毛丙永,任寶靖,劉雪梅,張秋香,唐鑫,崔樹茂

(江南大學(xué) 食品學(xué)院,江蘇 無錫,214122)

益生菌是一類對宿主健康有益的活性微生物,當(dāng)攝入足夠量時會產(chǎn)生益處,如增強免疫、緩解腸胃不適、改善炎癥等[1]。益生菌主要是雙歧桿菌和乳桿菌屬中的一些種,已被證實其安全性并具有悠久的食用歷史[2]。近年來,隨著高通量測序和培養(yǎng)組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,一些分離自腸道的新型微生物受到廣泛關(guān)注,研究發(fā)現(xiàn)它們對宿主健康具有潛在益處,有望成為下一代益生菌,主要包括Akkermansiamuciniphila、Roseburiaintestinalis、Faecalibacteriumprausnitzii和Bacteroidesspp.[3-7]。

除了公認的下一代益生菌外,腸道內(nèi)還有一些特定種屬的腸道菌也與健康密切相關(guān)。我們前期調(diào)研發(fā)現(xiàn),腸道中布勞特氏屬(Blautia)的相對豐度與一些腸道炎癥、肥胖、糖尿病等的改善呈正相關(guān)[8-11],表明其在緩解炎癥性疾病和代謝性疾病方面可能發(fā)揮重要作用,也是潛在的腸道益生菌[12]。我們從腸道糞便中分離到了一株BlautiaproductaD4,發(fā)現(xiàn)其能改善脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的急性肝損傷[13],同時也能很好地改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥[14],表明B.productaD4具有較好的益生效果,是一株有潛力的腸道益生菌。

潛在益生菌在應(yīng)用之前,必須要對其進行安全性評估[15-16]。本研究分析了B.productaD4的毒力因子和抗生素耐藥基因,測定了菌株的溶血性和抗生素耐受性,并結(jié)合連續(xù)灌胃14 d 109和1010CFU菌株的體內(nèi)急性毒性實驗(包括小鼠體重、飲食飲水情況、血常規(guī)、肝功能指標(biāo)和各器官組織病理切片),綜合評估了此菌株的安全性,為后續(xù)開發(fā)使用此類功能性腸道菌奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

BlautiaproductaD4(以下簡稱為D4)菌株分離自健康小鼠糞便,保藏于江南大學(xué)食品微生物菌種保藏中心。金黃色葡萄球菌ATCC29213、副干酪乳桿菌ATCC334,購自美國模式菌種保藏中心。

7周齡的無特定病原體級(specific pathogen free,SPF)雌性和雄性C57BL/6J小鼠,購于南京大學(xué)模式動物研究所。

無菌脫脂纖維羊血,常德比克曼生物科技有限公司;環(huán)丙沙星,上海創(chuàng)賽科技有限公司;卡那霉素、鏈霉素、新霉素、四環(huán)素、紅霉素、克林霉素、氨芐青霉素、阿莫西林、甲氧嘧啶、氯霉素、利福平、萬古霉素、青霉素、多粘菌素,生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗菌株培養(yǎng)

取對數(shù)期活化3代菌株的細菌培養(yǎng)物,離心(8 000×g,4 ℃)20 min,用無菌磷酸鹽緩沖液清洗菌泥2次,然后于脫脂牛奶(100 g/L)中重懸并保存在-80 ℃冰箱備用。灌胃前取出凍存的菌液,待恢復(fù)至室溫后用平板計數(shù)法確定菌體濃度,調(diào)整至5×109CFU/mL和5×1010CFU/mL,動物實驗待用。

1.2.2 毒力基因和抗生素耐受基因概況

從-80 ℃取出凍存的菌液,恢復(fù)至室溫后接種2%至GAM液體培養(yǎng)基,于厭氧工作站培養(yǎng)24 h,得到第一代活化的菌株。按照同樣方法將菌株活化3代,最后一代接種至100 mL GAM液體培養(yǎng)基中,厭氧培養(yǎng)14 h后離心(8 000×g,10 min)收集菌泥,然后用無菌PBS洗滌菌泥,并轉(zhuǎn)移至5 mL EP管中,再次離心,棄上清液得到菌泥沉淀,冷鏈運輸寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進行菌株基因草圖測序。

