王碩 張晉 邱昌龍

華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 河北唐山 063000

麻黃附子甘草湯作為仲景經(jīng)方的代表,在《傷寒論》、《金匱要略》中均有論述?！秱摗?02條有云:“少陰病,得之二三日,麻黃附子甘草湯微發(fā)汗。以二三日無里證,故微發(fā)汗也。麻黃附子甘草湯方,麻黃二兩(去節(jié)),甘草二兩 (炙),附子一枚 (炮,去皮),右三味,以水七升,先煮麻黃一兩沸,去上沫,內(nèi)諸藥,煮取三升,去滓,溫服一升,日三服[1]?！薄督饏T要略水氣病脈證并治第十四》中16條原文則說:“水之為病,其脈沉小,屬少陰;浮者為風(fēng),無水虛脹者為氣;水,發(fā)其汗即已。脈沉者宜麻黃附子湯;浮者宜杏子湯。麻黃附子甘草湯方,麻黃三兩甘草二兩,附子一枚(炮),右三味,以水七升,先煮麻黃,去上沫,內(nèi)諸藥,煮取二升半,溫服八分,日三服[2]?！痹膬煞浇M成各有不同,歷代醫(yī)家紛述頗多,但針對原文方藥論述的使用結(jié)合仲景方藥理論認(rèn)識,諸多醫(yī)家提出了本方病癥及方藥配伍使用的分析,例如,閆朝光等[3]認(rèn)為麻黃附子甘草湯主要治療少陰寒化、脈微、手足涼且無明顯里證表證的病癥態(tài)。劉賓[4]就認(rèn)為麻黃附子甘草湯證的主要病機(jī)為肝膽樞機(jī)不利,中下二焦 (即少陰心腎、足太陰脾)不足,病位在太陽、少陰,外感風(fēng)寒循經(jīng)入里但未化熱,出現(xiàn)脈沉,津液輸布不暢出現(xiàn)水腫,陽氣虧虛的同時伴有陽氣虛浮存在,方用甘草斂降浮陽,炮附子溫補(bǔ)下焦,麻黃宣散肝膽氣機(jī),促陽氣外達(dá)以祛風(fēng)寒。三藥配伍,共同起到散寒不傷正氣、斂降以防虛浮的目的”。而在臨床實踐中,依據(jù)麻黃附子甘草湯證方證特點,在經(jīng)方原文的基礎(chǔ)上,不斷擴(kuò)大臨證疾病范圍,逐步形成了麻黃附子甘草湯臨床應(yīng)用特點,例如程廣里[5-6]老先生在臨床治療中就發(fā)現(xiàn)冠心病尤其出現(xiàn)心動過緩、心律不齊、低血壓時使用麻黃附子甘草湯效果佳。萬迎來[7]老先生運(yùn)用麻黃附子甘草湯加減治療怔忡(病毒性心肌炎導(dǎo)致的心動過緩、房室傳導(dǎo)阻滯)、內(nèi)傷失音癥、水腫等病效果較好。

冠心病(coronary heart disease簡稱CHD)是冠狀動脈粥樣硬化病變引起的血管管腔狹窄甚至阻塞而造成心肌梗死、心律不齊、心動過緩等癥狀的常見多發(fā)慢性病之一。我國CHD患者人數(shù)持續(xù)上升且逐漸年輕化[8]?！吨袊难芙】抵笖?shù)2023版》(CHI) 指出中國心血管健康7年提高10分,要想繼續(xù)提高甚至接近滿分,更應(yīng)從治未病角度來改善心血管健康狀況入手,中醫(yī)藥可以發(fā)揮更大的作用[9]。本文結(jié)合諸多醫(yī)家認(rèn)識,以麻黃附子甘草湯和冠心病作為研究對象,運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)進(jìn)行其相關(guān)機(jī)制的探究,現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1麻黃附子甘草湯方中藥物主要活性成分及靶點的篩選 在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺即TCMSP(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php)分別搜索麻黃、附子、甘草并且以口服生物利用度(OB)≥30%[10]和類藥性(DL)≥0.18[11]為條件篩選出藥物活性成分的靶點。在PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中用TCMSP的CAS號找到Canonical SMILES結(jié)構(gòu),并在Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)中找到核心靶點,無對應(yīng)的可以在UniProt(https://www.uniprot.org/)中找出相對應(yīng)的Uniprot id和Common name,最后在Excel表格中刪除除重復(fù)靶點,得到方中藥物活性成分的靶點并保存。

