巫繁菁 韋 萍 黃大利 韋 瑋

（廣西骨傷醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 南寧 530001）

骨傷外洗散是廣西骨傷醫(yī)院使用多年的臨床協(xié)定方，由蘇木、桂枝、當(dāng)歸尾、山香等中藥及民族藥組成，具有祛風(fēng)止痛、活絡(luò)消腫、化瘀的作用，臨床上可用于跌打損傷、風(fēng)濕腫痛，促進(jìn)骨折愈合。作為傳統(tǒng)的散劑，骨傷外洗散制作工藝簡(jiǎn)單，便于攜帶。本實(shí)驗(yàn)研究旨在對(duì)骨傷外洗散的薄層色譜（TLC）以及微生物限度檢查進(jìn)行研究，為該藥的生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器紫外光燈（上海嘉鵬科技有限公司，型號(hào)：ZF-7）；數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，型號(hào)：KQ5200DB）；電子天平（深圳市華恒儀器有限公司，型號(hào)：賽多利斯TP-3102，感量0.1 g）、電熱恒溫培養(yǎng)箱［賓德環(huán)境試驗(yàn)設(shè)備（上海）有限公司，型號(hào)：BD（E2）240］、細(xì)菌培養(yǎng)箱［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司，型號(hào)：BK6160］、生化培養(yǎng)箱（上海比朗儀器制造有限公司，型號(hào)：SANYO MLR-351H）、生物安全柜（新加坡藝思高科技有限公司）、高壓滅菌鍋［致微（廈門(mén)）儀器有限公司，型號(hào)：GR110DR］。

1.2 材料骨傷外洗散（廣西骨傷醫(yī)院委托其他單位生產(chǎn)提供，批號(hào)：20200426、20200427、20200428）；蘇木、桂枝、當(dāng)歸尾對(duì)照品（購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院）；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）（默克密理博有限公司，批號(hào)：VM856858）；胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（ 默克密理博有限公司， 批號(hào)：VM899959）；沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：181127）；沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：180731）；pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（北京陸橋技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：180820）；氯化鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180509）；溴化十六烷基三甲胺瓊脂（廣東環(huán)凱生物科技有限公司，批號(hào)：1066175）；甘露醇氯化鈉瓊脂（廣東環(huán)凱生物科技有限公司，批號(hào)：1076321）；綠膿桿菌生化鑒定盒（廣東環(huán)凱生物科技有限公司，批號(hào)：5108192）?？莶菅挎邨U菌［CMCC（B）63501］、銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］、金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、黑曲霉［CMCC（F）98003］，由中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌菌種保藏管理中心提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 蘇木的TLC鑒別取骨傷外洗散5.5 g，加25 mL甲醇超聲20 min，過(guò)濾并濃縮至2 mL 作為供試品溶液。取蘇木對(duì)照藥材0.5 g，加甲醇5 mL 超聲20 min，過(guò)濾并濃縮至2 mL作為對(duì)照藥材溶液。另取處方量藥材，缺蘇木，按照骨傷外洗散制備工藝制成缺蘇木陰性樣品，按供試品方法制成缺蘇木陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版一部附錄Ⅵ B）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將以上3 種溶液分別吸取8 μL，點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜板上，展開(kāi)劑為乙酸乙酯-丙酮-甲醇-水（2∶1∶1∶1）溶液，展開(kāi)后取出晾干，在紫外光燈（365 nm）下檢視［1，2］。

薄層結(jié)果顯示，蘇木對(duì)照藥材與供試品在相同的位置上顯熒光斑點(diǎn)且顏色相同，而陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾。見(jiàn)圖1。

圖1 骨傷外洗散中蘇木的TLC鑒別圖（365 nm下檢視）

2.1.2 當(dāng)歸尾的TLC鑒別取骨傷外洗散5.5 g，加25 mL 石油醚超聲20 min，過(guò)濾并濃縮至2 mL 作為供試品溶液。取當(dāng)歸尾對(duì)照藥材0.5 g，加5 mL 石油醚超聲20 min，過(guò)濾并濃縮至2 mL 作為對(duì)照藥材溶液。另取處方量藥材，缺當(dāng)歸尾，按照骨傷外洗散制備工藝制成缺當(dāng)歸尾陰性樣品，按供試品方法制成缺當(dāng)歸尾的陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部附錄Ⅵ B）實(shí)驗(yàn)，將以上3 種溶液分別吸取8 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，展開(kāi)劑為石油醚-乙酸乙酯（5∶1）溶液，展開(kāi)后取出晾干，在紫外光燈（365 nm）下檢視。

