楊凱,翟燕

(太原工業(yè)學院 材料工程系,山西 太原 030008)

通過兩親性分子自組裝制備的納米結構材料在分子生物學、醫(yī)學及生物材料領域展現出巨大的應用潛能[1-2]。兩親性分子中的親水性和疏水性結構單元與介質環(huán)境相互作用,使得兩親性分子能夠在選擇性溶劑中發(fā)生自組裝形成不同形貌的納米結構,常見的納米結構有球形膠束、納米管和納米囊泡等[3]。在生物體中,各種生物大分子,如蛋白質和磷脂,通過分子間或分子內的相互作用,可以自發(fā)組裝成囊泡或囊泡類結構[4-6]。生物體內的這些囊泡類結構在細胞之間的信號傳輸及能量物質傳遞方面扮演著重要的角色,例如血液中的胰島素就是以囊泡包裹的形式穿過細胞膜進入組織細胞中并發(fā)揮效用[7]。因此,可以將納米囊泡結構被用作藥物或者基因載體,在藥物輸送及基因工程領域充分發(fā)揮生物學應用價值[8-9]。

兩親性聚合物自組裝制備的囊泡結構由于在生理條件下能夠更穩(wěn)定存在,可以被用作藥物載體用于藥物輸送。同濟大學李永勇教授課題組,將三嵌段共聚物PzLL-SS-PEG-SS-PzLL在水溶液中自組裝制備的囊泡結構用于鹽酸阿霉素(DOX·HCl)的負載運輸[10];蘇州大學孟鳳華教授課題組,將三嵌段共聚物PEG-PAA-PDEA組裝制備的囊泡用于細胞內蛋白質傳遞,誘導癌細胞凋亡[11]。能夠對外部刺激做出響應,進而發(fā)生形貌改變的納米囊泡載體可以實現負載藥物的可控釋放,提高治療效率,進一步拓寬了其在病毒殺死和疾病治療等領域的應用范圍。浙江大學俞豪杰教授課題組,將硝基氧自由基引入到兩親性聚合物HLT中,組裝制備囊泡結構后將其用于氟美松(DEX)的輸送,負載藥物后的囊泡結構在抗壞血酸存在的條件下能夠自發(fā)解散并釋放藥物,展現出良好的還原刺激響應特性[12]。蘇州大學鐘志遠教授課題組,利用所合成的兩親性共聚物PEG-PTMBPTC組裝制備了對環(huán)境pH值能夠做出刺激響應的囊泡結構,并將其用于紫杉醇(PTX)的包覆運輸,由于聚合物分子鏈中存在的環(huán)芐基縮醛基團在弱酸性pH值下能發(fā)生快速水解,導致囊泡聚集體的膨脹和散解,從而實現負載藥物的可控釋放[13]。除此之外,能夠對其他外部環(huán)境,如光、氧化還原、溫度等刺激做出響應的藥物運載體的研究也被持續(xù)報道[14]。納米囊泡的藥物負載量與粒徑分布存在密切關系,粒徑分布越窄,藥物負載量越高。同時,囊泡結構的尺寸大小也會影響藥物載體的輸送效率,例如粒徑尺寸在200 nm左右的囊泡結構能夠選擇性地穿透腫瘤部位的毛細血管壁到達病灶[15]。目前,粒徑大小可控、分布均一,同時在水溶液中能夠穩(wěn)定分散的納米囊泡結構的制備還存在諸多挑戰(zhàn)[16-17]。同時,現有報道中用于藥物輸送的納米囊泡結構多是通過嵌段共聚物在水溶液中自組裝制備。嵌段共聚物的合成路線冗長、步驟繁瑣,往往涉及不同嵌段的順序共聚及接枝、取代、水解和“點擊”反應等步驟[18-19]。相對于嵌段共聚物,無規(guī)共聚物的制備過程簡單,通常是通過兩種或多種不同單體一步共聚制備合成。因此,利用無規(guī)共聚物自組裝制備能夠穩(wěn)定在水溶液中分散、粒徑大小分布均一的納米囊泡結構在生物醫(yī)學領域更具實際意義。

