脈叢采血約0.2 mL，置于肝素化的EP管中，于4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上層血漿，保存于-20 ℃冰箱中，待測。

2.5.3 多劑量給藥實驗

將SD大鼠隨機分為C組和D組，每組6只。C組大鼠灌胃OLZ（5 mg/kg）；D組大鼠先灌胃OLZ（5 mg/kg），1 min 后再灌胃YRTJ（0.972 g/kg）。兩組均每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d。其余操作同“2.5.2”，給藥后采血時間為末次給藥后。

2.5.4 數(shù)據(jù)處理

取不同時間點的血漿樣品，按“2.3”項下方法處理后，再按“2.1”項下條件進樣分析，記錄峰面積，根據(jù)隨行的回歸方程計算OLZ濃度。采用GraphPad Prism 9.0軟件進行數(shù)據(jù)分析并作圖，數(shù)據(jù)以±s表示，以獨立樣本t檢驗進行組間比較，檢驗水準α＝0.05。采用DAS 2.0軟件，選擇合適的數(shù)學(xué)模型擬合，計算藥動學(xué)參數(shù)。藥-時曲線見圖2，藥動學(xué)參數(shù)見表3。由表3 可知，在單劑量給藥中，與A 組比較，B 組大鼠24 h 內(nèi)的藥-時曲線下面積（area under the concentration-time curve within 24 h，AUC0-24h）、AUC0-∞、峰濃度（maximum concentration，cmax）均顯著降低（P＜0.05），24 h 內(nèi)的平均滯留時間（mean resident time within 24 h，MRT0-24h）、MRT0-∞、表觀清除率（apparent clearance，CLz/F）均顯著延長（P＜0.05）；在多劑量給藥中，C 組與D 組大鼠的藥動學(xué)參數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 大鼠體內(nèi)OLA的藥動學(xué)參數(shù)（n＝6）

圖2 各組大鼠的藥-時曲線圖（n＝6）

3 討論

人們在日常生活中通常會同時或先后序貫服用兩種及以上藥物。一方面是出于治療需要，另一方面是為了增加療效，減少藥物毒副作用。但是服用兩種及以上藥物容易引起藥物之間的相互作用，而導(dǎo)致其中一種或多種藥物的藥效或毒性發(fā)生改變[8]。其中，體內(nèi)藥動學(xué)的改變是最常見的原因，藥物之間通過影響其體內(nèi)的吸收、分布、代謝、排泄，從而導(dǎo)致血藥濃度發(fā)生改變，進而影響藥物療效，甚至產(chǎn)生毒副作用[9—10]。近年來，中西藥聯(lián)用已經(jīng)成為一種常見的疾病治療手段。合理的中西藥聯(lián)用可以增強藥物療效、減少藥物不良反應(yīng)，反之則會影響藥物療效。由于中藥成分復(fù)雜，可能存在多種相互反應(yīng)，從而影響化學(xué)藥的療效。因此，藥動學(xué)研究成為了探討中西藥相互作用的一個重要手段。

本研究初步探討了YRTJ對OLZ在大鼠體內(nèi)藥動學(xué)的影響，結(jié)果顯示，各組大鼠OLZ的tmax均小于2 h，這與文獻報道一致[11]。在單劑量給藥中，與單用OLZ 比較，OLZ 與YRTJ 聯(lián)用后OLZ 的AUC0-24h、AUC0-∞、cmax均顯著降低，MRT0-24h、MRT0-∞、CLz/F 均顯著延長，說明YRTJ 可能會降低OLZ 的吸收；但在多劑量給藥中，YRTJ對OLZ在大鼠體內(nèi)的藥動學(xué)參數(shù)無明顯影響。

單劑量給藥與多劑量給藥的藥動學(xué)參數(shù)結(jié)果存在差異，其原因可能是中藥含有多種成分。中藥復(fù)方制劑的化學(xué)成分復(fù)雜，在與其他化學(xué)藥聯(lián)用時，可能其中的有效單體成分會影響化學(xué)藥在體內(nèi)的吸收、分布、代謝和排泄。當(dāng)單劑量給藥時，YRTJ 對OLZ 的藥動學(xué)過程可能產(chǎn)生了直接作用，從而導(dǎo)致了較大的藥動學(xué)差異；而多劑量給藥時，YRTJ 對OLZ 的藥動學(xué)過程可能是一個長期多方面的調(diào)節(jié)，從而導(dǎo)致藥動學(xué)參數(shù)差異不大。

對于OLZ 來說，單次給藥的大鼠模型存在許多缺陷，一是僅單次給藥容易造成體內(nèi)血藥濃度的大幅度波動[12]；二是對于精神病患者來說，需要長期服用抗精神病藥物治療，單次給藥無法模擬臨床上的穩(wěn)態(tài)濃度[13]。以上結(jié)果提示，多劑量給藥更為合理。

綜上所述，單次聯(lián)用YRTJ 會抑制OLZ 在大鼠體內(nèi)的吸收，長期聯(lián)用YRTJ 對OLZ 的藥動學(xué)過程無明顯影響。