將D4的氨基酸序列分別于毒力因子數(shù)據(jù)庫(Virulence Factor Database,VFDB,http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)和綜合抗生素抗性數(shù)據(jù)庫(Comprehensive Antibiotic Resistance Database,CARD,http://arpcard.mcmaster.ca/)進行比對,其中相似度(identity)>30%、覆蓋度(coverage)>70%及E值(E-value)<0.01的結(jié)果視為毒力基因和抗生素耐受基因。

1.2.3 溶血性測定

利用改良的GAM培養(yǎng)基(額外添加0.01%氯化血紅素、0.01%的維生素K1和5%無菌脫脂纖維羊血)測定D4的溶血性,實驗中陽性對照菌為金黃色葡萄球菌ATCC29213。取稀釋至10-6梯度的對數(shù)末期的菌液100 μL涂布于GAM平板,37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h,觀察菌株溶血情況。溶血活性分為β溶血(菌落周圍有界限分明且透明的溶血環(huán))、α溶血(菌落周圍有草綠色光環(huán))和γ溶血(菌落周圍無溶血環(huán))。

1.2.4 抗生素耐受性測定

根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)ISO10932—2010,采用微量肉湯微稀釋法測定13種不同抗菌機制的抗生素對菌株的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration,MIC)。具體方法如下:采用二倍數(shù)稀釋法,將每種抗生素制為終質(zhì)量濃度為0.032～2 048 μg/mL的溶液,加入100 μL至無菌96孔板中。剛進入對數(shù)末期的菌液用GAM培養(yǎng)基稀釋,使最終接種濃度為3×105CFU/mL。取100 μL稀釋后的菌液加至含抗生素溶液的96孔板中,于37 ℃厭氧工作站培養(yǎng)24 h,用酶標(biāo)儀讀取OD625吸光值,將抑制90%菌株生長的抗生素濃度稱為MIC。副干酪乳桿菌ATCC334作為本次實驗的質(zhì)控菌株。

參照歐洲食品安全局(European Food Safety Authority,EFSA)標(biāo)準(zhǔn)指南和歐盟委員會(European Commission,EUC)動物營養(yǎng)科學(xué)委員會(Scientific Committee on Animal Nutrition,SCAN)的建議,用斷點值來判斷菌株對抗生素的耐受性,當(dāng)MIC值≤斷點值時,認為菌株對抗生素敏感。實驗重復(fù)3次用于結(jié)果統(tǒng)計。

1.2.5 小鼠體內(nèi)急性毒性實驗

1.2.5.1 動物實驗設(shè)計

30只SPF級健康雌、雄C57BL/6J小鼠(7周齡,體重約20 g)飼養(yǎng)于江南大學(xué)實驗動物中心SPF級屏障中,溫度為(25±2) ℃,相對濕度40%～60%,嚴格遵循光照12 h/黑夜12 h循環(huán),所有動物均喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料和無菌水,并可自由攝食和飲水,適應(yīng)1周后開始實驗。

30只小鼠分為6組,雌雄各3組,每組5只,分別是空白組、D4菌株109組、D4菌株1010組?？瞻捉M灌胃脫脂牛奶(100 g/L),其余組別灌胃相應(yīng)菌株的活菌懸液,實驗持續(xù)14 d,每天灌胃時間一致。本實驗方案經(jīng)江南大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(JN.No20200630c0300815[125]),且符合2010/63/EU歐盟保護實驗動物條例。在整個實驗過程中,觀察小鼠的精神狀態(tài)、行為并記錄小鼠體重和攝食飲水量。實驗結(jié)束處死小鼠,收集血液和組織進行后續(xù)檢測。詳細實驗設(shè)計如表1所示。

表1 動物實驗設(shè)計Table 1 Animal experimental design

1.2.5.2 臟器指數(shù)測定

小鼠處死后,稱取心臟、肝、肺、腎、脾和結(jié)腸的質(zhì)量,并確定臟器指數(shù),計算如公式(1)所示:

