王 亮，孔 文，何 益*，黃江杰，史國華

（1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院, 安徽 合肥 230026；2.中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所, 江蘇 蘇州 215163）

1 引 言

眼睛是唯一一個可以通過光學(xué)方法非侵入觀察血管的器官，眼底成像一直是研究中央神經(jīng)系統(tǒng)和血管相關(guān)疾病的熱點[1-4]。此外，眼底成像對于篩選、觀察視網(wǎng)膜疾病的發(fā)展或監(jiān)測治療效果也具有重要意義。近年來，通過在眼底成像中引入自適應(yīng)光學(xué)技術(shù)[5-7]，實時測量眼睛光學(xué)系統(tǒng)像差并通過閉環(huán)校正，可以實現(xiàn)視細(xì)胞級的高分辨率成像[8-11]，從而將臨床上病理研究從組織尺度提升到了細(xì)胞尺度，可以使視網(wǎng)膜疾病與其他相關(guān)病理改變的研究周期顯著提前，有望實現(xiàn)疾病的早期診療。

在病理研究中，開展動物試驗是必須的[12-15]。作為一種標(biāo)準(zhǔn)實驗動物，小鼠是研究人類眼科疾病使用最廣泛的哺乳動物模型[16-19]，其具有與人眼相似的眼底結(jié)構(gòu)[20]，其更大的數(shù)值孔徑具有更高的成像分辨率[21]，并且容易獲得、生長迅速、培育簡單，是開展實驗驗證的理想實驗樣本。

自適應(yīng)光學(xué)成像借助波前探測和補償方法，實現(xiàn)衍射極限成像。自適應(yīng)光學(xué)成像的基礎(chǔ)是精確的波前探測。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠視網(wǎng)膜有多層反射光，若多層反射光同時進(jìn)入像差探測器，則無法進(jìn)行區(qū)分，極易導(dǎo)致波前探測失敗。為了解決鼠眼波前探測失效的問題，羅切斯特大學(xué)的Geng Y 等人設(shè)計了一種偏向特定視網(wǎng)膜層光線的夏克—哈特曼波前傳感器(SHWS)[22]，可以抑制視網(wǎng)膜其他層反射的光線，從而獲取目標(biāo)層的波前像差信息。斯坦福大學(xué)的AKONDI V 等人則通過完善SHWS 質(zhì)心算法，在波前計算中設(shè)定光強閾值，當(dāng)非目標(biāo)層光線的光強值低于閾值時，可以將其剔除，只保留目標(biāo)層反射光斑，從而可以減少因多層的反射引入的偽像差，提高波前測量精度。

現(xiàn)有技術(shù)條件下，特定哈特曼傳感器的研制復(fù)雜，需要與眼睛光學(xué)系統(tǒng)參數(shù)配合，通用性較差。利用算法去除非目標(biāo)層偽像差的方法，也會使目標(biāo)層光線強度降低，導(dǎo)致部分像差測量效果欠佳。考慮到小鼠等哺乳類動物視網(wǎng)膜可以認(rèn)為是兩層反射面[23-27]，兩層反射光束的強度差異并不明顯，但是在光束傳播過程中，存在兩層反射光束出現(xiàn)分離的位置。因此，本文提出在鼠眼波前像差探測系統(tǒng)中，合理設(shè)置一種光學(xué)掩模結(jié)構(gòu)，直接遮攔視網(wǎng)膜非目標(biāo)層的反射光線，只允許目標(biāo)層的反射光線進(jìn)入波前測量，以提升鼠眼波前像差的測量精度。結(jié)合仿真分析結(jié)果可以得到針對小鼠視網(wǎng)膜的光學(xué)掩?？讖匠叽鐓?shù)。對在體小鼠視網(wǎng)膜像差的測量實驗發(fā)現(xiàn)，該方法可以實現(xiàn)波前像差測量誤差的均方根（RMS）值下降74.9%，與理論仿真結(jié)果相近，說明本文所提方法有效提升了鼠眼波前像差的測量精度。

