王越,林洪,王靜雪

(中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島,266000)

空腸彎曲菌(Campylobacterjejuni)是一種革蘭氏陰性微需氧細(xì)菌,屬于彎曲菌屬,是一種典型的食源性人畜共患病原菌,被認(rèn)為是引發(fā)細(xì)菌性急性腹瀉的主要原因[1]。世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì),空腸彎曲菌每年在全球造成3.7萬多人死亡,與空腸彎曲菌相關(guān)的食物中毒病例在持續(xù)上升[2]。除了引發(fā)腸胃炎,對(duì)于免疫力低下的人群,感染空腸彎曲菌可導(dǎo)致格林-巴利綜合征(Guillain-Barre syndrome,GBS),容易造成呼吸肌麻痹而死亡,進(jìn)一步的空腸彎曲菌感染后遺癥是關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性紅斑等[3]。禽類是空腸彎曲菌的主要宿主。空腸彎曲菌在肉雞群中的定植率為30%～90%,在3周齡以上的雞群中定植率最高[4]。此外,空腸彎曲菌還可能污染生豬肉、牛肉、羊肉、蔬菜、水果、牛奶等。根據(jù)最新報(bào)道,空腸彎曲菌對(duì)氟喹諾酮類藥物、四環(huán)素、紅霉素、慶大霉素等抗生素均具有抗藥性[5],因此世界衛(wèi)生組織將其列為重要的耐藥細(xì)菌,為了有效防治空腸彎曲菌的污染和耐藥性,開發(fā)新型抗菌劑尤為迫切。

噬菌體是一種細(xì)菌病毒,它能夠通過尾絲蛋白識(shí)別細(xì)菌表面的特定受體,從而特異性地識(shí)別宿主菌,并在其體內(nèi)復(fù)制,最終裂解宿主菌[6]。噬菌體具有顯著的特異性、增殖迅速、強(qiáng)大的抗菌能力,而且不會(huì)對(duì)其他正常菌群產(chǎn)生影響[7],因此噬菌體已成為一種廣受關(guān)注的新型抗菌劑[8]。目前彎曲菌噬菌體大多數(shù)是從家禽的腸道或排泄物中分離,主要分為3組:Ⅰ組包含極少數(shù)具有大基因組的噬菌體(約320～425 kbp),Ⅱ組基因組大小介于180～190 kbp,Ⅲ組介于130～140 kbp。Ⅲ組噬菌體的裂解能力更強(qiáng),在防治彎曲菌污染方面具有更大的優(yōu)勢(shì)?？漳c彎曲菌特異性噬菌體可用于家禽養(yǎng)殖場(chǎng),以防止或減少彎曲菌在家禽中的定植[9]。CARVALHO等[10]發(fā)現(xiàn)空腸彎曲菌噬菌體雞尾酒通過口服灌胃和飼料給藥時(shí),空腸彎曲菌的數(shù)量減少約為2 lg CFU/g;LOC CARRILLO等[11]發(fā)現(xiàn)與未處理的對(duì)照組相比,在噬菌體給藥后5 d內(nèi),鳥類盲腸內(nèi)容物中空腸彎曲菌的數(shù)量下降0.55 lg CFU/g。目前只有16個(gè)彎曲菌噬菌體完成了全基因組測(cè)序,對(duì)空腸彎曲菌噬菌體進(jìn)行生物學(xué)表征和基因組學(xué)分析的研究十分有限[12],關(guān)于空腸彎曲菌噬菌體用于防控家禽生產(chǎn)中彎曲菌污染的專利也很少,因此需要開發(fā)更豐富的空腸彎曲菌噬菌體資源,并對(duì)其進(jìn)行表征和測(cè)序,是當(dāng)前彎曲菌噬菌體研究的重點(diǎn)[13]。

本研究從青島家禽養(yǎng)殖場(chǎng)雞糞樣品中分離一株裂解性的空腸彎曲菌噬菌體,對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)特性測(cè)定、全基因組分析及進(jìn)化分析等,為空腸彎曲菌噬菌體的研究和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ),為防控空腸彎曲菌污染和耐藥性提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