1.2.5.3 血常規(guī)及生化指標(biāo)測定

處死小鼠后,取新鮮的全血裝于含肝素的抗凝管中,在0.5 h內(nèi)用全自動血液細胞分析儀測定小鼠白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜堿性粒細胞、紅細胞以及血紅蛋白濃度等血常規(guī)項目。

取小鼠血清,用全自動生化分析儀和相關(guān)的試劑測定葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯等基本生化指標(biāo)以及肝功能相關(guān)的丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、總蛋白和白蛋白等指標(biāo)。

1.2.5.4 小鼠臟器形態(tài)學(xué)觀察

小鼠處死后收集小塊肝臟、腎臟、脾臟和結(jié)腸,置于4%多聚甲醛固定液中,過夜浸泡后經(jīng)脫水透明、浸蠟包埋于切片機上制成5 μm厚的切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色后,使用切片掃描儀對組織的形態(tài)進行掃描和拍照。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有結(jié)果均以各組的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,采用Origin 2017以及Adobe photoshop CS6進行圖像處理。SPSS 22.0用于數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)檢驗,采用單因素方差(One-Way ANOVA)或獨立樣本t檢驗進行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 B.producta D4的毒力基因分析

來源于微生物并引起宿主產(chǎn)生特定疾病的物質(zhì)被稱為毒力因子,可作為評價菌株是否安全的重要指標(biāo)[17]。基于VFDB數(shù)據(jù)庫對D4中的毒力基因進行鑒定,結(jié)果如表2所示。存在于D4中的毒力基因類別豐富,不同種類的毒力基因調(diào)控著不同的功能。PhoP-PhoQ是細菌中重要的雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)之一,其中phoP作為反應(yīng)調(diào)節(jié)劑,可以幫助細菌提高對外環(huán)境的適應(yīng)性[18]。RelA、FbpABC、FeoAB、HitABC等和鐵離子攝取有關(guān),均不具備致病能力。FbpA、Hsp60、Hyaluronicacidcapsule、PI-2a、LPS、Lap等與黏附有關(guān),而Dot/Icm和HSI-I和分泌系統(tǒng)有關(guān)。同時,D4中還鑒定出與防御相關(guān)的毒力基因,主要有負責(zé)抗吞噬作用的alginate、capsule和capsuleI[19]以及與應(yīng)激蛋白相關(guān)的clpC、clpP、katA、msrAB。

表2 B.producta D4鑒定的毒力基因Table 2 Virulence genes identified in B.producta D4

2.2 B.producta D4的抗生素耐受性評價

近年來,抗生素耐藥性的增加對全球健康產(chǎn)生了巨大影響。EFSA指南指出,對于擬供食用的細菌菌株需要進行抗生素敏感性測定,以證明其安全性[20]。不同抗生素對B.productaD4和副干酪乳桿菌ATCC 334的MIC測定結(jié)果如表3所示,四環(huán)素、阿莫西林和氨芐青霉素對D4的MIC較小,分別是0.125、0.5、1 μg/mL;鏈霉素、甲氧芐啶和環(huán)丙沙星對D4的MIC一致,均為32 μg/mL;卡那霉素對D4的MIC最大,為256 μg/mL。結(jié)合斷點值可以看出,D4對鏈霉素、新霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素、阿莫西林、甲氧芐啶、氯霉素、利福平和萬古霉素敏感,對卡那霉素、紅霉素、克林霉素和環(huán)丙沙星表現(xiàn)出耐藥性。

表3 不同抗生素對B.producta D4的最低抑制濃度Table 3 The MIC of different antibiotics on B.producta D4

由CARD注釋結(jié)果可知(表4),D4具有大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類、氨基糖苷類、糖肽類、四環(huán)素類和肽類抗生素的相關(guān)耐藥基因(表4)。結(jié)合MIC測定結(jié)果,D4對環(huán)丙沙星(氟喹諾酮類抗生素)具有耐藥性,其耐藥機制為抗生素外排[21];D4對卡那霉素(氨基糖苷類抗生素)具有耐藥性,被認為是乳酸菌的內(nèi)在特性,菌株會產(chǎn)生多種酶來降解抗生素,使其失活[22],基因分析與表型結(jié)果一致。此外,D4基因中鑒定出萬古霉素耐受相關(guān)基因(如vanHA、vanHB、vanRN、vanSA和vanTG,),但與表型結(jié)果相反。

