施盛超,劉志豪,王永紅

(華東理工大學(xué),生物反應(yīng)器工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海,200237)

乳酸分子結(jié)構(gòu)相對(duì)簡(jiǎn)單,是一種極其重要的生物基化學(xué)品,在食品行業(yè),化妝品,醫(yī)藥以及化工等傳統(tǒng)行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用[1],由其合成的聚乳酸在新材料行業(yè)也具有重要的應(yīng)用價(jià)值[2]。目前乳酸的生產(chǎn)以微生物發(fā)酵為主[3],擬干酪乳桿菌是具有良好乳酸生產(chǎn)能力的工業(yè)乳酸菌,能夠在高濃度葡萄糖條件下高效生產(chǎn)L-乳酸[4-5],具有廣闊的應(yīng)用前景。

然而,目前對(duì)于擬干酪乳桿菌的培養(yǎng)主要使用復(fù)合培養(yǎng)基或成分比較復(fù)雜的合成培養(yǎng)基[6-7],培養(yǎng)基的復(fù)雜性對(duì)擬干酪乳桿菌生理特性及其代謝調(diào)控的研究增加了困難。在全合成培養(yǎng)基中氨基酸類和維生素類是種類比較多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),對(duì)菌體的生長(zhǎng)和代謝具有重要作用。氨基酸對(duì)于微生物的作用除了是蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)組成單位外,還能在微生物生長(zhǎng)過(guò)程中提供生長(zhǎng)所需的能量,促進(jìn)微生物能量代謝,更是很多生物體內(nèi)非常重要的含氮化合物合成前體[8-10]。維生素是細(xì)胞多種酶的輔酶,參與維持和調(diào)節(jié)細(xì)胞的生理代謝[11]。因此更加合理的添加這些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),對(duì)于優(yōu)化菌體生長(zhǎng),提高乳酸產(chǎn)量具有重要意義。

本研究旨在基于已有的乳酸發(fā)酵全合成培養(yǎng)基,通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基中各種氨基酸以及維生素對(duì)擬干酪乳桿菌代謝影響的研究,在保持至少不低于原全合成培養(yǎng)基的底物利用率以及乳酸產(chǎn)率的前提下,盡可能減少培養(yǎng)基組分,提高合成乳酸效率,為今后該菌株的代謝通量定量分析和代謝工程研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

擬干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件

擬干酪乳桿菌經(jīng)一級(jí)與二級(jí)斜面培養(yǎng)基活化[12],用50 mL超純水重懸二級(jí)斜面菌體,將15 mL菌懸液轉(zhuǎn)接至裝有85 mL MRS培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中作為種子瓶[13]。以20%的接種量接種于全合成培養(yǎng)基[14]。搖瓶培養(yǎng)的條件為溫度37 ℃,轉(zhuǎn)速130 r/min,培養(yǎng)48 h。2.5 L發(fā)酵罐的培養(yǎng)條件為發(fā)酵體積1.5 L,攪拌轉(zhuǎn)速150 r/min,溫度37 ℃,pH值維持在6.0左右,發(fā)酵周期為48 h。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 菌體光密度

在Spectrumlab 22 PC分光光度計(jì)620 nm下測(cè)定吸光值(OD值)。

1.3.2 葡萄糖濃度

采用葡萄糖氧化酶法試劑盒進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 乳酸濃度

采用Agilent高效液相色譜檢測(cè),色譜柱為Hi-Plex H (300 mm×7.7 mm);檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm;流動(dòng)相為0.01 mol/L硫酸;流速為0.4 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL;柱溫為50 ℃。

1.4 合成培養(yǎng)基優(yōu)化方法

1.4.1 單一缺失實(shí)驗(yàn)

對(duì)全合成培養(yǎng)基中氨基酸和維生素進(jìn)行單一缺失搖瓶實(shí)驗(yàn),確定對(duì)菌體生長(zhǎng)和乳酸產(chǎn)量有顯著影響的組分。

1.4.2 單組分濃度梯度實(shí)驗(yàn)