空腸彎曲菌2206(Campylobacterjejuni2206)由青島潤(rùn)達(dá)生物科技有限公司惠贈(zèng);空腸彎曲菌CICC 22936(CampylobacterjejuniCICC 22936)、沙門氏菌14028(Salmonella14028)、銅綠假單胞菌PA01(Pseudomonasaeruginosa01)、銅綠假單胞菌PA14(Pseudomonasaeruginosa14)、枯草芽孢桿菌WB800(BacillussubtilisWB800)由本實(shí)驗(yàn)室保存并提供。

1.1.2 樣品來源

雞糞便樣品采自山東省青島市家禽養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.1.3 培養(yǎng)基和主要試劑

NZCYM瓊脂培養(yǎng)基、NZCYM Broth,上海生工生物公司;哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基、脫纖維羊血、MH肉湯,青島海博生物技術(shù)有限公司;0.22 μm無菌濾膜,美國Millipore公司。SM緩沖液:NaCl 5.8 g,MgSO4·7H2O 2 g,1 mol/L Tris-HCl (pH 7.5) 50 mL,加超純水定容至1 L。1×PBS緩沖液:KH2PO40.2 g,Na2HPO42.17 g,NaCl 8 g,KCl 0.2 g溶解于1 L水中,調(diào)節(jié)最終pH值為7.4。

1.1.4 儀器與設(shè)備

2.5 L MGC微需氧產(chǎn)氣包、2.5 L MGC厭氧罐,日本三菱化學(xué)株式會(huì)社;mLS-3750高溫蒸汽滅菌鍋,日本SANYO公司;Sigma3K15離心機(jī),上海曦瑪離心機(jī)有限公司。

1.2 空腸彎曲菌的培養(yǎng)及菌液制備

將Campylobacterjejuni2206劃線培養(yǎng)于哥倫比亞血平板,放置微需氧產(chǎn)氣包于MGC厭氧罐42 ℃培養(yǎng)36～48 h。無菌接種單菌落至含有20 mL MH肉湯的小錐形瓶,42 ℃微需氧搖床培養(yǎng)24 h至菌液出現(xiàn)渾濁[14]。

1.3 噬菌體的分離純化

取適量新鮮的雞糞樣品用SM緩沖液浸泡,放置于4 ℃ 冰箱靜置過夜,使樣品中的噬菌體充分溶解到緩沖液中。將混合物在室溫下8 000 r/min離心15 min,通過0.22 μm無菌濾膜除菌,即為樣品濾液。取500 μL樣品濾液與500 μL對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的空腸彎曲菌液混合,靜置20 min,使噬菌體吸附到宿主菌上。將1 mL混合液和4 mL的半固體培養(yǎng)基NZCYM混合在一起,將混合液注入NZCYM固體平板,鋪雙層平板。將其放置在42 ℃的微需氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h,觀察噬菌斑的生長(zhǎng)狀況[15]。

挑取單個(gè)噬菌斑梯度稀釋于SM緩沖液中,鋪雙層平板,將平板放置在42 ℃微需氧環(huán)境中培養(yǎng)24 h。大約純化5～6輪,至平板上噬菌斑的形態(tài)一致。

1.4 噬菌體的電鏡形態(tài)觀察

將10 μL噬菌體增殖液滴加到銅網(wǎng)上面,靜置15 min,用濾紙吸去剩余噬菌體溶液,接著滴加10 μL 2%磷鎢酸染料液,繼續(xù)染色10 min,最后晾干。使用透射電子顯微鏡,觀察噬菌體的形態(tài)特征[16]。

1.5 噬菌體的生物學(xué)性質(zhì)

1.5.1 噬菌體熱穩(wěn)定性測(cè)定

將100 μL噬菌體液與900 μL SM緩沖液混合,將其分別放入30、40、50、60、70、80 ℃水浴,分別靜置30、60 min,采用雙層平板法計(jì)算噬菌體在各種溫度下的效價(jià),各個(gè)溫度條件采用3組平行測(cè)試[17]。