采用ATRP反應僅一步成功制備了無規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA),通過無規(guī)共聚物在水中自組裝制備了能夠穩(wěn)定在水溶液中分散、粒徑大小分布均一、對pH值具有刺激響應的囊泡結構。通過核磁共振氫譜(1H NMR)和傅里葉紅外光譜(FT-IR)對聚合物的分子結構進行了表征,通過凝膠滲透色譜(GPC)對聚合物的分子量大小及分布進行了表征,通過透射電鏡(TEM)和動態(tài)光散射光譜(DLS)對囊泡結構的形貌、粒徑大小及分布進行了表征,并對所制備囊泡結構的pH值刺激響應特性進行了評價。結果表明,無規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)成功制備,分子量大小為10 600,分子量分布指數(Mw/Mn)為1.20;在水中自組裝后的形貌為囊泡結構,囊泡的粒徑大小為(220±10)nm、大小分布均一、分散性穩(wěn)定性良好;囊泡結構表面的zeta電位值為(32.6±0.8)mV。這些優(yōu)異的特性使得所制備的新型納米囊泡結構可以被用作藥物或者基因載體,在藥物輸送、靶向釋放及基因工程領域具有巨大的應用價值。

1 儀器與材料

1.1 實驗材料

聚乙二醇單甲醚(mPEG,平均分子量5 000,aladdin),2-溴異丁酰溴(質量分數98%,aladdin),甲基丙烯酸二乙氨基乙酯(DEAEMA,質量分數99.8%,aladdin),甲基丙烯酸2,2,3,4,4,4-六氟丁酯(HFBMA,質量分數99.8%,aladdin),五甲基二乙烯三胺(PMDETA,質量分數99.8%,aladdin),溴化亞銅(CuBr,質量分數99.8%,aladdin),三氯甲烷(分析純,天津大茂化學試劑廠)。

1.2 測試儀器

傅立葉變換紅外光譜(VERTEX 70,德國布魯克公司),400 M核磁共振波譜儀(AVANCE III HD,德國布魯克公司),馬爾文激光粒度儀(Mastersizer 3000,英國馬爾文儀器有限公司),凝膠滲透色譜儀(Waters 1515,美國沃特世有限公司),透射電子顯微鏡(JEM-2100F,日本電子株式會社)。

1.3 大分子引發(fā)劑mPEG-Br的合成

參照參考文獻報道的合成方法來合成大分子引發(fā)劑mPEG-Br[20-23]。首先,將三乙胺和二氯甲烷干燥。將mPEG(Mn=5 000 g/mol,22.0 g,4.4 mmol)和三乙胺(1.5 mL,10.8 mmol)溶解在200 mL二氯甲烷中。將混合溶液在冰浴中冷卻,向混合溶液中滴加溶解在15 mL二氯甲烷中的2-溴異丁酰溴(1.5 mL,14.3 mmol),并在2 h內滴加完畢。隨后升溫25 ℃,攪拌12 h。反應完畢后,過濾除去反應生成的鹽。所得濾液依次用1 mol/L HCl,1 mol/L NaOH和去離子水洗滌。用硫酸鎂干燥后,將濾液滴加到過量的冰冷乙醚中沉出,室溫下真空干燥12 h,得到白色固體mPEG-Br。

1.4 無規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的合成

將大分子引發(fā)劑mPEG-Br(1.00 g,0.2 mmol),DEAEMA(0.56 g,3.0 mmol),HFBMA(0.18 g,0.72 mmol)和三氯甲烷(5 mL)的混合溶液加入到裝有磁力攪拌棒的25 mL Schlenk燒瓶中,并通過三次冷凍抽氣-解凍循環(huán)。反應混合物在液氮中保持冷凍的狀態(tài)下依次將PMDETA(0.35 g,0.2 mmol)和CuBr(0.29 g,0.2 mmol)快速加入燒瓶中,隨后立即將燒瓶中充入氬氣。燒瓶密封后,進行三次抽脫氣循環(huán)。然后將燒瓶浸入60 ℃的水浴,4 h后將反應物通入空氣并加入THF終止反應。旋蒸除去大量溶劑,將所得藍色粗產物通過硅膠層析柱進行純化,其中二氯甲烷作為淋洗液。將所得產物溶液濃縮并在正己烷中沉淀析出,將粗產物在真空干燥箱中干燥24 h。