對(duì)該組分的添加量設(shè)置為初始濃度的倍數(shù),0、0.5、1、2、4倍,其余組分濃度保持不變。

1.4.3 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

該方法在單組分濃度梯度實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,對(duì)每個(gè)因素取高(1)、低(-1)2種水平,以考察每種因素的影響水平及影響的顯著性,以期從眾多影響因素中篩選出顯著影響乳酸生產(chǎn)的因素。

1.4.4 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)篩選出顯著影響合成乳酸的因素,結(jié)合各因素效應(yīng)的正負(fù),設(shè)置合適的步長(zhǎng)和爬坡方向,進(jìn)而有效地確定各因素具有最大響應(yīng)值的濃度范圍。

1.4.5 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)

采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法,每個(gè)因素取3個(gè)水平:-1,0,1。建立多元回歸方程并計(jì)算出各因素的最佳濃度值。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)均通過(guò)Design Expert 8.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)L-乳酸的合成培養(yǎng)基中氨基酸的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)在全合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上對(duì)20種氨基酸進(jìn)行單一缺失實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、酪氨酸、賴氨酸、丙氨酸單一缺失后的菌體生長(zhǎng)和乳酸產(chǎn)量降低最多(圖1)。對(duì)這8種氨基酸進(jìn)行單組分濃度梯度實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示(圖2)隨著氨基酸濃度的增加,其對(duì)菌體的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸存在不同程度的影響,不同氨基酸的結(jié)果也存在顯著差異。半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺的濃度變化對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸有明顯的促進(jìn)作用,但高濃度的氨基酸導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)過(guò)盛,從而使乳酸生成受到影響。天冬氨酸、天冬酰胺的濃度變化對(duì)菌體生長(zhǎng)有一定影響,當(dāng)濃度大于1倍時(shí),菌體生物量無(wú)變化,但與乳酸產(chǎn)量呈正相關(guān)。酪氨酸、賴氨酸濃度變化對(duì)菌體生長(zhǎng)影響較小,濃度在1倍以下時(shí),對(duì)乳酸生成有促進(jìn)作用。丙氨酸濃度變化對(duì)菌體生長(zhǎng)影響較小,低濃度的丙氨酸促進(jìn)產(chǎn)酸,高濃度的丙氨酸抑制產(chǎn)酸。另外,從氨基酸濃度梯度實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)可以看出天冬氨酸和天冬酰胺對(duì)于菌體生長(zhǎng)和乳酸產(chǎn)量的影響作用相類似,考慮到微生物中廣泛存在天冬酰胺酶,可將天冬酰胺轉(zhuǎn)換成天冬氨酸[15],因此將天冬酰胺替換為相同濃度的天冬氨酸,其搖瓶實(shí)驗(yàn)的菌體生長(zhǎng)、乳酸生成以及糖耗情況與替換前基本一致,谷氨酸與谷氨酰胺之間也同樣存在轉(zhuǎn)換作用[16],實(shí)驗(yàn)結(jié)果也相似,故選擇將谷氨酰胺替換成谷氨酸。因此最終確定半胱氨酸、酪氨酸、賴氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸作為合成培養(yǎng)基中對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)酸有重要作用的氨基酸。

a-單一氨基酸缺失對(duì)生長(zhǎng)的影響;b-單一氨基酸缺失對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響圖1 單一氨基酸缺失對(duì)菌體生長(zhǎng)和乳酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of single omission of amino acid on growth and lactic acid production

a-半胱氨酸;b-谷氨酸;c-谷氨酰胺;d-天冬氨酸;e-天冬酰胺;f-酪氨酸;g-賴氨酸;h-丙氨酸圖2 不同濃度梯度氨基酸對(duì)菌體生長(zhǎng)和乳酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different concentrations of amino acid on growth and lactic acid production