1.5.2 噬菌體pH穩(wěn)定性測(cè)定

取100 μL噬菌體液與900 μL不同pH值(2～13)的PBS緩沖液混合,于42 ℃水浴加熱2 h后,采用雙層平板法測(cè)定噬菌體在不同pH緩沖液的效價(jià),每個(gè)pH 做3組平行。

1.5.3 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)測(cè)定

感染復(fù)數(shù)(multiple of infection,MOI)是指在特定時(shí)間內(nèi)可吸附的噬菌體與宿主菌的比值,是表征裂解性噬菌體侵染能力的一個(gè)重要指標(biāo)。取1 mL對(duì)數(shù)期的空腸彎曲菌菌液(1.0×107CFU/mL),分別按照0.001、0.010、0.100、1.000、10.000、100.000的感染復(fù)數(shù)比例加入1 mL稀釋不同濃度的噬菌體,在42 ℃微需氧搖床,120 r/min條件培養(yǎng)6 h。將混合培養(yǎng)物以12 000 r/min離心2 min。取出100 μL的上清液,梯度稀釋,然后用雙層平板法測(cè)定噬菌體的效價(jià)。做3組平行實(shí)驗(yàn),噬菌體效價(jià)最高的一組感染復(fù)數(shù)即為最佳感染復(fù)數(shù)[18]。

1.5.4 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定

一步生長(zhǎng)曲線測(cè)定是衡量噬菌體裂解能力的一個(gè)重要生物學(xué)指標(biāo),能夠反映噬菌體潛伏期的長(zhǎng)短、裂解量大小等特性[19]。取1 mL對(duì)數(shù)期的空腸彎曲菌菌液,再加入1 mL效價(jià)為1.0×105PFU/mL的噬菌體,按照最佳感染復(fù)數(shù)(MOI=0.01),將混合液放入42 ℃微需氧厭氧罐中,120 r/min孵育20 min,使噬菌體充分吸附到宿主菌上。將混合物離心2 min,棄去上清液,用MH肉湯洗滌2次,將沉淀用MH肉湯重懸加入20 mL MH肉湯中,在42 ℃的微需氧搖床中以120 r/min的速度進(jìn)行培養(yǎng)。定時(shí)取樣,直至300 min。每30 min取樣1次測(cè)定效價(jià),重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。以時(shí)間為橫坐標(biāo),以噬菌體效價(jià)的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo),繪制一步生長(zhǎng)曲線[20]。

1.5.5 噬菌體對(duì)宿主菌生長(zhǎng)的抑制作用

分別將1 mL對(duì)數(shù)期的空腸彎曲菌液(1.0×107CFU/mL)與1 mL稀釋不同濃度的噬菌體液,分別按照感染復(fù)數(shù)為0.01,0.10,1.00的比例混合接種至20 mL MH肉湯。對(duì)照組為1 mL不含噬菌體的樣品。在42 ℃微需氧搖床120 r/min培養(yǎng)24 h,每隔6 h測(cè)量混合物的OD600值。每次做3組平行。

1.5.6 噬菌體裂解譜測(cè)定

噬菌體的裂解譜測(cè)定采用點(diǎn)斑法。取100 μL宿主菌液,包括空腸彎曲菌2206,空腸彎曲菌CICC 22936,沙門氏菌14028,銅綠假單胞菌PA01,銅綠假單胞菌PA14,枯草芽孢桿菌WB800于5 mL半固培養(yǎng)基中,混勻后倒置于平板中。取5 μL噬菌體液點(diǎn)滴到含有不同菌液的雙層平板上。過夜培養(yǎng)觀察有無噬菌斑。