1.2疾病靶點收集 在Gene Card(https://www.genecards.org/)、Disgenet(https://www.disgenet.org/)、OMIM(https://omim.org/)和TTD(https://db.idrblab.net/ttd/)四個數(shù)據(jù)庫中用關(guān)鍵詞“coronary heart disease”篩選出冠心病的相關(guān)靶點,并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。

1.3藥物-疾病靶點收集 用交集映射的方式得到麻黃附子甘草湯及冠心病的共同靶點,并在微生信平臺(https://www.bioinformatics.com.cn/)中制作出相應(yīng)的Venn圖。

1.4構(gòu)建麻黃附子甘草湯-冠心病的PPI網(wǎng)絡(luò) 在STRING(https://cn.string-db.org/)數(shù)據(jù)庫中輸入交集靶點種類為“Homo sapiens”,最小互交分?jǐn)?shù)設(shè)為0.400,得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖。在Cytoscape3.9.1軟件中輸入交集靶點在CytoNCA插件中選擇Degree,得到Degree值從大到小排列的靶點,再根Degree值分層做PPI可視圖,Degree值越大圖像越大越靠近核心區(qū)域。

1.5構(gòu)建疾病-藥物-活性成分靶點圖 在Excel中分類整理各個中藥對疾病發(fā)揮作用的靶點并傳入到Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建疾病-藥物-活性成分靶點圖。

1.6GO富集分析、KEGG通路分析 將共同作用靶點錄入DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)中得到富集分析數(shù)據(jù)并根據(jù)P值由大到小分別篩選出部分條目,利用微生信平臺(https://www.bioinformatics.com.cn/)繪制GO富集分析條狀圖和KEGG通路分析氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1方中藥物活性成分 共對CHD發(fā)揮作用的活性成分118個,其中附子有6個,麻黃有23個,甘草有89個,各中藥口服生物利用度前3位的主要活性成分為甘草:甘草酚、甘草酸、甘草吡喃香豆素。麻黃:圣草酚、白天竺葵苷、兒茶素。附子:烏頭堿、去甲烏頭堿、水黃皮素。

2.2藥物-疾病靶點Venn圖的建立 藥物的活性成分經(jīng)過Uniprot標(biāo)準(zhǔn)化處理后得到245個有效靶基因,在 Gene Card、Disgenet、OMIM和TTD數(shù)據(jù)庫中得到CHD的靶點基因6818個,以此構(gòu)建Venn圖,獲得189個麻黃附子甘草湯治療冠心病的共同靶基因,見圖1。

圖1 附子甘草湯治療冠心病的共同靶基因

2.3PPI關(guān)鍵基因靶點圖及分析 把交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫中得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖,見圖2,其中包括140個節(jié)點1826條邊。再把導(dǎo)出的文件輸入到Cytoscape3.9.1軟件內(nèi)得到Degree值分層圖,見圖3。由圖可以預(yù)測出189個關(guān)鍵靶點中Degree值排名前10的靶點有RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、腫瘤壞死因子、白細(xì)胞介素-6、白細(xì)胞介素-1β、TP53結(jié)合蛋白1、雌激素受體、基質(zhì)金屬蛋白酶-9、半胱天冬酶-3、信號換能器和轉(zhuǎn)錄激活器 3、前列腺素 G/H 合酶 2。

圖2 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 Degree值分層圖

2.4疾病-藥物-活性成分靶點圖的構(gòu)建 在Excel中分類整理得到麻黃作用于CHD有276個關(guān)鍵靶點,甘草作用于CHD有1063個關(guān)鍵靶點,附子作用于CHD有9個關(guān)鍵靶點,把匯總的靶點傳入到Cytoscape3.9.1軟件構(gòu)建疾病-藥物-活性成分靶點圖,見圖4。圖中三角形代表疾病CHD,圓形代表單味中藥及其活性成分,箭頭代表交集靶點基因。

