王適 胡立志 王珊 左姿 王敏

急性軟組織損傷是臨床常見的運(yùn)動(dòng)損傷,其特點(diǎn)是疼痛、局部水腫、瘀傷、肌纖維斷裂和肢體活動(dòng)障礙[1]。此外,此類損傷可造成局部皮下軟組織出現(xiàn)一系列急性挫傷或/和撕裂,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[2]。目前,針對(duì)急性軟組織損傷的治療主要以對(duì)癥處理為主,仍無特效藥。西醫(yī)多通過聯(lián)合應(yīng)用西藥來改善患者疼痛,減輕腫脹,雖然有一定療效,但弊端也日漸明顯[3]。因此,開發(fā)安全高效的藥物來改善急性軟組織損傷具有重要的意義?；鲋雇促N膏為湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑,具有化瘀解毒,消腫止痛之功效。已有研究報(bào)道,化瘀止痛貼膏治療急性軟組織損傷所致肢體腫痛患者的臨床效果良好[4]。但具體機(jī)制尚不明確。相關(guān)研究顯示,抑制Wnt/β-連環(huán)蛋白(β-catenin)通路可減輕膝骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨組織損傷[5]。但化瘀止痛貼膏能否通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路改善大鼠急性軟組織損傷尚不明確。因此,本研究主要探究化瘀止痛貼膏對(duì)急性軟組織損傷大鼠的影響以及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 96只雄性SD大鼠(210～220 g),6周齡,由廣東萊迪生物醫(yī)藥研究院有限公司提供,生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(粵)2022-0064。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)本院動(dòng)物保護(hù)與使用委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 主要試劑 化瘀止痛貼膏醫(yī)院自制;精制狗皮膏購(gòu)自重慶陪都藥業(yè)股份有限公司;氯化鋰(Lithium chloride monohydrate,LiCl)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;大鼠腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β ELISA試劑盒均購(gòu)自上海烜雅生物科技有限公司;兔源一抗Wnt-16、β-catenin、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-3、MMP-13、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)、GAPDH及辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.3 急性軟組織損傷大鼠模型的構(gòu)建 2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,脫去大鼠右側(cè)大腿毛發(fā),將大鼠仰臥位固定,在大鼠右后肢下墊海綿墊以防骨折,再用500 g砝碼連續(xù)6次自20 cm處高度垂直自由落下?lián)舸虼笫蟠笸裙侵奔〔课?以構(gòu)建急性軟組織損傷大鼠模型[6]。若觀察到大鼠受傷后一直保持后肢肌肉腫脹狀態(tài)則視為模型構(gòu)建成功。

1.4 動(dòng)物分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法將96只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、化瘀止痛貼膏低劑量組、化瘀止痛貼膏中劑量組、化瘀止痛貼膏高劑量組、精制狗皮膏組、LiCl(Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活劑)組、化瘀止痛貼膏高劑量+LiCl組,每組12只。除對(duì)照組外,其他組大鼠均需按照1.3所述方法構(gòu)建急性軟組織損傷模型。建模成功后,進(jìn)行給藥處理。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,化瘀止痛貼膏低劑量組、化瘀止痛貼膏中劑量組、化瘀止痛貼膏高劑量組大鼠分別于造模部位貼敷劑量為0.16 g/貼、0.32 g/貼、0.64 g/貼的化瘀止痛貼膏,且均需尾靜脈注射等量的0.9%氯化鈉溶液;精制狗皮膏組[7]大鼠需在造模部位貼敷劑量為1.05 g/貼的精制狗皮膏,且還需尾靜脈注射等量的0.9%氯化鈉溶液;LiCl組[8]大鼠需尾靜脈注射15 mg/kg LiCl且需在造模部位貼敷不含藥的空白凝膠貼膏;化瘀止痛貼膏高劑量+LiCl組需在造模部位貼敷劑量為0.64 g/貼的化瘀止痛貼膏,且還需尾靜脈注射15 mg/kg LiCl;對(duì)照組、模型組大鼠需在造模部位貼敷不含藥的空白凝膠貼膏且還需尾靜脈注射等量的0.9%氯化鈉溶液,給藥1次/d,持續(xù)1周。