1.6 噬菌體基因組測(cè)序與分析

用病毒基因組DNA提取試劑盒提取噬菌體vB_Cj_QDYZ的DNA[21],送至上海凌恩生物公司進(jìn)行測(cè)序。使用RAST軟件對(duì)噬菌體進(jìn)行基因預(yù)測(cè)[22],確定全基因組所有的開放閱讀框(open reading frame, ORF)。根據(jù)BLASTp比對(duì)工具進(jìn)行蛋白比對(duì),推測(cè)每個(gè)ORF最相近的蛋白功能,即完成噬菌體的全基因組功能注釋[23]。

使用BLASTn對(duì)噬菌體vB_Cj_QDYZ的全基因組進(jìn)行比對(duì),并下載相似性較高的空腸彎曲菌噬菌體基因組,構(gòu)建全基因組水平的進(jìn)化樹。使用BLASTp對(duì)噬菌體vB_Cj_QDYZ的主要衣殼蛋白序列、內(nèi)溶素序列進(jìn)行比對(duì),利用MEGA 7.0軟件,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.7 噬菌體在牛奶中的抑菌效果

將500 μL濃度為1.0×106CFU/mL的空腸彎曲菌液與500 μL噬菌體增殖液(1.0×108PFU/mL)混合于5 mL牛奶中,在42 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中孵育。對(duì)照組為500 μL無菌PBS緩沖液。分別于0 h和4 h取出樣品,對(duì)其進(jìn)行梯度稀釋,在合適梯度吸取100 μL涂布于哥倫比亞血平板上,42 ℃微需氧條件培養(yǎng)24～36 h,并計(jì)算哥倫比亞血平板上的空腸彎曲菌的單菌落總數(shù)。細(xì)菌數(shù)的計(jì)算如公式(1)所示:

細(xì)菌數(shù)/(CFU/mL)=菌落計(jì)數(shù)×10×稀釋倍數(shù)

(1)

2 結(jié)果與分析

2.1 空腸彎曲菌噬菌體的分離和純化

通過雙層平板法分離得到一株空腸彎曲菌的裂解性噬菌體。根據(jù)宿主菌及分離樣品來源,將噬菌體命名為vB_Cj_QDYZ。經(jīng)過6輪純化,噬菌斑的大小和形態(tài)比較一致,如圖1-A所示,它們的直徑僅為1～2 mm,邊緣光滑,沒有任何暈環(huán);噬菌斑清晰透亮,說明噬菌體的裂解能力較強(qiáng)。

A-噬菌斑形態(tài);B-噬菌體的透射電鏡形態(tài)圖1 噬菌體 vB_Cj_QDYZ的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of phage vB_Cj_QDYZ

2.2 噬菌體透射電鏡形態(tài)觀察

如圖1-B所示,噬菌體vB_Cj_QDYZ在透射電子顯微鏡下,有一個(gè)正二十面體的頭部(直徑約100.81 nm)和一條可伸縮的尾部(長(zhǎng)度約65.90 nm)。根據(jù)ICTV第九次病毒類型研究報(bào)告,噬菌體vB_Cj_QDYZ屬于有尾噬菌體目,肌尾噬菌體科[24]。目前大多數(shù)彎曲菌噬菌體都是肌尾噬菌體,具有終端泡和空頭結(jié)構(gòu),有肌鞘并且可收縮。只有極少數(shù)彎曲菌噬菌體是長(zhǎng)尾和短尾噬菌體。

2.3 噬菌體的生物學(xué)性質(zhì)

2.3.1 噬菌體的熱穩(wěn)定性

如圖2-A所示,噬菌體vB_Cj_QDYZ在30～60 ℃效價(jià)較穩(wěn)定,且維持較高水平,大約為107PFU/mL。當(dāng)噬菌體在70 ℃和80 ℃條件下孵育30 min,噬菌體效價(jià)明顯降低至102PFU/mL;孵育60 min時(shí),噬菌體完全失活。綜上,噬菌體vB_Cj_QDYZ的溫度耐受范圍為30～60 ℃。