2.2 產(chǎn)L-乳酸的合成培養(yǎng)基中維生素的優(yōu)化

維生素的單一缺失實(shí)驗(yàn)同氨基酸,發(fā)現(xiàn)生物素、硫胺素、核黃素、煙酸、吡哆醇單一缺失后的菌體生長(zhǎng)和乳酸產(chǎn)量降低最多(圖3)。對(duì)這5種維生素進(jìn)行單組分濃度梯度實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示(圖4)不同的維生素隨著濃度的增加對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸存在不同的影響。其中菌體生物量與生物素和硫胺素的濃度呈正相關(guān),生物素的效果更加明顯,乳酸濃度也隨著與生物素、硫胺素的濃度增加而增加,但增加到原2倍濃度之后,乳酸濃度增加趨勢(shì)漸緩,生物素和硫胺素是微生物體內(nèi)多種酶系統(tǒng)的輔酶,對(duì)糖酵解途徑中多種酶的活性有促進(jìn)作用,能夠調(diào)節(jié)糖代謝,促進(jìn)菌體生長(zhǎng),加快丙酮酸和乳酸的合成,在生物體的碳代謝循環(huán)中起到了至關(guān)重要的作用[17-18]。核黃素、煙酸、吡哆醇的濃度變化對(duì)菌體生長(zhǎng)沒(méi)有影響,但是對(duì)產(chǎn)酸合成有一定促進(jìn)作用,吡哆醇的濃度在0.5倍時(shí),產(chǎn)酸量達(dá)到最大,煙酸及核黃素濃度達(dá)到1倍后,乳酸增長(zhǎng)乏力,尤其是高濃度煙酸抑制了產(chǎn)酸,產(chǎn)酸量出現(xiàn)了較大的下降。核黃素是細(xì)胞黃酶類輔基的組成成分,在細(xì)胞的氧化還原反應(yīng)中具有重要作用[19],煙酸是NAD+和NADH的關(guān)鍵前體物質(zhì),NADH作為乳酸脫氫酶的輔酶參與反應(yīng)[20],因此核黃素和煙酸對(duì)于乳酸的生成具有重要的調(diào)節(jié)作用[21]。吡哆醇在生物體內(nèi)可轉(zhuǎn)變?yōu)檫炼呷?與氨基酸的代謝密切相關(guān)[22],間接參與乳酸的代謝調(diào)控。因此最終確定生物素、硫胺素、煙酸對(duì)生長(zhǎng)和產(chǎn)酸有重要作用。

a-單一維生素缺失對(duì)生長(zhǎng)的影響;b-單一維生素缺失對(duì)乳酸產(chǎn)量的影響圖3 單一維生素缺失對(duì)菌體生長(zhǎng)和乳酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of single omission of vitamin on growth and lactic acid production

a-生物素;b-硫胺素;c-核黃素;d-煙酸;e-吡哆醇圖4 不同濃度梯度維生素對(duì)菌體生長(zhǎng)和乳酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of vitamin on growth and lactic acid production

2.3 響應(yīng)面分析優(yōu)化合成培養(yǎng)基

在對(duì)6種氨基酸和3種維生素的單組分濃度梯度進(jìn)行考察基礎(chǔ)上,進(jìn)而通過(guò)響應(yīng)面分析,建立乳酸生成與影響因素間的回歸關(guān)系,并最終獲得產(chǎn)酸穩(wěn)定、高效的合成培養(yǎng)基配方。首先通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)分別以原濃度和原0.5倍濃度作為1和-1水平的值,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平及結(jié)果見(jiàn)表1,通過(guò)顯著性分析(表2)發(fā)現(xiàn),因素A(生物素)、H(谷氨酸)、J(天冬氨酸)對(duì)乳酸的生成有極顯著的影響,且均為正效應(yīng),得到線性回歸方程為:Y=34.69+5.38A+1.82H+1.68J,R2=0.938 1,因此確定生物素、谷氨酸、天冬氨酸作為下一步研究的影響因素。

表1 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 1 Plackett-Burman experiment design and results

表2 偏回歸系數(shù)及影響因子的顯著性分析Table 2 Significance analysis of partial regression coefficients and factors