1.5 無規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的自組裝

將25.0 mg無規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)溶于1 mL 四氫呋喃溶液中,充分攪拌混合0.5 h。隨后將混合溶液裝入透析袋(7 000 Da)在去離子水溶液中透析6 h,通過各嵌段親疏水作用引導無規(guī)共聚物進行自組裝。然后,將所得溶液在5 000 r/min下離心5 min,收集上層溶液后并重新分散在5 mL去離子水中。

2 結果與討論

2.1 mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)分子結構表征

圖1(a)是無規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的完整合成路線。圖1(b)和圖1(c)分別是無規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的FT-IR和1H NMR譜圖。如圖1(b)所示,波數在2 987 cm-1處的吸收帶是共聚物結構中-CH3的不對稱伸縮振動吸收峰;波數在1 747,1 481(1 454),1 406(1 380),1 188 cm-1和1 107 cm-1處的吸收帶分別是聚合物鏈段P(DEAEMA-r-HFBMA)結構中C=O的伸縮振動峰、-C(F)3的兩個特征振動吸收峰、-C(F)2-的兩個特征振動吸收峰、-C-F的特征振動吸收峰和-C-N振動吸收峰;波數在1 287 cm-1處的吸收帶是聚合物鏈段mPEG結構中-C-O-C-的伸縮振動吸收峰。如圖1(c)所示,化學位移在4.8～5.1和4.02處是聚合物鏈段P(DEAEMA-r-HFBMA)結構中-CHF-和C-CH2N-的質子峰;化學位移在3.66處是聚合物鏈段mPEG結構中骨架-CH2CH2O-的質子峰;其他化學位移質子峰的歸屬均在圖1(c)中標出。

圖1 (a)無規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的合成路線;無規(guī)共聚物(b)FT-IR譜圖和(c)1H NMR譜圖

無規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的分子量及分子量分布信息詳細羅列在表1中。無規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的Mn大小為10 600 g/mol;Mw/Mn的大小為1.20,說明無規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)的分子量分布均一。

表1 無規(guī)共聚物GPC分子量信息

2.2 mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA)在水中自組裝后的形貌及分散性表征

通過TEM對共聚物自組裝后的形貌和粒徑大小進行了表征,無規(guī)共聚物自組裝形成粒徑大小均勻的囊泡結構,囊泡的粒徑大小為(220±10) nm,如圖2(a)所示。圖2(b)是自組裝后分散在緩沖溶液中的DLS結果,在緩沖溶液中分散的囊泡結構水力直徑Dh,DLS=(231±8) nm,多分散性指數PDI=0.12,說明自組裝形成的囊泡結構分散性良好。TEM和DLS粒徑結果差異是因為測試條件的不同引起的,TEM測試時囊泡結構處于干燥狀態(tài),而DLS測試時囊泡結構分散在水溶液中,導致DLS所測得的粒徑略微比TEM測得的粒徑偏大。同時,通過zeta電位測試對囊泡結構表面的帶電性和膠體穩(wěn)定性進行了表征,囊泡溶液的zeta電位值為(32.6±0.8)mV,說明囊泡結構在溶液中膠體穩(wěn)定性良好,能夠穩(wěn)定分散。

圖2 無規(guī)共聚物自組裝后的(a)TEM圖(右上是從TEM圖中所統(tǒng)計的囊泡結構粒徑大小分布)和(b)組裝后溶液的DLS圖

3 結論

(1)采用ATRP反應僅一步制備了無規(guī)共聚物mPEG-b-P(DEAEMA-r-HFBMA),FT-IR和1H NMR結果表明無規(guī)共聚物的成功制備;

(2)GPC結果表明所制備的無規(guī)共聚物的分子量大小Mn=10 600 g/mol,分子量分布均窄,因此其自組裝后的相貌及分布比較理想;

(3)通過將所制備無規(guī)共聚物在水性溶液中自組裝制備了分散穩(wěn)定性良好、粒徑大小分布均一的單分散納米囊泡結構。囊泡的粒徑大小為(220±10)nm;囊泡結構表面的zeta電位值為(32.6±0.8)mV,分散性和膠體穩(wěn)定性良好;

(4)綜合以上優(yōu)異的特性,所制備的納米囊泡結構能夠被用來用作藥物載體,為實現抗癌藥物高負載輸送并在腫瘤細胞等癌變部位的靶向釋放提供了無限可能。