羨榮華,蒲鐸文,樊梓鸞,2,于承媛,劉永旭,季子琦,劉榮,2*

1(東北林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院,黑龍江 哈爾濱,150040)2(黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室,黑龍江 哈爾濱,150040)

老山芹(Heraclenmdissectum),學(xué)名東北牛防風(fēng),系傘形科牛防風(fēng)屬多年生草本植物,主要分布于中東北部林區(qū)、華北、俄羅斯等地。老山芹作為一種東北優(yōu)質(zhì)的含有豐富營養(yǎng)價值的藥食兩用山野菜,被認(rèn)為是山林野菜中的“綠色黃金”[1]。已從老山芹中分離得到多種生物活性成分,包括多糖、黃酮、香豆素、皂苷等[2]。目前,對老山芹的研究主要集中在種植和栽培領(lǐng)域[3],對其化學(xué)成分和生物活性的報道較少。

植物多糖是一類重要的天然活性產(chǎn)物,具有廣泛的生物活性,如降血糖、抗氧化、抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)腸道菌群等[4]。天然多糖因其良好的生物活性、生物降解性、生物相容性和無毒性,成為目前國內(nèi)外研究的焦點[5]。有研究表明老山芹中多糖含量可達(dá)到10%以上[6],然而關(guān)于老山芹多糖(Heraclenmdissectumpolysaccharides, HDP)結(jié)構(gòu)和生物活性的進(jìn)一步研究尚未見報道。

人體內(nèi)的α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶是糖代謝的關(guān)鍵酶,某些植物多糖通過抑制酶活性、減少葡萄糖吸收、增加葡萄糖代謝且增加胰島素的敏感性,近而發(fā)揮調(diào)節(jié)糖代謝的作用[7]。因此,通過抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性可以明顯延緩葡萄糖向血糖的轉(zhuǎn)化,達(dá)到降低血糖的效果[8]。本研究通過對老山芹分離純化、結(jié)構(gòu)表征及體外降糖活性進(jìn)行研究,為老山芹多糖進(jìn)一步研究及開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

老山芹,黑龍江省嫩江農(nóng)場;DEAE-cellulose 52、Sephadex G-100、纖維素酶、果膠酶、α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶、對硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside,PNPG),上海源葉生物科技有限公司;單糖標(biāo)準(zhǔn)品、溴化鉀,阿拉丁生化科技股份有限公司;其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ELx800 NB型酶標(biāo)儀,美國Bio Tek公司;RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,上海亞榮生化儀器廠;Thermo ICS5000離子色譜系統(tǒng)、Nicolet IS5型傅里葉變換紅外光譜儀,美國賽默飛世爾科技公司;JSM-7500F型冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡,日本電子株式會社(JEOL);X射線衍射(X-ray diffraction,XRD)儀,荷蘭Panalytical公司;STA449F5型同步熱分析儀,德國耐馳。

1.3 實驗方法

1.3.1 HDP的提取

老山芹去除根部后,置于60 ℃烘箱烘干后粉碎備用。取10 g老山芹粉,加入400 mL超純水,pH值調(diào)節(jié)至5,50 ℃的水浴酶解[纖維素酶和果膠酶2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)),質(zhì)量比1：1]1 h,微波功率450 W加熱12 min。離心濃縮,加入4倍體積的無水乙醇,醇沉24 h。利用Sevag法[V(氯仿)：V(正丁醇)=4：1]脫蛋白,離心去除沉淀,重復(fù)多次至無白色沉淀,透析72 h后凍干得HDP。

1.3.2 HDP的分離純化

取100 mg HDP溶于10 mL超純水,0.45 μm的水系濾膜過濾。用裝好的離子交換柱進(jìn)行線性梯度洗脫,洗脫液為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液,洗脫速率為1 mL/min,洗脫時間為4 min/管。采用苯酚-硫酸法[9]測定每管洗脫液的總糖含量,根據(jù)洗脫體積和OD值大小繪制洗脫曲線。收集不同組分濃縮、透析、冷凍干燥。根據(jù)結(jié)果篩選出超純水溶液的洗脫組分進(jìn)行SephadexG-100柱洗脫,流速為0.4 mL/min,收集單一組分,濃縮冷凍干燥得HDP-1組分。

1.3.3 多糖分子質(zhì)量測定

參照ZHU等[10]的方法采用高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography,HPGPC)測定。

1.3.4 多糖的單糖組成分析

參照ZHANG等[11]的方法采用離子色譜法測定。

1.3.5 多糖紫外-可見光光譜(ultraviolet-visible spectroscopy,UV-VIS)和傅立葉變換紅外光譜(Fourier transform infrared spectroscopy,FT-IR)分析