2 原理與方法

2.1 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)與掩模遮攔方案

本實驗采用透射式光學(xué)元件的掃描型波前探測系統(tǒng)，采用SHWS 完成波前像差測量。系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖1 所示，中心波長為830 nm 的單模光纖耦合激光器LD（SFOLT, FC-830-030-SM, 光譜線寬FWHM<2 nm）發(fā)出的光束經(jīng)準(zhǔn)直后由光闌(diaphragm)調(diào)制為7 mm 孔徑光束，經(jīng)分光鏡BS1（透反比50∶50）反射至平面反射鏡(reflector)。雙膠合消色差透鏡AL1 和AL2 起到調(diào)制光束直徑的作用，并且能夠最大限度地校正系統(tǒng)球差。高速掃描振鏡G1（CTI, CRS）用以完成水平方向的光點掃描，其掃描頻率為8 kHz。非球面透鏡L1 和L2 的直徑相匹配，可以維持良好的系統(tǒng)像差修正效果。掃描振鏡G2（Sunny, S-8107）用以完成豎直方向的光點掃描，其掃描頻率為50 Hz。光線經(jīng)過G2 后依次經(jīng)過非球面透鏡L3 和非球面透鏡L4，最終進(jìn)入待測鼠眼瞳孔，經(jīng)眼底視網(wǎng)膜散射后，信標(biāo)光沿光軸原路返回，經(jīng)分光鏡BS1 透射，進(jìn)入BS2（透反比為50∶50），再經(jīng)BS2 反射后進(jìn)入波前傳感器SHWS，完成鼠眼的波前像差測量。

圖1 鼠眼波前像差探測系統(tǒng)示意圖Fig.1 Schematic diagram of mouse eye wavefront detection system

圖1 中，SHWS 的微透鏡陣列焦距為5.6 mm，微透鏡間距為150 μm，厚度為1.2 mm，尺寸為10 mm×10 mm。通過CMOS 面陣相機（BASLER acA1300-60gm）記錄光斑。對于2 mm 直徑的小鼠瞳孔，波前傳感器可獲取18×18 的波前光斑圖像，利用傳統(tǒng)的質(zhì)心算法最終復(fù)原得到小鼠的波前像差，以標(biāo)準(zhǔn)35 階Zernike 多項式進(jìn)行描述。

具體地，如圖2（彩圖見期刊電子版）所示，在體鼠眼波前像差測量時，視網(wǎng)膜雙反射層結(jié)構(gòu)會同時反射回兩束信標(biāo)光，SHWS 的相機靶面同時接收到這兩束信標(biāo)光，導(dǎo)致每個子孔徑內(nèi)的光斑點陣互有重疊，無法完成波前測量。通過仿真分析發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜雙層反射回來的信標(biāo)光束，在光路中間存在分離現(xiàn)象，其中，在L1 和L2 之間的焦面附近，兩束信標(biāo)光的分離距離最大。因此，本文提出在該位置設(shè)置光學(xué)掩模，以對視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光束進(jìn)行遮擋，如圖1 所示。該光學(xué)掩模為中心透光小孔，其通過透明玻璃基底上鍍制黑色遮光材料制成。掩模的遮光區(qū)域是沿光軸孔徑以外的所有區(qū)域，確保進(jìn)入SHWS 的光線為沿光軸傳輸攜帶視網(wǎng)膜目標(biāo)層信息的信標(biāo)光，從而提高波前測量精度。

圖2 鼠眼視網(wǎng)膜雙層反射原理示意圖Fig.2 The principle diagram of retinal double layer reflection in mouse eye

2.2 系統(tǒng)仿真分析

通過光學(xué)設(shè)計軟件Zemax OpticStudio 進(jìn)行系統(tǒng)仿真，首先，根據(jù)各項參數(shù)[28-29]在序列模式下建立鼠眼光學(xué)模型，包括鼠眼角膜、晶狀體、視網(wǎng)膜的厚度、折射率及前后曲率等參數(shù)，如表1 所示。其中關(guān)鍵參數(shù)包括：視網(wǎng)膜厚度t= 0.22 mm，視網(wǎng)膜焦距f1= 46.54 mm 以及鼠眼焦距f2=1.96 mm。

