龍奕妃 李雪瑩 劉越 李金鳳

華北理工大學公共衛(wèi)生學院 河北唐山 063210

抗結核藥物性肝損傷(Anti-tuberculosis drug-induced liver injury,ADLI)是結核病治療中多藥聯合應用產生的最為嚴重的副反應[1],其發(fā)生與遺傳[2-3]和環(huán)境[4-5]密不可分,而表觀遺傳學正是連接環(huán)境與基因的紐帶。2019 年 Zhang等[6]研究報道組蛋白乳酸化是一種全新的表觀遺傳修飾,自此開啟了組蛋白乳酸化這種全新的翻譯后修飾的研究。HDAC2在1996年由Yang等[7]發(fā)現,屬于I類HDAC中的一員,其活性位點具有催化機制,在轉錄調控、細胞周期等過程中起重要作用[8],而且有研究發(fā)現HDAC2可以加速糖酵解[9],與組蛋白乳酸化密切相關。門冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate transaminase,AST)、丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase,ALT)是檢測肝臟功能的常用指標,二者異常升高提示出現肝損傷[10],AST分布在肝細胞胞核和線粒體,其升高提示肝損傷可能已經損傷細胞器;ALT則主要分布在肝細胞胞漿,其數值升高則反映胞膜的破壞。因此本研究采用異煙肼、利福平、吡嗪酰胺三聯用藥方案在AML12細胞中構建ADLI細胞模型,并外源添加組蛋白乳酸化促進劑和抑制劑,旨在研究組蛋白乳酸化通過HDAC2對ADLI炎癥的影響,為組蛋白乳酸化治療ADLI提供理論支持。

1 材料和方法

1.1細胞與試劑 AML12細胞購自上海中科院;異煙肼、利福平、吡嗪酰胺購自日本TCI公司;乳酸、草氨酸鈉購自美國MedChemExpress生物科技公司;CCK8、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;ALT、AST試劑盒購自南京建成生物工程有限公司。

1.2方法

1.2.1溶液配制 異煙肼:利福平:吡嗪酰胺按照3:6:16的比例,取異煙肼0.15g,利福平0.3g,吡嗪酰胺0.8g,溶解于5mL DMSO,得到(30000+60000+160000)μg/mL的三聯藥原液;取8μL乳酸溶解到1.11mL DEPC水中,得到100mmoL/L的乳酸原液;取500mg草氨酸鈉粉末溶解到9mL DEPC水,得到500mmoL/L的草氨酸鈉原液。以上原液均4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2細胞活性檢測 使用CCK8試劑盒檢測細胞活性。當細胞培養(yǎng)密度達到80%～90%時,將其調整到3×104個/mL后接種到96孔板,貼壁生長后分別加入含不同濃度促進劑和抑制劑的培養(yǎng)基,37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng)24h后,每孔加入100μL的CCK8稀釋液培養(yǎng)4h檢測各孔OD值,計算細胞活性。以對照組為參照,取細胞活性為80%時所在濃度為最終應用濃度。

1.2.3細胞培養(yǎng)及細胞分組 AML12細胞在37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱孵育培養(yǎng),并分為對照組、三聯藥組、乳酸組、草氨酸鈉組、三聯藥+乳酸組、三聯藥+草氨酸鈉組。細胞培養(yǎng)24h后收集培養(yǎng)基上清液。

1.2.4mRNA相對表達量檢測 RT-PCR方法測定各指標mRNA表達水平。冰上操作,TRIZOL法提取總RNA,按照逆轉錄試劑盒說明書制備cDNA,克隆目的基因PCR。擴增程序如下:變性98℃, 10 sec;退火68℃, 30 sec;延伸72℃,Forever,45個循環(huán)。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.2.5蛋白表達水平 Western Blot法檢測細胞炎癥蛋白表達水平。冰上操作,裂解細胞后BCA蛋白定量試劑盒定量至5μg/μL,之后金屬浴5min蛋白變性,備用。蛋白上樣,經凝膠電泳后轉至 PVDF 膜,用含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2h,加入HDAC2一抗(1:5000)、NFκB一抗(1:5000)、GAPDH一抗(1:1000)4 ℃孵育過夜。TBST漂洗三次,用HRP標記的羊抗兔二抗(1:5000)室溫孵育2h,TBST漂洗三次,ECL發(fā)光液顯影。

1.2.6AST、ALT酶活性檢測 取適量細胞培養(yǎng)上清液,使用測試盒測定細胞內 AST、ALT酶活性,酶標儀510 nm波長檢測各組OD值。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計學軟件進行數據分析。計量資料采用單因素方差分析,兩組間的比較采用Student-t檢驗,檢驗水準α=0.05。采用Pad Prism軟件(Ver. Prism 8)繪制統(tǒng)計圖。

2 結果

2.1乳酸濃度確定 AML12細胞活性在乳酸濃度0～40 mmoL/L范圍內逐漸升高,但乳酸濃度超出40 mmoL/L后,細胞活性降低。故其培養(yǎng)濃度取8mmoL/L。見表2。

表2 不同濃度乳酸中細胞活性檢測結果(%)

乳酸濃度(mmoL/L)01520304050AML12細胞活性100198.38±0.099200.21±0.283211.42±0.080223.49±0.14067.85±0.202