1.5 標(biāo)本收集 末次處理24 h后,每組選取全部大鼠,進(jìn)行軟組織損傷評(píng)分;軟組織損傷評(píng)分結(jié)束后,2%戊巴比妥鈉麻醉并處死大鼠,收集大鼠軟組織損傷組織,分為2部分,每部分包含6只大鼠的軟組織損傷組織,一部分浸入4%多聚甲醛中用于HE染色,另一部分儲(chǔ)存在液氮中用于ELISA、qRT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)。

1.6 大鼠軟組織損傷評(píng)分 通過皮膚顏色、肌肉腫脹、皮下瘀血、疼痛反應(yīng)等幾個(gè)方面的變化來評(píng)估急性軟組織損傷情況。(1)皮膚顏色:2分為暗紫色,1分為暗紅色,0分為膚色正常。(2)肌肉腫脹:2分為肌肉明顯腫脹,1分為肌肉略有腫脹,0分為肌肉無腫脹。(3)皮下瘀血:2分為瘀血面積1～2 cm2,1分為瘀血面積0～1 cm2,0分為無瘀血。(4)疼痛反應(yīng):2分為觸損傷處皮膚疼痛反應(yīng)明顯,1分為觸損傷處皮膚疼痛反應(yīng)輕,0分無疼痛反應(yīng),觀察并統(tǒng)計(jì)總分。

1.7 HE染色檢測(cè)大鼠軟組織損傷組織病理變化 將固定在4%多聚甲醛中的軟組織損傷組織包埋在石蠟中,并切成5 μm厚的切片,經(jīng)HE染色后。利用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠軟組織損傷組織病理變化。

1.8 ELISA法檢測(cè)大鼠急性軟組織損傷組織中TNF-α、IL-1β含量 嚴(yán)格按照試劑盒說明書步驟檢測(cè)大鼠急性軟組織損傷組織中TNF-α、IL-1β含量。

1.9 qRT-PCR 檢測(cè)大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA表達(dá) 用TRIzol試劑提取大鼠急性軟組織損傷組織勻漿總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。以GAPDH為內(nèi)參基因,通過2-ΔΔCt法計(jì)算Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA的表達(dá)水平。見表1。

1.10 Western blot檢測(cè)大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 蛋白表達(dá) 使用RIPA緩沖液從大鼠急性軟組織損傷組織中提取總蛋白,將蛋白質(zhì)經(jīng)定量、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后,將膜分別與一抗Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2、GAPDH在4℃下過夜孵育,再與二抗共同孵育2 h,使用ECL試劑可視化蛋白質(zhì)條帶,利用Image J軟件評(píng)估蛋白條帶灰度。

2 結(jié)果

2.1 化瘀止痛貼膏對(duì)8組大鼠軟組織損傷評(píng)分的影響 與對(duì)照組比較,模型組大鼠軟組織損傷評(píng)分升高(P<0.05);與模型組比較,化瘀止痛貼膏低劑量組、化瘀止痛貼膏中劑量組、化瘀止痛貼膏高劑量組、精制狗皮膏組大鼠軟組織損傷評(píng)分降低(P<0.05);與模型組比較,LiCl組大鼠軟組織損傷評(píng)分升高(P<0.05);與化瘀止痛貼膏高劑量組比較,化瘀止痛貼膏高劑量+LiCl組大鼠軟組織損傷評(píng)分升高(P<0.05)。見表2。

表2 8組大鼠軟組織損傷評(píng)分比較 n=12,

2.2 化瘀止痛貼膏對(duì)8組大鼠急性軟組織損傷組織病理變化的影響 對(duì)照組大鼠軟組織形態(tài)正常,肌肉纖維結(jié)構(gòu)完整;模型組大鼠肌肉纖維結(jié)構(gòu)破壞,且可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);與模型組比較,化瘀止痛貼膏低劑量組、化瘀止痛貼膏中劑量組、化瘀止痛貼膏高劑量組、精制狗皮膏組大鼠軟組織病理損傷有所改善;與模型組比較,LiCl組大鼠軟組織病理損傷加劇;與化瘀止痛貼膏高劑量組比較,化瘀止痛貼膏高劑量+LiCl組大鼠軟組織病理損傷嚴(yán)重。見圖1。