表1 Zemax 鼠眼模型參數(shù)Tab.1 Zemax parameters of the mouse eye model

由于對于鼠眼視網(wǎng)膜光束的散射特性尚無具體模型，本研究考慮以鼠眼視網(wǎng)膜的雙層反射為標(biāo)準(zhǔn)，在非序列模式下，建立起視網(wǎng)膜—波前傳感器的雙光源逆向光學(xué)模型。首先設(shè)置相距0.22 mm的2 個圓形標(biāo)準(zhǔn)面光源以模擬視網(wǎng)膜雙層反射光（層2 在前，層1 在后），并在層2 后放置焦距為46.54 mm 的近軸透鏡以模擬視網(wǎng)膜焦距（圖2 中未示出）、層1 后放置焦距為1.97 mm 的近軸透鏡以模擬眼球，然后根據(jù)探測系統(tǒng)的光學(xué)元件依次完成建模，由波前傳感器SHWS 采集模擬鼠眼波前像差。

仿真中，未使用光學(xué)掩模時，SHWS 采集到的光斑點陣同時含有雙層反射信標(biāo)光，每個子孔徑內(nèi)的光斑點陣重疊嚴(yán)重，如圖3(a)所示。光斑點陣的列截面輻照度分布如圖3(b)所示，縱坐標(biāo)數(shù)值經(jīng)歸一化處理，橫坐標(biāo)代表光斑在相機感光芯片上的位置，單位為毫米?？梢园l(fā)現(xiàn)，由于視網(wǎng)膜的雙層反射作用，光軸附近的輻照度顯著增加，峰值輻照度約為邊緣處峰值的1.5 倍，且邊緣孔徑處會出現(xiàn)兩個輻照度峰值，在相機靶面上表現(xiàn)為點陣混疊，這會直接影響波前測量的精確度，導(dǎo)致波前測量失效。

圖3 無掩模時的波前點陣采集圖Fig.3 Wavefront spot array diagram without mask

如圖1 所示，在非球面透鏡L1 與L2 之間的焦面位置處設(shè)置光學(xué)掩模，掩模的預(yù)設(shè)通光孔徑分別為0.2 mm、0.5 mm 和0.8 mm，放入不同孔徑掩模后，SHWS 采集到的波前點陣圖及其列截面圖，分別如圖4(a)～4(f)所示，其中列截面圖均已做歸一化處理。

圖4 不同孔徑掩模的波前點陣圖及歸一化的列截面圖。(a)、(b) 0.2 mm 孔徑掩模；(c)、(d) 0.5 mm 孔徑掩模；(e)、(f) 0.8 mm孔徑掩模Fig.4 Wavefront spot array with different aperture masks and normalized column cross sections.(a), (b) Mask with 0.2 mm aperture; (c), (d) mask with 0.5 mm aperture; (e), (f) mask with 0.8 mm aperture

可以明顯地看出，使用光學(xué)掩模進(jìn)行遮攔后，鼠眼視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光束被有效阻攔，不會進(jìn)入波前探測器，波前光斑點陣圖的子孔徑內(nèi)光斑銳利，并且?guī)缀鯖]有重疊。結(jié)合波前點陣圖的列截面輻照度分布進(jìn)行分析，得出以下結(jié)論：3 種不同孔徑大小的光學(xué)掩模對視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光均具有遮攔效果，且隨著孔徑的增加，非目標(biāo)層反射光的遮擋有效區(qū)域有所下降，0.2 mm 孔徑掩模可以實現(xiàn)對93.75%非目標(biāo)層反射光的有效遮攔，另外兩種孔徑分別可以實現(xiàn)81.94%和66.36%的有效遮攔。因此，由仿真分析結(jié)果可知，0.2 mm孔徑的光學(xué)掩模的遮攔效果最佳，但是，考慮到安裝精度及容錯率等因素，本文采用0.5 mm 孔徑的光學(xué)掩模開展實驗。