2.2草氨酸鈉濃度確定 AML12細胞活性隨著草氨酸鈉濃度的升高而降低,見表3。故其培養(yǎng)濃度取其最高值18mmoL/L。

表3 不同濃度下抑制劑草氨酸鈉中AML12細胞活性(%)

草氨酸鈉濃度(mmoL/L)01416182030AML12細胞活性10085.19±0.04083.43±0.03879.35±0.08475.05±0.20570.23±0.337

2.3組蛋白乳酸化水平變化對ADLI蛋白和mRNA表達的影響 與對照組相比,三聯藥組HDAC2的mRNA和蛋白表達明顯降低,NF-κB表達明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與三聯藥組相比,HDAC2的mRNA和蛋白在三聯藥+乳酸組表達升高,在三聯藥+草氨酸鈉組表達降低;而NF-κB mRNA和蛋白在三聯藥+乳酸組表達降低,在三聯藥+草氨酸鈉組表達明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 各組細胞中HDAC2、NF-κB mRNA和蛋白表達情況注:*表示與對照組比較P<0.05;#表示與三聯藥組比較P<0.05。

2.4乳酸、草氨酸鈉對上清AST、ALT酶活性的影響 與對照組相比,三聯藥組的AST、ALT酶活性顯著升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與三聯藥組相比,三聯藥+乳酸組的AST、ALT酶活性顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組細胞上清液中AST、ALT酶活性注:*表示與對照組比較P<0.05;#表示與三聯藥組比較P<0.05。

3 討論

ADLI是抗結核治療過程中危害最大且最常見的藥物不良反應,嚴重時能導致肝衰竭危及生命,故其治療顯得至關重要。組蛋白乳酸化是全新的翻譯后修飾調控,2019 年 Zhang等在人和小鼠細胞的核心組蛋白上鑒定發(fā)現了28個乳酸化位點,為理解乳酸的非代謝功能及其參與感染、免疫等過程提供了新角度。組蛋白乳酸化是糖酵解的結果,在維持細胞穩(wěn)態(tài)、胚胎發(fā)育、神經元活動等生理過程中起關鍵作用[11-13],更在病理過程中具有調節(jié)免疫的功能,其水平的高低常常與疾病的預后密切相關[14-16],甚至可以驅動腫瘤基因表達并加速腫瘤發(fā)生[17]。

HDAC2在細胞增殖、細胞信號傳導、癌癥發(fā)生和進展、炎癥和基因表達調控中發(fā)揮重要作用,其主要靶向組蛋白H3和H4[18]。HDAC2已經被多個研究團隊證明有減輕炎癥反應的功能[19]。另外有研究指明嚴重哮喘患者體內HDAC2表達降低,其介導的糖皮質激素受體乙酰化狀態(tài)改變能刺激NF-κB的活化,進而促進嚴重哮喘的發(fā)生[20];2018年Peter J也提及在嚴重哮喘和COPD患者的上皮細胞、巨噬細胞和外周血白細胞中HDAC2表達降低,而募集HDAC2可以逆轉核心組蛋白的乙?；?繼而關閉氣道中激活的炎癥基因[21]。2019年Lai團隊觀察到暴露在室內塵螨環(huán)境中的HDAC2+/-小鼠出現明顯的炎癥細胞浸潤增強,認為HDAC2是通過抑制了T-2細胞因子和IL-17A表達水平而起作用,證實了HDAC2過表達可阻止炎癥因子的進一步發(fā)展[22];同年Tang團隊研究發(fā)現p300/YY1/miR-500a-5p/HDAC2信號軸調控人類結直腸癌細胞增殖,其中HDAC2是miR-500a-5p的功能靶點,也是該miRNA的靶基因,介導了miR-500a-5p對結直腸癌細胞的增殖和侵襲,而這些功能離不開HDAC2對腫瘤微環(huán)境炎癥的調控作用[23]。

NF-κB能控制DNA轉錄、細胞因子的產生和細胞存活[24]。NF-κB信號通路在慢性炎癥和自身免疫性疾病中的研究最為豐富,其激活與癌癥、自身免疫性疾病、心血管疾病等病理過程相關[25]。NF-κB在接收到刺激的第一時間被激活,引起免疫反應相關基因的激活,發(fā)揮促進炎癥的作用,在炎癥消退后又可恢復至正常。

AST存在于心肌細胞和肝細胞的線粒體中,當肝組織受到嚴重損害血清AST會升高[26]。ALT主要存在于肝細胞胞質中,在重型肝炎、肝硬化、肝癌藥物中毒性肝細胞壞死等病理進程中,AST、ALT會大量釋放入血,血清中二者含量急速升高。

本研究在AML12小鼠肝細胞中構建ADLI模型,通過改變組蛋白乳酸化狀態(tài)發(fā)現,組蛋白乳酸化促進劑乳酸可升高HDAC2的表達水平,同時抑制NF-κB的活性,降低細胞上清液中ALT、AST酶活性,在一定程度上緩解肝臟損傷;而組蛋白乳酸化抑制劑草氨酸鈉的作用與之相反,與已有研究結果一致[27-29]。組蛋白乳酸化修飾水平升高可在一定程度上修復ADLI損傷,提示組蛋白乳酸化可能是治療ADLI的新途徑,本研究為ADLI的治療提供理論支持。