圖4 疾病-藥物-活性成分靶點圖

2.5GO富集分析 進(jìn)行GO富集分析后,參與生物學(xué)過程(BP)的有762條,細(xì)胞組分(CC)98個,分子功能(MF)142個。根據(jù)PValue值由大到小進(jìn)行排列后選取前10位進(jìn)行可視化作圖。圖中橫坐標(biāo)為GO名稱,綠色代表BP,橘色代表CC,紫色代表MF,縱坐標(biāo)為富集的基因數(shù),見圖5。結(jié)果顯示麻黃附子甘草湯在治療CHD時作用靶點參與生物學(xué)過程主要富集在對基因表達(dá)的正向調(diào)節(jié);對細(xì)胞凋亡過程的負(fù)向調(diào)節(jié);對異生物刺激的反應(yīng);對轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié)及DNA誘導(dǎo);細(xì)胞對缺氧的反應(yīng);對細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié);對RNA聚合酶II啟動子轉(zhuǎn)錄的正向調(diào)節(jié);對細(xì)胞凋亡過程的正向調(diào)節(jié);對細(xì)胞遷移的正向調(diào)節(jié)。細(xì)胞組分主要分布在大分子復(fù)合體、質(zhì)膜蛋白復(fù)合物、線粒體、RNA 聚合酶 II 轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、突觸后膜、漿膜等。富集比較明顯的分子功能酶結(jié)合、RNA 聚合酶 II 轉(zhuǎn)錄因子活性、配體激活的序列特異性 DNA 結(jié)合、同源蛋白結(jié)合、蛋白同源二聚化活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、 細(xì)胞因子活性、類固醇激素受體活性、蛋白激酶結(jié)合等方面有關(guān)。

圖5 根據(jù)PValue值由大到小進(jìn)行排列后選取前10位進(jìn)行可視化作圖

2.6KEGG富集分析 KEGG富集分析得到178條通路,按照富集基因數(shù)進(jìn)行排列后對基因數(shù)前25的條目進(jìn)行可視化處理圖6,其中氣泡越大表示富集基因越多,氣泡越小表示富集基因越少,氣泡的顏色代表P值大小。結(jié)果表明,麻黃附子甘草湯治療CHD的靶點主要集中在癌癥通路、脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號通路,乙型肝炎,流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化,IL-17信號通路,PI3K-Akt信號通路,Th17細(xì)胞分化,非小細(xì)胞肺癌,內(nèi)分泌抵抗,TNF信號通路等多種途徑。

圖6 按照富集基因數(shù)進(jìn)行排列后對基因數(shù)前25的條目進(jìn)行可視化處理

3 討論

在中醫(yī)學(xué)中CHD屬于“胸痹”的范疇,《金匱要略》將胸痹的病機(jī)概括為陽微陰弦,總為上焦陽氣衰微,陰邪上犯。CHD可以屬于“胸痹”“心痛”“真心痛”等的范疇之中[12]。隨著環(huán)境及生活習(xí)慣的變化,近來眾多研究及臨床實踐證明,中醫(yī)認(rèn)為本病發(fā)生多基于痰、瘀、熱、寒、郁[13]。

麻黃附子甘草湯由麻黃、附子、甘草三味藥物組成,其中麻黃最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》是麻黃科植物,包括草麻黃、中麻黃、木賊麻黃的草質(zhì)莖干燥制品[14],有發(fā)汗解表、宣肺平喘、利水消腫、散寒通滯之功效[15]。麻黃的主要成分是生物堿,其中麻黃堿有類似腎上腺素的交感神經(jīng)興奮作用,因此其發(fā)汗、平喘、利尿、升壓、抗過敏以及胰島素樣等興奮中樞的作用與其化學(xué)成分如麻黃堿、揮發(fā)油和多糖有關(guān)[16];此外麻黃還有鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化、抗凝血、免疫抑制、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗炎、抗病毒和抗菌、抗病原微生物、降血糖、促進(jìn)脂肪細(xì)胞脂肪合成等藥理作用[17]。附子最早記錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》,書中有言:“附子,一名莨,味辛,溫,有大毒。主風(fēng)寒咳逆邪氣,溫中,金瘡,破癥堅,積聚,血瘕,寒濕踒躄,拘攣,膝痛, 不能行步。生山谷”,張仲景善用附子,多用于陽虛陰寒濕盛證候,印證了上述附子的功效特點,可散寒氣,助陽氣[18];本品有強(qiáng)心、擴(kuò)張血管、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗?jié)儭⒖鼓[瘤、增強(qiáng)免疫、抗缺氧、抗寒冷等多種藥理作用[19]。麻黃-附子配伍,可有效抑制溶出兩者的有效成分,提升麻黃生物堿和苯甲酰烏頭原堿的生物利用度,新生成的單酯型生物堿含量降低,毒性降低,且具有抗炎、鎮(zhèn)痛的作用。麻黃-甘草配伍使用不僅可以減毒,還可以增效[20]。張仲景善用甘草,甘草用方在《傷寒論》中占62.5%,在《金匱要略》中占36.6%,具有補(bǔ)脾益氣、止咳、緩急止痛、清熱解毒、調(diào)和諸藥的功效[21]。甘草有抗消化性潰瘍、保肝、解痙、抗心律失常、鎮(zhèn)咳祛痰、解毒、抗炎、抗菌、抗病毒、抗變態(tài)反應(yīng)、腎上腺皮質(zhì)激素樣作用以及抗腫瘤、抗突變等多種藥理作用[19]。