表4 B.producta D4中的抗生素耐藥基因Table 4 Genes related to antibiotic resistance in B.producta D4

2.3 B.producta D4的溶血性

微生物的溶血性表明其具有潛在的致病能力,根據(jù)FAO/WHO安全評估指南,溶血性可以作為評價益生菌安全性的重要證據(jù)[23]。如圖1所示,陽性對照金黃色葡萄球菌ATCC29213菌株周圍有界限分明的金黃色溶血環(huán),表現(xiàn)出明顯的溶血現(xiàn)象。當(dāng)把D4涂布在含有5%(體積分數(shù))綿羊血的平板上37 ℃厭氧孵育48 h后,菌落呈現(xiàn)圓型,灰白色,表面光滑,沒有觀察到溶血現(xiàn)象(γ-溶血),表明D4是安全的。

a-Blautia producta D4;b-Staphylococcus aureus ATCC29213圖1 B.producta D4的溶血性Fig.1 Hemolysis of B.producta D4

2.4 B.producta D4對小鼠體內(nèi)急性毒性實驗分析

2.4.1B.productaD4對小鼠體重、攝食和飲水量的影響

實驗期間,小鼠精神狀態(tài)正常,未出現(xiàn)脫毛、腹瀉和死亡現(xiàn)象。每2 d記錄1次小鼠的體重、攝食量和飲水量,監(jiān)測小鼠生長情況。由圖2可知,所有組別的小鼠體重均呈上升趨勢,灌胃D4組與空白組小鼠無顯著性差異。雌、雄小鼠每日攝食量在3 g左右,飲水量在5 g左右,不同處理組之間無顯著差異,說明D4菌株干預(yù)不會對小鼠產(chǎn)生不利影響。

a-雌性小鼠體重;b-雄性小鼠體重;c-攝食量;d-飲水量圖2 不同組別小鼠體重、飲水量和攝食量Fig.2 Body weight, water intake, and food intake of mice in different groups

2.4.2B.productaD4對小鼠器官指數(shù)的影響

器官指數(shù)是評估外源性有毒物質(zhì)對動物健康狀況的一個可靠指標(biāo),通常情況下,各器官與體重的比例相對穩(wěn)定,但如果相應(yīng)器官受損,器官指數(shù)也會發(fā)生變化。實驗結(jié)束后處死小鼠并解剖,取出心臟、肝臟、腎臟、脾臟、肺、結(jié)腸進行稱重。如圖3所示,與空白組相比,灌胃109及1010CFU的D4處理組未顯示出與空白組之間的顯著性差異。

a-雄性小鼠;b-雌性小鼠圖3 不同組別小鼠器官指數(shù)Fig.3 Organ index of mice in different groups

2.4.3B.productaD4對小鼠血常規(guī)的影響

對小鼠的血常規(guī)項目進行檢測,結(jié)果表明(表5),無論雌雄,灌胃不同劑量的D4與空白組小鼠血液指標(biāo)無顯著性差異。研究表明,血細胞的數(shù)量和比例在許多疾病中可作為慢性炎癥標(biāo)志物和預(yù)后的重要指標(biāo),可反映機體的健康狀況[24]。紅細胞、白細胞和血小板可在一定程度上反映宿主生理病理狀態(tài)[25],實驗結(jié)果顯示D4處理后小鼠血液指標(biāo)無異常,證明灌胃109和1010CFU的D4對小鼠健康狀況無毒副影響。

表5 B.producta D4對雄性和雌性小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響Table 5 The effects of B.producta D4 on hematological parameters of male and female mice