可見分光光度計對純化多糖的純度進(jìn)行鑒定,配制質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液,在波長為200～400 nm進(jìn)行紫外光譜掃描,檢測是否含有蛋白質(zhì)。

稱取2 mg干燥的多糖樣品和200 mg溴化鉀,混勻后研磨至細(xì),壓成薄片后檢測。以溴化鉀為空白對照,在波數(shù)為4 000～500 cm-1進(jìn)行紅外光譜掃描。

1.3.6 剛果紅試驗

根據(jù)XU等[12]的方法對多糖是否具有三股螺旋結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定。

1.3.7 掃描電鏡分析

用導(dǎo)電膠將多糖粘在樣品臺上,在真空噴鍍儀內(nèi)噴上金膜,掃描電子顯微鏡下觀察樣品表面形態(tài)。

1.3.8 XRD衍射分析

采用X射線衍射,衍射條件為:Cuk α衍射,管壓35 kV,管流100 mA,角度10°～70°,角度梯度0.02°。

1.3.9 多糖熱重分析

稱取樣品5 mg,放置坩堝中,使用熱重分析儀對其熱穩(wěn)定性進(jìn)行測試。

1.3.10 老山芹多糖的體外降血糖活性測定

參考文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行修改測定。

α-淀粉酶抑制:將10 μL的α-淀粉酶(1 U/mL)溶液與20 μL多糖溶液混合,37 ℃下反應(yīng)15 min。加500 μL的淀粉溶液(1%,質(zhì)量分?jǐn)?shù)),反應(yīng)10 min,加入600 μL的DNS試劑,沸水浴加熱15 min。冷卻后,在540 nm處測定吸光度,阿卡波糖作對照。抑制率計算如公式(1)所示:

(1)

式中:A1,實驗組吸光值;A2,背景組吸光值;A0,對照組吸光值。

α-葡萄糖苷酶抑制:40 μL α-葡萄糖苷酶溶液(0.2 U/mL)添加到20 μL的樣品溶液中,37 ℃條件下,反應(yīng)20 min后加入50 μL PBS(0.2 mol/L,pH值為6.9),40 μL PNPG(0.251 mg/mL),37 ℃條件下,反應(yīng)20 min。加入140 μL Na2CO3溶液(2 mol/L)終止反應(yīng),405 nm下測定吸光度,阿卡波糖作對照,計算同公式(1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 HDP的提取、分離和純化

經(jīng)過提取、脫蛋白、透析凍干后得到的HDP,提取得率為10.28%。HDP經(jīng)DEAE-cellulose 52離子交換柱分離,分別在水洗脫與梯度鹽洗脫部分得到4個峰,如圖1所示,分別命名為HDP-1、HDP-2、HDP-3、HDP-4。各組分所得多糖比率分別為84.27%、8.96%、4.72%、2.05%。由于HDP-2、HDP-3、HDP-4的峰值和峰面積較小即含量比較少,因此選取HDP-1為下一步分離對象,經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱純化,得到單一對稱的單峰組分,透析后濃縮凍干得純化多糖樣品HDP-1。苯酚-硫酸法測得的HDP-1總糖含量為83.27%。

分別對分子量100 kDa、30 kDa、10 kDa超濾膜超濾所得截留液以及濾過液進(jìn)行蛋白質(zhì)含量測定，結(jié)果顯示，10 kDa和30 kDa超濾膜對蛋白質(zhì)的脫除率分別為70.81%和77.62%，100 kDa超濾膜對蛋白質(zhì)的脫除率最高，達(dá)82.21%。隨著超濾膜分子量的增大，蛋白質(zhì)去除率提高。這是由于實驗中用于超濾的靈芝子實體多糖溶液是經(jīng)過纖維素酶和蛋白酶復(fù)合酶解靈芝子實體所得，因此較其他提取方法所得粗多糖溶液，酶解液中含有相對較多的游離小分子蛋白質(zhì)。

a-DEAE-52 纖維素柱色譜法洗脫曲線;b-SephadexG-100 柱層析的洗脫曲線圖1 DEAE-52 纖維素柱色譜法洗脫曲線和SephadexG-100柱層析的洗脫曲線Fig.1 Elution curves of polysaccharides by 52 cellulose column chromatography and SephadexG-100 column chromatography