薄層結(jié)果顯示，當(dāng)歸尾對(duì)照藥材與供試品在相同的位置上顯熒光斑點(diǎn)且顏色相同，而陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾。見(jiàn)圖2。

圖2 骨傷外洗散中當(dāng)歸尾的TLC鑒別圖（365 nm下檢視）

2.1.3 桂枝的TLC鑒別取骨傷外洗散5.5 g，加25 mL甲醇超聲20 min，過(guò)濾并濃縮至2 mL 作為供試品溶液。取桂枝對(duì)照藥材1 g，加5 mL 甲醇超聲20 min，過(guò)濾并濃縮至2 mL作為對(duì)照藥材溶液。另取處方量藥材，缺桂枝，按照骨傷外洗散制備工藝制成缺桂枝陰性樣品，按供試品方法制成缺桂枝的陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法（《中華人民共和國(guó)藥典》2020 年版一部附錄Ⅵ B）實(shí)驗(yàn)，將以上3 種溶液分別吸取8 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，展開(kāi)劑為石油醚-乙酸乙酯（4∶0.5）溶液，展開(kāi)后取出晾干，在紫外光燈（365 nm）下檢視。

薄層結(jié)果顯示，桂枝對(duì)照藥材與供試品在相同的位置上顯熒光斑點(diǎn)且顏色相同，而陰性對(duì)照樣品無(wú)干擾。見(jiàn)圖3。

圖3 骨傷外洗散中桂枝的TLC鑒別圖（365 nm下檢視）

2.2 微生物限度方法的建立與驗(yàn)證

2.2.1 菌液制備將銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌在33 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h，加入0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，制成含菌數(shù)為104cfu/mL 的菌懸液；將白色念珠菌液體培養(yǎng)物25 ℃培養(yǎng)2～3 d，加入0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，制成含菌數(shù)為104cfu/mL 的菌懸液；將黑曲霉斜面培養(yǎng)物25 ℃培養(yǎng)5～7 d，用含0.05%聚山梨酯80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液5 mL沖洗霉菌孢子，吸取該菌液，加入含0.05%聚山梨酯80 的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，制成含菌數(shù)為104cfu/mL 的菌懸液。以上制備好的菌液備用。

2.2.2 供試品制備取骨傷外洗散10 g，按1∶10 加入pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1∶10 供試液；取1∶10 的供試液適量，按1∶20 加入pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液制成1∶20供試液，備用。

2.2.3 微生物計(jì)數(shù)法建立及回收率實(shí)驗(yàn)

2.2.3.1 適用性實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)組：取1∶10、1∶20 的供試液每管9.9 mL，分別加入菌液0.1 mL 到每管中，將供試液與菌液混勻（供試液總含菌量≤102cfu/mL）；混勻后每管取1 mL 注皿，平行制備2 個(gè)平皿，立即往皿中傾注SDA 和TSA；皿內(nèi)液體凝固后，在規(guī)定溫度下培養(yǎng)，真菌5 d，細(xì)菌3 d。菌液對(duì)照組：以相應(yīng)的稀釋液替代供試液，按實(shí)驗(yàn)組操作加入實(shí)驗(yàn)菌液并進(jìn)行微生物回收實(shí)驗(yàn)。供試品對(duì)照組：取制備好的供試液，以稀釋液代替菌液同實(shí)驗(yàn)組操作。

回收比值（回收率）=（實(shí)驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)）/菌液組平均菌落數(shù)。

2.2.3.2 方法的確定 取批號(hào)為20200426 的骨傷外洗散樣品，以金黃色葡萄球菌、白色念珠菌及枯草芽孢桿菌為敏感菌，按照2.2.3.1 項(xiàng)下平皿法進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。需氧菌總數(shù)采用1∶10、1∶20 供試液平皿法（每皿1 mL），枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的回收比值均在0.5～2，表明采用1∶10 供試液平皿法（每皿1 mL）進(jìn)行需氧菌總數(shù)測(cè)定可行；霉菌和酵母菌總數(shù)采用1∶10、1∶20供試液平皿法（每皿1 mL），白色念珠菌回收比值均在0.5～2，表明霉菌和酵母菌總數(shù)采用1∶10 平皿法（每皿1 mL）測(cè)定可行。見(jiàn)表1。