A-噬菌體的溫度穩(wěn)定性;B-噬菌體的pH穩(wěn)定性;C-噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線;D-噬菌體對(duì)宿主的生長(zhǎng)抑制作用圖2 噬菌體 vB_Cj_QDYZ的生物學(xué)特性Fig.2 Biological characteristics of phage vB_Cj_QDYZ

2.3.2 噬菌體的pH穩(wěn)定性

如圖2-B所示,噬菌體vB_Cj_QDYZ在pH值為3～12時(shí)效價(jià)較穩(wěn)定,基本維持在大約106PFU/mL。當(dāng)噬菌體在pH=2的酸性環(huán)境或者pH=13的堿性環(huán)境孵育2 h后,完全失活。綜上,噬菌體vB_Cj_QDYZ的pH值耐受范圍是3～12。

2.3.3 噬菌體的最佳感染復(fù)數(shù)

根據(jù)表1的數(shù)據(jù),當(dāng)感染復(fù)數(shù)為0.01時(shí),噬菌體的效價(jià)達(dá)到最高,為2.07×108PFU/mL,因此vB_Cj_QDYZ的最佳感染復(fù)數(shù)為0.01。

表1 噬菌體vB_Cj_QDYZ最佳感染復(fù)數(shù)Table 1 The optimal MOI of phage vB_Cj_QDYZ

表2 噬菌體vB_Cj_QDYZ的裂解譜Table 2 The host range of phage vB_Cj_QDYZ

2.3.4 噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線

噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線主要由潛伏期、裂解期和平穩(wěn)期組成。如圖2-C所示,噬菌體的潛伏期是60 min。從第60 min以后,噬菌體的效價(jià)突然大規(guī)模增加,呈現(xiàn)指數(shù)式增長(zhǎng),因此噬菌體的裂解期是150 min。在最后的60 min, 噬菌體的效價(jià)不再出現(xiàn)明顯改變,此階段為平穩(wěn)期。爆發(fā)量是由噬菌體的效價(jià)和宿主菌的數(shù)量決定的。在爆發(fā)末期,噬菌體的效價(jià)大約為4.5×108PFU/mL,而感染初期宿主菌的含量為1.0×107CFU/mL,因此爆發(fā)量為45 PFU/cell。

2.3.5 噬菌體對(duì)宿主菌的生長(zhǎng)抑制作用

由圖2-D可知,噬菌體vB_Cj_QDYZ與空腸彎曲菌2206在不同感染復(fù)數(shù)混合培養(yǎng)后,初始OD600值基本相同,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),在微需氧條件培養(yǎng)第6 h時(shí),對(duì)照組OD600值已達(dá)到0.145, 加了不同濃度噬菌體組的OD600值是0.08。在培養(yǎng)第24 h,對(duì)照組OD600值為0.434,噬菌體組依然是0.08。表明噬菌體可在不同MOI下高效裂解宿主菌,噬菌體具有很強(qiáng)的裂解能力,可以有效抑制宿主菌的生長(zhǎng),具有良好的應(yīng)用前景和抗菌潛力。

2.3.6 噬菌體的裂解譜

空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ可以裂解實(shí)驗(yàn)室的兩株空腸彎曲菌,點(diǎn)斑法可以產(chǎn)生清晰透亮的噬菌斑。但是對(duì)于銅綠假單胞菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌的平板,則沒有清晰透亮的噬菌斑產(chǎn)生。充分說明空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ具有很強(qiáng)的特異性。研究表明空腸彎曲菌噬菌體的裂解譜相窄,特異性強(qiáng)。

空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ可以裂解實(shí)驗(yàn)室的兩株空腸彎曲菌,點(diǎn)斑法可以產(chǎn)生清晰透亮的噬菌斑。但是對(duì)于銅綠假單胞菌、沙門氏菌、枯草芽孢桿菌的平板,則沒有清晰透亮的噬菌斑產(chǎn)生。充分說明空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ具有很強(qiáng)的特異性。研究表明空腸彎曲菌噬菌體的裂解譜相窄,特異性強(qiáng)。