2.2 多糖分子質(zhì)量測定

如圖2所示,HDP-1的出峰時間為17.142 min,存在單一對稱峰,多分散系數(shù)為1.202,表明HDP-1經(jīng)分離純化后為均一多糖。通過糖分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-0.413 2x+11.13計算,HDP-1的平均分子質(zhì)量分別為11.141 kDa。HDP-1屬于低分子質(zhì)量多糖,可能是由于提取時,酶的作用以及高溫的影響破壞了多糖的分子鏈,降解多糖使其分子間氫鍵斷裂從而導(dǎo)致多糖分子質(zhì)量的降低[14]。有研究表明受提取方式的影響,一些多糖分子質(zhì)量降低時,可能會使其水溶性增加,生物活性增強[15]。

圖2 HDP-1的分子質(zhì)量分布Fig.2 HPGPC profile of molecular weight distribution of HDP-1

2.3 單糖組成分析

由圖3可知,HDP-1由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸組成,摩爾比為5.96：1.95：1：1.03：1.02：0.29：0.31：0.12。由于HDP未有報道,與老山芹同屬的傘形科白芷多糖的研究表明[16],白芷多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖等7種單糖組成,摩爾組成比例為1.19：1.19：0.765：1：8.08：3.34,與本文分離純化得到的單糖種類及占比類似,葡萄糖和半乳糖占比最高。

圖3 單糖標(biāo)準(zhǔn)品和HDP-1單糖組成的離子色譜圖Fig.3 Ion chromatogram of standards and HPD-1注:Fuc:巖藻糖;Rha:鼠李糖;Ara:阿拉伯糖;Gal:半乳糖;Glc:葡萄糖;Xyl:木糖;Man:甘露糖;Fru:果糖;Rib:核糖;Gal-ua:半乳糖醛酸;Gul-ua:古羅糖醛酸;Glc-ua:葡萄糖醛酸;Man-ua:甘露糖醛酸。

2.4 多糖紫外可見光譜和紅外光譜分析

紫外可見光譜結(jié)果見圖4-a,HDP-1在260 nm和280 nm波長處均無明顯特征吸收,說明多糖中不含有蛋白質(zhì)和核酸[17]。

a-HDP-1紫外-可見光光譜分析;b-HDP-1紅外光譜分析圖4 HDP-1 的紫外-可見光光譜和紅外光譜分析Fig.4 UV spectra and FI-IR spectra of HDP-1

2.5 剛果紅試驗

如圖5所示,在NaOH作用下,HDP-1與剛果紅絡(luò)合物沒有紅移現(xiàn)象,表明HDP-1不具備三螺旋結(jié)構(gòu)[21]。多糖的三螺旋結(jié)構(gòu)與分子質(zhì)量及單糖組成有關(guān),小分子質(zhì)量的多糖一般為單股螺旋結(jié)構(gòu),且雜多糖一般不會形成三螺旋結(jié)構(gòu)[22]。這與前文分子質(zhì)量及單糖組成得到的結(jié)論相互驗證。

圖5 HDP-1剛果紅實驗結(jié)果Fig.5 Results of Congo red with HDP-1

2.6 掃描電鏡分析

圖6為分別使用不同放大倍數(shù)的HDP-1的表觀形貌。從圖中可以看出在低倍鏡下多糖表面粗糙呈片狀,內(nèi)部成分復(fù)雜聚集,HDP-1組分純度高,未見雜質(zhì);在高倍鏡下可以看到有細(xì)小不均勻的顆粒排列緊湊,相互堆積為表面較為緊實的結(jié)構(gòu),中心有貫穿的孔洞。多糖粗糙的表面結(jié)構(gòu)使其更易與水結(jié)合,提高其溶解性[23]。多糖組分中單糖組成的差異也可能對多糖表面粗糙程度產(chǎn)生影響[24]。而其多孔結(jié)構(gòu)可能是微波的熱效應(yīng)短時間升高其內(nèi)部溫度,使結(jié)構(gòu)變得膨脹所導(dǎo)致。

圖6 HDP-1的掃描電鏡圖Fig.6 SEM image of HDP-1

2.7 XRD衍射分析

多糖的結(jié)晶結(jié)構(gòu)直接影響物理性質(zhì),包括溶解度、溶脹度、黏度或不透明性[25]。通過測定XRD圖譜(圖7),顯示在20°左右,HDP-1有一個較為明顯的大小不同的衍射峰,其峰形圓鈍,峰強度較低,因此HDP-1結(jié)晶度較低,主要以非定型的結(jié)晶態(tài)存在。曾凡珂等[26]報道的荸薺皮多糖的XRD圖譜衍射峰主要集中在2θ為20°～30°,峰形與HDP接近,結(jié)晶程度低,溶解性和生物利用度較好。