3 實驗與分析

3.1 系統(tǒng)標(biāo)定與實驗準(zhǔn)備

采用如圖1 所示的波前探測系統(tǒng)，實驗開始前，使用模擬鼠眼完成系統(tǒng)標(biāo)定，模擬鼠眼的波前探測結(jié)果，如圖5（彩圖見期刊電子版）所示，其中，圖5(c)中縱軸代表光斑歸一化灰度值（光斑沿(a)中虛線位置采集），橫軸代表光斑位置。由于模擬鼠眼的眼底為單層反射結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)采集的波前光斑銳利、均勻、無重疊，系統(tǒng)的波前像差RMS 值為0.017λ，表明系統(tǒng)本身像差極小，可以忽略，不會對實際鼠眼像差測量結(jié)果引入系統(tǒng)誤差。

圖5 模擬鼠眼波前采集圖Fig.5 Simulated mouse eye wavefront acquisition diagrams

隨后，準(zhǔn)備4 只12 周的C57BL/6J 黑色小鼠組成實驗組，進(jìn)行波前像差測量實驗。備有保溫墊或加熱墊，防止實驗過程中小鼠因失溫而造成的生理功能下降；同時備以生理鹽水滴管，維持角膜水合防止晶狀體混濁。根據(jù)1 ml/100 g 的劑量對實驗小鼠依次注射濃度為4%的水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉，時間為5 min，麻醉后左右眼各使用一滴濃度為0.5%的托吡卡胺和鹽酸去氧腎上腺素溶液將其瞳孔散開至2 mm，然后放置在XYZ三軸位移臺上開展波前像差探測實驗。

3.2 在體鼠眼波前測量

利用圖1 所示的波前像差探測系統(tǒng)，對4 只小鼠共8 只眼睛開展波前像差測量實驗。其中，1 只小鼠的左眼存在白內(nèi)障，1 只小鼠的右眼視力嚴(yán)重缺陷，波前像差數(shù)據(jù)偏差巨大，最終將4 只小鼠共6 只眼的波前像差測量數(shù)據(jù)納入統(tǒng)計分析。

如上所述，來自鼠眼視網(wǎng)膜的非目標(biāo)層反射光與目標(biāo)層信標(biāo)光同時進(jìn)入SHWS，導(dǎo)致鼠眼波前像差采集時每個子孔徑內(nèi)的光斑發(fā)生重疊，具體表現(xiàn)為采集到的Zernike 像差多項式系數(shù)中低階成分居多且數(shù)值較大，即像差測量誤差較大、波前測量結(jié)果失準(zhǔn)。此外，由于系統(tǒng)是掃描型系統(tǒng)，波前探測器的相機接收到的信息為多個子光斑混合在一起的總光斑信息，雙層反射光斑的疊加表現(xiàn)為波前像差峰谷（P-V）值的增加及波前像差均方根（RMS）值的增加。當(dāng)波前探測器只接收到目標(biāo)層視網(wǎng)膜的反射信標(biāo)光時，不受雙層反射

統(tǒng)計采集到的鼠眼波前像差數(shù)據(jù)后，比較分析得出：不使用光學(xué)掩模時，納入統(tǒng)計的鼠眼波前像 差 平 均P-V 值 約 為2.933 μm（3.53λ），平 均RMS 值約為0.639 μm（0.77λ）；而使用掩模后的鼠眼波前像差平均P-V 值約為0.709 μm（0.85λ），平均RMS 值約為0.160 μm（0.19λ）。6 只鼠眼的光斑疊加的影響，波前像差的P-V 值、RMS 值均會下降，像差測量精度得到提升。