圖1 8組大鼠急性軟組織損傷組織病理變化(HE染色×200)

2.3 化瘀止痛貼膏對(duì)8組大鼠急性軟組織損傷組織中TNF-α、IL-1β含量的影響 與對(duì)照組比較,模型組大鼠急性軟組織損傷組織中TNF-α、IL-1β含量升高(P<0.05);與模型組比較,化瘀止痛貼膏低劑量組、化瘀止痛貼膏中劑量組、化瘀止痛貼膏高劑量組、精制狗皮膏組大鼠急性軟組織損傷組織中TNF-α、IL-1β含量降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與模型組比較,LiCl組大鼠急性軟組織損傷組織中TNF-α、IL-1β含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與化瘀止痛貼膏高劑量組比較,化瘀止痛貼膏高劑量+LiCl組大鼠急性軟組織損傷組織中TNF-α、IL-1β含量升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 8組大鼠急性軟組織損傷組織中TNF-α、IL-1β含量比較 n=6,pg/mg,

2.4 化瘀止痛貼膏對(duì)各組大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,模型組大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA表達(dá)升高(P<0.05);與模型組比較,化瘀止痛貼膏低劑量組、化瘀止痛貼膏中劑量組、化瘀止痛貼膏高劑量組、精制狗皮膏組大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA表達(dá)降低(P<0.05);與模型組比較,LiCl組大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA表達(dá)升高(P<0.05);與化瘀止痛貼膏高劑量組比較,化瘀止痛貼膏高劑量+LiCl組大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)。見表4。

表4 8組大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA表達(dá)比較 n=6,

2.5 化瘀止痛貼膏對(duì)各組大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較,模型組大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與模型組比較,化瘀止痛貼膏低劑量組、化瘀止痛貼膏中劑量組、化瘀止痛貼膏高劑量組、精制狗皮膏組大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2蛋白表達(dá)降低(P<0.05);與模型組比較,LiCl組大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05);與化瘀止痛貼膏高劑量組比較,化瘀止痛貼膏高劑量+LiCl組大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2蛋白表達(dá)升高(P<0.05)。見圖2,表5。

圖2 Western blot檢測(cè)大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2蛋白;A 對(duì)照組;B 模型組;C 化瘀止痛貼膏低劑量組;D 化瘀止痛貼膏中劑量組;E 化瘀止痛貼膏高劑量組;F 精制狗皮膏組;G LiCl組;H 化瘀止痛貼膏高劑量+LiCl組

表5 8組大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2蛋白表達(dá)比較 n=6,

3 討論

急性軟組織損傷的主要病理變化是外傷性無菌性炎癥,表現(xiàn)為毛細(xì)血管擴(kuò)張、局部組織壞死、水腫和出血[9]。近年來,通過使用鈍器創(chuàng)傷構(gòu)建急性軟組織損傷模型的研究數(shù)量有所增加。在本研究中,我們使用500 g砝碼連續(xù)6次自20 cm處高度垂直自由落下?lián)舸虼笫蟠笸裙侵奔〔课灰詷?gòu)建急性軟組織損傷模型,結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對(duì)照組比較,模型組大鼠軟組織損傷評(píng)分升高,肌肉纖維結(jié)構(gòu)破壞,且可見大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),表明急性軟組織損傷大鼠模型構(gòu)建成功。TNF-α、IL-1β是常見的促炎性因子,已有研究報(bào)道,降低損傷組織中TNF-α、IL-1β含量可改善急性軟組織損傷大鼠炎性反應(yīng)[10]。本研究結(jié)果與其是一致的,本研究顯示,與對(duì)照組比較,模型組大鼠急性軟組織損傷組織中TNF-α、IL-1β含量升高,表明急性軟組織損傷大鼠存在炎性反應(yīng)。