圖7 HDP-1的X射線衍射圖Fig.7 XRD patterns of HDP-1

2.8 多糖熱重分析

由TG曲線(當(dāng)前溫度下樣品質(zhì)量與初始質(zhì)量之比)和DTG曲線(將TG曲線上的各點相對于時間坐標(biāo)進(jìn)行一次微分)分析結(jié)果(圖8)可知,HDP-1組分在20～240 ℃失重16.79%,在這個階段,在81.93 ℃處有一個明顯的熱損失峰值,同時在202.55 ℃處開始出現(xiàn)一個較平緩的吸熱峰,推測是多糖分子脫水引起的,這與前文的紅外光譜結(jié)果中分析的HDP-1在1 598 cm-1處有結(jié)合水特征吸收峰的結(jié)果一致;HDP-1組分在240～600 ℃失重29.54%,在281.21 ℃時有吸收峰,并陡然增強,這可能是多糖化學(xué)降解和熱分解造成的吸熱峰,包括糖環(huán)的脫水和解聚以及水和二氧化碳的形成[27]。根據(jù)上述實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),HDP-1有著較好的熱穩(wěn)定性。

圖8 HDP-1熱重分析圖Fig.8 Thermogravimetric analysis of OPS

2.9 體外降血糖活性測定

如圖9所示,HDP對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制作用呈劑量依賴性,均低于陽性對照組(阿卡波糖)的抑制能力。由圖9-a可知,當(dāng)質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL時,HDP-1對α-淀粉酶的抑制率為62.11%;當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL,抑制率達(dá)到88.73%。由圖9-b可知,HDP-1抑制α-葡萄糖苷酶的作用稍弱于α-淀粉酶。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時,HDP-1對α-葡萄糖苷酶抑制率為73.25%。當(dāng)質(zhì)量濃度為15 mg/mL時,抑制率達(dá)90.95%。經(jīng)回歸方程計算HDP-1對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶IC50值分別為0.765和3.288 mg/mL,以上數(shù)據(jù)證明老山芹多糖對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶有較強的抑制能力。

a-α-淀粉酶抑制作用;b-α-葡萄糖苷酶抑制作用圖9 老山芹多糖對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制作用Fig.9 α-amylase activity α-glucosidase activity of HDP-1

研究表明,葡萄糖和半乳糖含量高的多糖具有較強的抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性[28]。分子質(zhì)量、單糖組成、空間構(gòu)象等因素均會影響多糖的生物活性。大部分具有降血糖活性的多糖都具有葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖,還有少部分具有半乳糖醛酸、鼠李糖和巖藻糖,多糖中個別單糖的存在或缺失會影響其降血糖活性[29]。因此,HDP-1其單糖組成種類豐富可能是決定其有良好降血糖活性的原因。此外,低分子質(zhì)量的多糖通過抑制腸道內(nèi)碳水化合物的降解進(jìn)而抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性[30]。因此,推測HDP-1的良好降血糖活性可能也與其分子質(zhì)量較低有關(guān)。

3 結(jié)論

采用微波輔助酶法提取得到老山粗多糖HDP,經(jīng)DEAE-cellulose 52和Sephadex G-100柱分離純化得到組分HDP-1。結(jié)果表明,HDP-1是一種相對分子質(zhì)量為11.141 kDa的均一多糖,總糖含量為83.27%,不含核酸和蛋白質(zhì)。單糖組成分析表明HDP-1是由葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、鼠李糖、木糖、半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸組成的雜多糖,摩爾比為5.96：1.95：1：1.03：1.02：0.29：0.31：0.12。HDP-1具有多糖的特征吸收基團(tuán),主要以β構(gòu)型的吡喃糖苷存在且不具有三螺旋結(jié)構(gòu)。掃描電鏡下HDP-1呈球狀或柱狀的結(jié)構(gòu)。XRD衍射光譜及熱重分析結(jié)果顯示,HDP-1主要以非定型的結(jié)晶狀態(tài)存在且具有較好的熱穩(wěn)定性。HDP-1對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的半數(shù)抑制濃度(IC50值)為0.765、3.288 mg/mL,具有較好的體外降糖活性,證明了老山芹多糖的潛在藥理價值。

本研究為進(jìn)一步探討老山芹多糖降血糖活性與結(jié)構(gòu)的關(guān)系提供數(shù)據(jù)支持,同時也為天然植物多糖在醫(yī)藥和功能食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。