2.4.4B.productaD4對小鼠血清生化指標(biāo)的影響

為探究109和1010CFU兩種劑量的D4在灌胃期間是否會引起小鼠潛在的全身毒性,檢測了小鼠血清甘油三酯(triglyceride, TG)、總膽固醇(total cholesterol, TC)、空腹血糖(glucose, Glu),以及肝功能相關(guān)指標(biāo)谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine transaminase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate transaminase, AST)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、血清白蛋白(serum albumin, ALB)、肌酸激酶(creatine kinase, CK)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)等指標(biāo)(圖4)。TC和TG的升高是脂質(zhì)代謝異常的表現(xiàn),可能伴隨著脂肪肝和心血管疾病的發(fā)生,對宿主健康構(gòu)成潛在威脅[26]。與空白組相比,D4處理后小鼠血清TC和TG無顯著差異,表明D4不會影響小鼠的脂質(zhì)和碳水化合物代謝。血清中ALT被認為是細胞和肝臟損傷的初期跡象,肝臟的任何損害都會導(dǎo)致該指標(biāo)的升高。相比于空白組,109CFU和1010CFU的D4組肝功能相關(guān)指標(biāo)正常,與正常小鼠組無顯著差異。

a-TC;b-TG;c-Glu;d-ALT;e-AST;f-ALP;g-ALB;h-CK;i-LDH圖4 B.producta D4對小鼠生化指標(biāo)的影響Fig.4 The effect of B.producta D4 on the biochemical parameters of mice

2.4.5B.productaD4對小鼠器官組織形態(tài)的影響

肝臟作為負責(zé)新陳代謝的主要器官,可以反映機體的健康狀況;脾臟作為人體最大的免疫器官,參與體液和細胞的免疫反應(yīng);腸黏膜在防止?jié)撛诓≡w和毒素等物質(zhì)入侵方面起著重要作用?？瞻捉M和D4菌株處理組的小鼠各臟器形態(tài),由圖5可知,所有組別的肝組織結(jié)構(gòu)清晰,肝竇和肝索排列整齊,未觀察到明顯的肝細胞變性,凋亡或壞死。腎臟細胞排列整齊,結(jié)構(gòu)完整,細胞核清晰,胞質(zhì)染色均勻;空白組和不同處理組的脾臟組織清晰,紅髓和白髓結(jié)構(gòu)完整且輪廓分明,脾索和鼻竇整齊排列。另外所有組別的小鼠結(jié)腸形態(tài)良好,隱窩結(jié)構(gòu)完整,富含杯狀細胞。

總體而言,灌胃109CFU和1010CFU的D4未對小鼠臟器造成明顯的組織病理學(xué)損害,表明D4是安全的,與我們之前研究的B.productaDSM2950是類似的[27]。

3 結(jié)論

本文通過對B.productaD4開展基因?qū)用娣治?鑒定毒力因子、抗生素耐受基因)、表型實驗(測定溶血性和抗生素耐受性)及體內(nèi)急性毒性實驗(測定小鼠體重、攝食飲水量、器官指數(shù)、血常規(guī)、血清肝功能相關(guān)生化指標(biāo)及器官組織病理結(jié)果),綜合評價該菌株的安全性,主要結(jié)論如下:

在基因?qū)用娣治鲋锌芍?D4的毒力基因大部分與鐵離子攝取和調(diào)控有關(guān),不具備致病能力,同時鑒定出8種不同類別的抗生素耐受基因;D4在血瓊脂平板上無溶血現(xiàn)象,對鏈霉素、新霉素、四環(huán)素、氨芐青霉素、阿莫西林、甲氧芐啶、氯霉素、利福平和萬古霉素敏感,對卡那霉素、紅霉素、克林霉素和環(huán)丙沙星表現(xiàn)出耐藥性;體內(nèi)急性毒性實驗結(jié)果表明,連續(xù)灌胃14 d 109CFU和1010CFU的D4菌株對小鼠的體重、攝食、飲水情況、器官指數(shù)均無影響,血常規(guī)指標(biāo)、代謝和肝功能相關(guān)的指標(biāo)與空白組無顯著性差異,D4處理組的臟器形態(tài)組織正常、無病變。由此可見,B.productaD4對小鼠健康無毒副作用,初步表明B.productaD4是安全的。未來,還需要進一步研究D4的其他安全特性,為功能性腸道菌的開發(fā)與利用提供更全面的理論依據(jù)和支撐。