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果設(shè)計(jì)生物素、谷氨酸、天冬氨酸的最陡爬坡路徑,由于生物素、谷氨酸、天冬氨酸均為極顯著正效應(yīng),所以都要沿濃度增大的方向爬坡。結(jié)果如表3所示,隨著這3個(gè)因素濃度的增加,乳酸產(chǎn)量呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì),并以第4組實(shí)驗(yàn)濃度值作為最陡爬坡實(shí)驗(yàn)的中心濃度。

表3 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 單位:g/LTable 3 Design and results of the steepest climbing experiment

根據(jù)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)確定的3個(gè)影響因素的中心濃度,對(duì)其進(jìn)行3因素、3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn),分別以第2、4、6組的條件作為-1、0、1水平的值,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 Box-Behnken設(shè)計(jì)表及實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiment

通過(guò)響應(yīng)面的結(jié)果進(jìn)而獲得乳酸濃度對(duì)生物素、谷氨酸和天冬氨酸的多元二次回歸方程為:Y=63.8+1.31a+0.77b-0.40c+0.23ab-0.025ac-0.87bc-2.74a2-3.49b2-3.19c2,R2=0.970 2,如表5所示,模型的P值小于0.05,失擬項(xiàng)大于0.05,說(shuō)明模型顯著,擬合度較好。由表6回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)可知,因素a、b、a2、b2對(duì)乳酸生成的影響極顯著(P<0.01),因素c2對(duì)乳酸生成的影響顯著(P<0.05),其他因素對(duì)乳酸生成的影響不顯著。

表5 回歸模型的方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

表6 二次模型回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)Table 6 Significance test for regression coefficients of quadratic model

對(duì)二次回歸方程求最值后換算可得生物素0.016 g/L,谷氨酸1.128 g/L,天冬氨酸1.120 g/L,在該濃度條件下模型預(yù)測(cè)的乳酸質(zhì)量濃度為64.3 g/L,3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的平均乳酸質(zhì)量濃度為64.1 g/L,與模型的預(yù)測(cè)值基本一致,說(shuō)明模型對(duì)乳酸生成擬合效果較好。通過(guò)以上單組分濃度梯度實(shí)驗(yàn)以及響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)最終確定優(yōu)化后合成培養(yǎng)基中的氨基酸和維生素質(zhì)量濃度(g/L)分別為半胱氨酸0.375,酪氨酸0.125,賴氨酸0.3,丙氨酸0.125,天冬氨酸1.120,谷氨酸1.128,硫胺素0.007 5,煙酸0.007 5,核黃素0.007 5,吡哆醇0.007 5,生物素0.016。

2.4 合成培養(yǎng)基優(yōu)化前后的搖瓶和2.5 L罐發(fā)酵水平比較

合成培養(yǎng)基優(yōu)化前后搖瓶發(fā)酵結(jié)果如圖5所示,在初始葡萄糖質(zhì)量濃度為80 g/L的條件下,菌體生長(zhǎng)在前期并沒(méi)有太大變化,12 h之后,優(yōu)化后的菌體生長(zhǎng)速度明顯加快,最終OD值為14.5,高于對(duì)照的OD值13.2。乳酸產(chǎn)率在前期略有增長(zhǎng),發(fā)酵至12 h后,乳酸產(chǎn)量和產(chǎn)率出現(xiàn)了較大幅度的增長(zhǎng),發(fā)酵至48 h時(shí)乳酸產(chǎn)量從54.8 g/L增加到64.2 g/L,產(chǎn)率從1.04 g/(L·h)增加到1.25 g/(L·h),糖酸轉(zhuǎn)化率從81.9%增加到93.8%。

a-OD值隨培養(yǎng)時(shí)間的變化;b-乳酸產(chǎn)量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化;c-葡萄糖濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的變化圖5 合成培養(yǎng)基優(yōu)化前后搖瓶發(fā)酵過(guò)程特性變化Fig.5 Profiles of fermentation process with original and optimized chemical defined medium in shake flasks