2.4 噬菌體vB_Cj_QDYZ全基因組分析

全基因組測(cè)序結(jié)果顯示:噬菌體vB_Cj_QDYZ基因組為雙鏈DNA,基因組全長(zhǎng)為130 627 bp, G+C含量為26%。根據(jù)基因組大小在130～140 kbp,推斷該噬菌體為Ⅲ組空腸彎曲菌噬菌體,屬于CP8 virus。研究表明Ⅲ組噬菌體是目前分離最多、抑菌效果最好的空腸彎曲菌噬菌體。

在噬菌體全基因組中不含抗生素耐藥基因、過敏原基因和毒力因子。進(jìn)一步說明該噬菌體應(yīng)用的安全性,具有良好的應(yīng)用前景和抗菌潛力。噬菌體vB_Cj_QDYZ在NCBI上的序列號(hào)為OQ515481.1。

2.5 噬菌體vB_Cj_QDYZ功能注釋

噬菌體 vB_Cj_QDYZ全基因組的功能注釋如圖3所示,全基因組一共有165個(gè)ORF,3個(gè)tRNA。其中有65個(gè)ORF編碼已知功能,另外100個(gè)編碼假設(shè)蛋白。對(duì)65個(gè)具有已知功能的ORF分類,主要有4種功能的蛋白:噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白、裂解蛋白、包裝蛋白、與噬菌體復(fù)制和代謝有關(guān)的蛋白。具體的注釋結(jié)果見附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.035791)。

附表1 噬菌體vB_Cj_QDYZ基因組功能注釋Attached Table 1 ORF analysis of Campylobacter jejuni phage vB_Cj_QDYZ genome

圖3 噬菌體vB_Cj_QDYZ基因組功能注釋Fig.3 Genome annotation of phage vB_Cj_QDYZ

噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白有:ORF10(主要衣殼蛋白),ORF131(衣殼組裝蛋白),ORF11和ORF34(頭部完成蛋白),ORF133(頸部蛋白),ORF13和ORF167(尾鞘穩(wěn)定劑和完成蛋白),ORF90、ORF91和ORF136(尾管蛋白),ORF113(尾鞘蛋白),ORF100(尾絲蛋白)。其中,尾管蛋白是噬菌體編碼尾部的蛋白,與吸附宿主菌密切相關(guān)。尾絲蛋白是噬菌體特異性識(shí)別宿主的物質(zhì)基礎(chǔ),噬菌體的尾絲蛋白在特定微生物檢測(cè)凈化等方面具有重要意義。

噬菌體裂解相關(guān)蛋白有2個(gè):ORF66(內(nèi)溶素)和ORF85(尾部溶菌酶)。噬菌體可能是通過表達(dá)這兩種蛋白來裂解宿主菌的。

噬菌體包裝蛋白:ORF107(末端酶大亞基),ORF134(末端酶小亞基)。噬菌體包裝蛋白主要在噬菌體包裝時(shí)起重要作用。其他蛋白包括受體結(jié)合蛋白:ORF1、ORF2、ORF3、ORF4,與噬菌體結(jié)合細(xì)菌表面受體相關(guān)。

與噬菌體復(fù)制和代謝有關(guān)的蛋白有:ORF6、7(重組核酸內(nèi)切酶),ORF8(轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子),ORF37(RNA連接酶),ORF48(聚合酶),ORF55(重組和修復(fù)蛋白),ORF63(脫氫酶),ORF68(拓?fù)洚悩?gòu)酶),ORF97(氨基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白),ORF101(核糖核酸酶),ORF158(DNA聚合酶),ORF162(胸苷激酶),ORF164(DNA引物酶亞基),ORF12、ORF54和ORF87(歸巢核酸內(nèi)切酶),ORF71、ORF144和ORF145(解旋酶),ORF61(dUTP焦磷酸酶),ORF153(核酸外切酶)。其中,重組和修復(fù)蛋白的功能是將噬菌體基因組整合到宿主菌上。歸巢核酸內(nèi)切酶參與DNA內(nèi)含子的水平轉(zhuǎn)移和基因表達(dá)的調(diào)控。解旋酶是一類解開氫鍵的酶,一般在噬菌體DNA復(fù)制過程中起到催化雙鏈DNA 解旋的作用。焦磷酸酶,參與DNA合成。核酸外切酶,具有從分子鏈的末端順次水解磷酸二酯鍵而生成單核苷酸作用的酶。