本研究是通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測麻黃附子甘草湯治療CHD的主要機(jī)制,通過對藥物活性成分的探究發(fā)現(xiàn)甘草口服生物利用度排名前3位的主要活性成分甘草酚、甘草酸具有抗炎抗氧化從而增加冠脈血流、穩(wěn)定斑塊等保護(hù)心肌的作用,甘草吡喃香豆素可以有效保護(hù)神經(jīng),調(diào)節(jié)交感神經(jīng)和副交感神經(jīng)從而保護(hù)心臟。麻黃中圣草酚是一種黃酮類天然產(chǎn)物,具有抗氧化、抗炎和抗糖尿病作用還可以誘導(dǎo)Nrf2信號通路從而起到防止CHD的作用;白天竺葵苷是從白細(xì)胞介素中分離出來的,有激活、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞,介導(dǎo)T、B細(xì)胞活化、參與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞增殖與分化從而促進(jìn)心血管損傷修復(fù);兒茶素具有抗心血管、抗腫瘤、抗肥胖、抗糖尿病、抗感染、保肝和神經(jīng)保護(hù)作用。附子的活性分:烏頭堿、去甲烏頭堿可以抑制炎癥介質(zhì)的釋放改善毛細(xì)血管通透性;水黃皮素屬于黃酮類物質(zhì),可以通過對心肌細(xì)胞膜產(chǎn)生影響發(fā)揮保護(hù)心肌的作用。

在PPI關(guān)鍵蛋白中我們探究得知RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶可以促進(jìn)血管生成,調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖存活;腫瘤壞死因子可以調(diào)節(jié)T細(xì)胞反應(yīng)進(jìn)而作用于活化的T淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,促進(jìn)血管內(nèi)皮修復(fù);白細(xì)胞介素-6可以作用在免疫、組織再生和代謝方面;白細(xì)胞介素-1β促炎細(xì)胞因子,可以誘導(dǎo)前列腺素合成、中性粒細(xì)胞內(nèi)流和活化、T細(xì)胞活化和細(xì)胞因子產(chǎn)生、B細(xì)胞活化和抗體產(chǎn)生,以及成纖維細(xì)胞增殖和膠原蛋白產(chǎn)生;TP53結(jié)合蛋白1在DNA損傷修復(fù)中參與雙鏈斷裂蛋白修復(fù);雌激素受體屬于類固醇激素,參與細(xì)胞增殖和分化;基質(zhì)金屬蛋白酶-9在細(xì)胞外基質(zhì)的局部蛋白水解和白細(xì)胞遷移中起重要作用;半胱天冬酶-3參與細(xì)胞凋亡;信號換能器和轉(zhuǎn)錄激活器 3是炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)劑還可以參與細(xì)胞凋亡;前列腺素 G/H 合酶 2可以促進(jìn)前列腺素產(chǎn)生,在炎癥反應(yīng)中具有重要作用。

GO富集后可以觀察到CHD的生物過程主要與對基因表達(dá)的正向調(diào)節(jié)、對細(xì)胞凋亡過程的負(fù)向調(diào)節(jié)、對異生物刺激的反應(yīng)、細(xì)胞對缺氧的反應(yīng)、對細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)等相關(guān)。這說明麻黃附子甘草湯在促進(jìn)心肌細(xì)胞和血管再生、控制炎癥反應(yīng)等方面發(fā)揮重要作用。KEGG富集后分析顯示麻黃附子甘草湯治療CHD的主要作用通路富集于脂質(zhì)與動脈粥樣硬化、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、 IL-17信號通路、細(xì)胞凋亡等,這些通路在保護(hù)心肌,促進(jìn)細(xì)胞血管再生,降低動脈粥樣硬化方面有積極作用。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法預(yù)測麻黃附子甘草湯治療CHD的主要機(jī)制,得出結(jié)論麻黃附子甘草湯是多成分、多靶點、多途徑對冠心病進(jìn)行治療,體現(xiàn)了經(jīng)方治療的優(yōu)越性。但由于數(shù)據(jù)庫的信息尚不完全,且該研究僅在理論上證明其有效性,尚需要進(jìn)一步完善動物試驗及臨床治療效果統(tǒng)計。