為了直觀顯示波前測量效果，隨機選取有效數(shù)據(jù)中的一只鼠眼波前測量結(jié)果為例進(jìn)行分析，其添加光學(xué)掩模前后的波前點陣圖及中心光斑歸一化灰度圖如圖6（彩圖見期刊電子版）所示。其中，圖6(b)、6(e)中縱軸代表光斑歸一化灰度值（光斑沿6(a)、6(d)中虛線位置采集），橫軸代表光斑位置。結(jié)果顯示，未使用掩模調(diào)制時，圖6(b)中各子孔徑光斑峰值差異較大，中心峰值約為兩側(cè)峰值的1.3～2 倍，與仿真模擬的1.5 倍峰值差異近似。此外，由部分峰值曲線可以得知光斑重疊現(xiàn)象嚴(yán)重，表現(xiàn)為更高的P-V 值和RMS 值，導(dǎo)致波前像差測量失效。使用0.5 mm 孔徑掩模調(diào)制后，圖6(e)中，除中心區(qū)域外，兩側(cè)區(qū)域峰值差異明顯降低，(d)中各個子孔徑內(nèi)亮度較為均勻，即除去了視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光的影響，更小的P-V 值和RMS 值也驗證了掩模調(diào)制方案的有效性。35 階Zernike 波前像差各項系數(shù)如圖7、圖8（彩圖見期刊電子版）所示，其中顏色代表Zernike 像差的階次，其中一階像差和二階像差（前五項）統(tǒng)稱為低階像差，其余項則為高階像差。需要注意的是，低階像差和高階像差使用不同的刻度值，圖中誤差棒代表±2 倍的標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。

圖7 無掩模時，6 只鼠眼的Zernike 多項式系數(shù)均值分布圖，誤差棒為±2 SEFig.7 Mean distribution of Zernike polynomial coefficients in 6 mouse eyes without mask, error bar:±2 SE

圖8 有掩模時，6 只鼠眼的Zernike 多項式系數(shù)均值分布圖，誤差棒為±2 SEFig.8 Mean distribution of Zernike polynomial coefficients in 6 mouse eyes with mask, error bar: ±2 SE

分析數(shù)據(jù)可得，使用掩模后測得的鼠眼波前像差Zernike 多項式系數(shù)的RMS 值從0.639 μm（0.77λ）下降至0.160 μm（0.19λ），下降74.93%，接近仿真分析有效遮攔的80%。其中，有效遮攔區(qū)域可以用于定量描述鼠眼視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光束的遮攔效果，有效遮攔區(qū)域越高意味著鼠眼視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光的影響越小，波前像差測量越準(zhǔn)確，例如實現(xiàn)100%有效遮攔時，可被視為對鼠眼視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光的遮攔效果最理想。而存在的部分遮攔失效，主要源于視網(wǎng)膜實際的散射光束效應(yīng)，散射光束與仿真分析采用的反射光束本身存在一定的誤差，經(jīng)過實際測量統(tǒng)計，該誤差值較小，表明采用光學(xué)掩模調(diào)制后，在體鼠眼的波前測量精度得到有效提升。

4 結(jié) 論

針對鼠眼視網(wǎng)膜雙層反射光重疊導(dǎo)致的波前像差探測失效問題，本文經(jīng)過仿真分析發(fā)現(xiàn)雙層反射光束在探測系統(tǒng)光路中存在位置分離?；诖耍疚奶岢鲆环N結(jié)合光學(xué)掩模調(diào)制的鼠眼像差測量方法，可以直接遮攔視網(wǎng)膜非目標(biāo)層的反射光束，允許鼠眼視網(wǎng)膜目標(biāo)層的反射光完成波前測量。結(jié)合仿真分析結(jié)果，不同孔徑尺寸的掩模對視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光的遮攔效果不同，隨著孔徑尺寸的增加，遮攔效果逐漸下降?？紤]到實驗安裝精度的限制，選擇通光孔徑為0.5 mm 的掩模，可以實現(xiàn)SHWS 探測器接收面上80%左右的區(qū)域不受視網(wǎng)膜非目標(biāo)層反射光的影響。小鼠的在體波前像差測量數(shù)據(jù)表明，通光孔徑為0.5 mm 的掩?？梢允共ㄇ皽y量時各項像差系數(shù)的RMS 值降低約74.9%，與仿真結(jié)果相近。本文所提方法有效提升了鼠眼波前像差測量精度，為進(jìn)一步實現(xiàn)鼠眼高分辨率成像奠定了基礎(chǔ)。