在初始葡萄糖質(zhì)量濃度為200 g/L的條件下,用2.5 L發(fā)酵罐比較培養(yǎng)基優(yōu)化前后的乳酸發(fā)酵情況(圖6),與250 mL搖瓶發(fā)酵不同的是,2.5 L罐OD值在24～28 h的時(shí)候達(dá)到最大值,在這之后OD值平穩(wěn)中略有下降,優(yōu)化前的OD值在24 h達(dá)到最大,為11.5,優(yōu)化后OD值在28 h達(dá)到最大,為12.7,優(yōu)化后比優(yōu)化前提高了10.4%。發(fā)酵至12 h后,乳酸生產(chǎn)開(kāi)始明顯增加,發(fā)酵至48 h時(shí),乳酸產(chǎn)量從140.2 g/L 增加到165.5 g/L,增長(zhǎng)幅度18%,產(chǎn)率從2.83 g/(L·h)增加到3.35 g/(L·h),糖酸轉(zhuǎn)化率從82.4%增加到97.6%,較搖瓶水平進(jìn)一步提高。

a-OD值隨培養(yǎng)時(shí)間的變化;b-乳酸產(chǎn)量隨培養(yǎng)時(shí)間的變化;c-葡萄糖濃度隨培養(yǎng)時(shí)間的變化圖6 合成培養(yǎng)基優(yōu)化前后2.5 L反應(yīng)器發(fā)酵過(guò)程特性變化Fig.6 Profiles of fermentation process with original and optimized chemical defined medium in 2.5 L bioreactor

3 結(jié)論與討論

本文優(yōu)化了擬干酪乳桿菌乳酸發(fā)酵合成培養(yǎng)基成分中的氨基酸和維生素組分及濃度。利用單一缺失實(shí)驗(yàn)確定了待優(yōu)化的組分為8種氨基酸和5種維生素,而部分氨基酸和維生素的缺失并不會(huì)對(duì)菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸造成影響,說(shuō)明這些組分并不是生長(zhǎng)和代謝限制因素,或者本身可以合成相關(guān)組分滿足菌體生長(zhǎng)和產(chǎn)酸需求,因此無(wú)需從外界環(huán)境中獲取。根據(jù)濃度梯度實(shí)驗(yàn)并通過(guò)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)確定了顯著影響因素為生物素、谷氨酸、天冬氨酸,運(yùn)用響應(yīng)面分析方法確定了三者質(zhì)量濃度分別為0.016、1.128、1.120 g/L。使用優(yōu)化后的合成培養(yǎng)基進(jìn)行擬干酪乳桿菌乳酸發(fā)酵,其最終乳酸濃度無(wú)論是在搖瓶還是在2.5 L發(fā)酵罐中都要顯著高于優(yōu)化前,在80 g/L葡萄糖的搖瓶中乳酸質(zhì)量濃度達(dá)到64.3 g/L,在200 g/L葡萄糖的2.5 L發(fā)酵罐中乳酸質(zhì)量濃度達(dá)到了165.5 g/L,糖酸轉(zhuǎn)化率分別提高至93.8%和97.6%,在大幅減少氨基酸和維生素種類的情況下,取得了更好的發(fā)酵效果。

優(yōu)化后的培養(yǎng)基中生物素、谷氨酸、天冬氨酸的添加量提高,說(shuō)明這3種物質(zhì)對(duì)乳酸的生成有重要作用。其中谷氨酸和天冬氨酸是三羧酸循環(huán)的重要參與者[23],二者添加量的提高使得在減少碳源流向三羧酸循環(huán)的情況下仍能保持三羧酸循環(huán)的流量,加上生物素促進(jìn)糖酵解途徑的作用,從而使得更多的碳源流向了乳酸生成。此外,由于代謝流實(shí)驗(yàn)需要對(duì)胞內(nèi)外的氨基酸成分進(jìn)行定量檢測(cè),而胞外氨基酸組分的減少排除了不必要氨基酸的檢測(cè)干擾,也為更有效的計(jì)算代謝流提供了極大便利,因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)擬干酪乳桿菌代謝流定量研究奠定了良好基礎(chǔ)。