2.6 噬菌體vB_Cj_QDYZ比較基因組分析

噬菌體vB_Cj_QDYZ與空腸彎曲菌噬菌體CP39、CJLB-10、CP30A、CPX、CP8的同源性分別為98.30%、94.77%、94.61%、97.69%、97.82%,比對(duì)覆蓋率分別為95%、91%、92%、92%、92%。彎曲菌噬菌體分為2個(gè)屬Fletchervirus和Firehammervirus[25]。與vB_Cj_QDYZ相似度最高的噬菌體來自Eucampyvirinae亞科,Fletchervirus屬。初步推測(cè)空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ可能是來自Eucampyvirinae亞科,Fletchervirus屬的新成員。

2.7 噬菌體vB_Cj_QDYZ系統(tǒng)進(jìn)化分析

如圖4-A所示,基于全基因組序列構(gòu)建的進(jìn)化樹結(jié)果表明,噬菌體vB_Cj_QDYZ與CampylobacterphageCP39 具有最近的親緣關(guān)系。NCBI檢索發(fā)現(xiàn),CampylobacterphageCP39是Eucampyvirinae亞科、Fletchervirus屬的成員。研究表明CP39是肌尾噬菌體。因此推測(cè)vB_Cj_QDYZ是肌尾噬菌體(Myoviridae)科、Eucampyvirinae亞科、Fletchervirus屬的成員。

A-基于全基因組構(gòu)建的進(jìn)化樹;B-基于內(nèi)溶素序列構(gòu)建的進(jìn)化樹;C-基于主要衣殼蛋白構(gòu)建的進(jìn)化樹圖4 噬菌體vB_Cj_QDYZ進(jìn)化關(guān)系分析Fig.4 Phylogenetic relationships of phage vB_Cj_QDYZ

如圖4-B所示,噬菌體vB_Cj_QDYZ的內(nèi)溶素和CampylobacterphageCPX的內(nèi)溶素相似度最高;如圖4-C所示, vB_Cj_QDYZ的主要衣殼蛋白與CampylobacterphageCP39的最相近。標(biāo)尺代表遺傳距離,遺傳距離越短代表親緣關(guān)系越近。明顯看出,圖4-B和圖4-C的進(jìn)化樹標(biāo)尺較長(zhǎng),遺傳距離較大。因此推斷噬菌體vB_Cj_QDYZ可能為一株新的空腸彎曲菌噬菌體。

2.8 噬菌體在牛奶中的抑菌效果

如圖5所示,加入空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ后,在正常環(huán)境下放置4 h后,通過平板計(jì)數(shù)法測(cè)定,哥倫比亞血平板上的空腸彎曲菌菌落總數(shù)從初始的1.0×107CFU/mL降低至1.17×105CFU/mL,降低了2個(gè)lg CFU/mL,充分說明噬菌體vB_Cj_QDYZ在牛奶中的殺菌率為99%。牛奶是容易被彎曲菌污染的食品,選擇牛奶作為研究對(duì)象具有實(shí)際參考價(jià)值。綜上所述,噬菌體vB_Cj_QDYZ具有良好的抗菌潛力。

圖5 噬菌體 vB_Cj_QDYZ在牛奶中的抑菌效果Fig.5 Antibacterial effect of phage vB_Cj_QDYZ in milk samples