化瘀止痛貼膏由黃柏、赤芍、大黃、白芍、當(dāng)歸、梔子、石膏、牡丹皮、柴胡、黃芩、紅花、姜黃、香附、龍膽共十四味中藥組成。方中黃柏為君藥,具有燥濕瀉火解毒之功效[11];赤芍、大黃共為臣藥。大黃得赤芍直入血分,破血中之滯,起解毒療瘡之效。赤芍得大黃則祛瘀力宏。兩藥合用具有泄熱逐瘀,和營(yíng)止痛等功效[12]。剩余諸藥均為佐藥。縱觀全方,組方嚴(yán)謹(jǐn),配伍得當(dāng),不僅能達(dá)到化瘀解毒、消腫止痛等治療效果,且前瞻性的考慮到本病的轉(zhuǎn)變規(guī)律,亦可防治熱毒瘀久,耗液傷津。已有研究報(bào)道,化瘀止痛膏治療橈骨莖突狹窄性腱鞘炎效果顯著[13];化瘀止痛膏外敷治療外傷陳舊性關(guān)節(jié)炎效果明顯[14]。而關(guān)于化瘀止痛貼膏對(duì)急性軟組織損傷的影響鮮有報(bào)道。急性軟組織損傷歸屬于中醫(yī)學(xué)中的“傷筋、軟傷”范疇,損傷組織出血、凝血等過程均可影響損傷組織的修復(fù)[15]。本研究結(jié)果顯示,化瘀止痛貼膏可呈劑量依賴性地抑制急性軟組織損傷大鼠炎性反應(yīng),并改善軟組織病理損傷。提示局部外用化瘀止痛貼膏治療急性軟組織損傷可能通過改善損傷組織的微循環(huán),抑制損傷組織的炎性反應(yīng)而發(fā)揮作用。

Wnt家族蛋白Wnt-16可啟動(dòng)Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,β-catenin作為Wnt信號(hào)通路中的一個(gè)重要組成部分,被Wnt-16激活后,β-catenin的異常高表達(dá)水平調(diào)節(jié)著下游信號(hào)MMP-3、MMP-13和BMP-2的表達(dá),進(jìn)而參與疾病的進(jìn)展[16]。據(jù)報(bào)道,阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化可改善膝骨關(guān)節(jié)炎兔軟骨組織病理損傷[17];下調(diào)脾虛濕困模型大鼠小腸組織Wnt/β-catenin通路蛋白表達(dá),可修復(fù)腸道黏膜損傷,發(fā)揮益氣健脾利濕的功效[18];抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可減輕膿毒癥大鼠急性肺損傷[19];下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路可改善急性心肌梗死大鼠心肌損傷[20]。以上研究表明抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可抑制多種疾病的進(jìn)展。本研究結(jié)果與其是一致的,本研究顯示,與模型組比較,LiCl組大鼠急性軟組織損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA及蛋白表達(dá)升高,且大鼠炎性反應(yīng)及軟組織病理損傷加劇,表明Wnt/β-catenin信號(hào)通路確實(shí)參與了大鼠急性軟組織損傷過程。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),化瘀止痛貼膏可呈劑量依賴性地抑制急性軟組織損傷大鼠損傷組織中Wnt-16、β-catenin、MMP-3、MMP-13、BMP-2 mRNA及蛋白表達(dá),推測(cè)化瘀止痛貼膏可能通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路改善大鼠急性軟組織損傷。為了驗(yàn)證該推測(cè),本研究在高劑量化瘀止痛貼膏作用的基礎(chǔ)上再加上Wnt/β-catenin信號(hào)通路激活劑LiCl來干預(yù)急性軟組織損傷大鼠,結(jié)果顯示,LiCl減弱了高劑量化瘀止痛貼膏對(duì)急性軟組織損傷大鼠炎性反應(yīng)及軟組織病理損傷的改善作用,證實(shí)了猜想的正確性,即化瘀止痛貼膏可能通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路改善大鼠急性軟組織損傷。

綜上所述,化瘀止痛貼膏可能通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路改善大鼠急性軟組織損傷?；鲋雇促N膏對(duì)大鼠急性軟組織損傷的改善作用可能還涉及其他通路,本研究尚未探究,這將是下一步研究的重要內(nèi)容之一。