3 結(jié)論與討論

本研究以空腸彎曲菌2206為宿主菌,從雞糞中分離出一株空腸彎曲菌噬菌體,將其命名為vB_Cj_QDYZ。噬菌體在雙層平板上可形成清晰透亮的噬菌斑,這說明噬菌體具有很強(qiáng)的裂解能力。透射電鏡形態(tài)表明,噬菌體有一個(gè)正二十面體的頭部(直徑約100.81 nm)和一條可伸縮的尾部(長(zhǎng)度約65.90 nm),具有彎曲菌噬菌體典型的終端泡和空頭結(jié)構(gòu),屬于有尾噬菌體目,肌尾噬菌體科。大多數(shù)彎曲菌噬菌體屬于肌尾噬菌體。

生物學(xué)特性結(jié)果顯示,噬菌體具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性,表現(xiàn)出噬菌體在某些惡劣環(huán)境下具有一定的適用性。噬菌體vB_Cj_QDYZ在30～60 ℃,pH值為3～12的環(huán)境下效價(jià)較穩(wěn)定,這為噬菌體在實(shí)際家禽生產(chǎn)中的防控提供了理論依據(jù)?？漳c彎曲菌主要寄居在雞等家禽的腸道中,雞的正常體溫是39.6～43.6 ℃,雞腸道的pH值主要為2～4,這說明噬菌體vB_Cj_QDYZ可以在雞的腸道中存活且保持較高效價(jià),具有廣泛的應(yīng)用范圍。噬菌體vB_Cj_QDYZ的最佳感染復(fù)數(shù)為0.01,充分表明了噬菌體的侵染能力較強(qiáng)。一步生長(zhǎng)曲線表明,噬菌體的潛伏期是60 min,裂解期是150 min,爆發(fā)量是45 PFU/cell。因此,空腸彎曲菌噬菌體vB_Cj_QDYZ具有較短的潛伏期和較強(qiáng)的裂解能力。此外,加入不同感染復(fù)數(shù)的噬菌體顯著抑制了空腸彎曲菌的生長(zhǎng),表現(xiàn)出噬菌體vB_Cj_QDYZ具有很強(qiáng)的裂解能力。噬菌體vB_Cj_QDYZ在牛奶中的殺菌率為99%,實(shí)際應(yīng)用價(jià)值較高,具有開發(fā)為新型空腸彎曲菌抗菌劑的潛力。

基因組學(xué)研究有利于從基因水平更深入了解空腸彎曲菌噬菌體。噬菌體vB_Cj_QDYZ基因組為雙鏈DNA,基因組全長(zhǎng)為130 627 bp, G+C含量為26%。基因組大小位于130～140 kbp,根據(jù)ICTV對(duì)彎曲菌噬菌體的最新分類,噬菌體vB_Cj_QDYZ被命名為CP8 virus,且屬于Ⅲ組噬菌體,特異性受體是莢膜多糖,對(duì)空腸彎曲菌具有較強(qiáng)的裂解性能。Ⅲ組噬菌體是目前抑菌效果最好的空腸彎曲菌噬菌體。噬菌體一共有165個(gè)ORF,3個(gè)tRNA。其中65個(gè)ORF具有功能。此外,以全基因組序列構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示,噬菌體vB_Cj_QDYZ與CampylobacterphageCP39具有最近的親緣關(guān)系以主要衣殼蛋白和內(nèi)溶素序列構(gòu)建的進(jìn)化樹表明,噬菌體與其他的空腸彎曲菌噬菌體遺傳距離較遠(yuǎn),推斷噬菌體vB_Cj_QDYZ屬于Fletchervirus屬的新成員。此外,噬菌體 vB_Cj_QDYZ不含有抗生素耐藥基因、毒力基因、過敏原基因等,安全性較高,適合于實(shí)際應(yīng)用生產(chǎn)。

本研究分離純化一株裂解能力較強(qiáng)、穩(wěn)定性良好、安全性較高的新型空腸彎曲菌噬菌體,能夠有效抑制空腸彎曲菌的生長(zhǎng),且特異性較強(qiáng),具有開發(fā)為新型空腸彎曲菌抗菌劑的潛力,豐富了空腸彎曲菌噬菌體的資源,為防治空腸彎曲菌污染提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)。