表1 敏感菌株預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3.3 方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 分別取3 個(gè)批號(hào)的骨傷外洗散樣品，按2.2.1 項(xiàng)下方法制備供試液；以1∶10 供試液、平皿法，按2.2.3.1項(xiàng)下方法進(jìn)行計(jì)數(shù)加菌回收實(shí)驗(yàn)。

經(jīng)適用性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，以1∶10 供試液1 mL 平皿法-傾注法，對(duì)骨傷外洗散中需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)測(cè)定，5 種規(guī)定實(shí)驗(yàn)菌（銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌及黑曲霉）的回收比值均在0.5～2，符合2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》四部通則1105的規(guī)定。見(jiàn)表2。

表2 骨傷外洗散微生物計(jì)數(shù)方法適用性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.4 3 個(gè)批次的骨傷外洗散微生物限度檢查根據(jù)上述所建立的微生物限度檢查法，對(duì)3 個(gè)批次的骨傷外洗散進(jìn)行微生物限度檢查。見(jiàn)表3。

表3 3批骨傷外洗散的微生物限度檢查結(jié)果

2.2.5 控制菌檢查法適用性實(shí)驗(yàn)

2.2.5.1 菌懸液制備 菌液制備同2.2.1。取骨傷外洗散10 g，按1∶10 加入適量的pH7.0 無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，作為控制菌檢查法供試液。

2.2.5.2 金黃色葡萄球菌 實(shí)驗(yàn)組：取供試液10 mL，分別接種至100 mL 和200 mL 的TSB 中，同時(shí)加入≤102cfu的金黃色葡萄球菌，33 ℃培養(yǎng)18 h。將培養(yǎng)物取出，劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，33 ℃培養(yǎng)18 h，觀察其菌落形態(tài)。陽(yáng)性對(duì)照：取≤102cfu 的金黃色葡萄球菌，接種至100 mL 的TSB 中，依法實(shí)驗(yàn)。陰性對(duì)照：以相應(yīng)稀釋液作為供試品液，接種至100 mL的TSB中。

2.2.5.3 銅綠假單胞菌 實(shí)驗(yàn)組：取供試液10 mL 接種至100 mL 的TSB 中，同時(shí)加入≤102cfu 的銅綠假單胞菌，33 ℃培養(yǎng)18 h。將培養(yǎng)物取出，劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上，33 ℃培養(yǎng)18 h，觀察其菌落形態(tài)。陽(yáng)性對(duì)照：取≤102cfu 的銅綠假單胞菌，接種至100 mL 的TSB 中，依法實(shí)驗(yàn)。陰性對(duì)照：以相應(yīng)稀釋液作為供試品液，接種至100 mL的TSB中。

2.2.5.4 控制菌檢查驗(yàn)證結(jié)果 見(jiàn)表4。

表4 骨傷外洗散控制菌檢查方法的適用性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

散劑是中醫(yī)藥傳統(tǒng)劑型的一種，是將原料藥物（或加入適宜的輔料）經(jīng)粉碎、過(guò)篩、混合均勻制成的粉末狀制劑［3］。散劑在中醫(yī)藥中的發(fā)展有著悠久的歷史，且占據(jù)重要的一席之地［4］。其以中醫(yī)藥的基本理論為指導(dǎo)，經(jīng)辨證論治而來(lái)，具有制作簡(jiǎn)單、較好地保留揮發(fā)性成分、縮短煎煮時(shí)間的優(yōu)勢(shì)［5］。骨傷外洗散作為一種傳統(tǒng)的散劑，為廣西骨傷醫(yī)院臨床獨(dú)有的治療跌打損傷、風(fēng)濕腫痛、骨折的經(jīng)驗(yàn)方，準(zhǔn)備開(kāi)發(fā)為醫(yī)院制劑。經(jīng)過(guò)資料整理發(fā)現(xiàn)，至今尚未有人對(duì)該驗(yàn)方進(jìn)行過(guò)質(zhì)量控制方面的研究。

通過(guò)查找相關(guān)文獻(xiàn)及進(jìn)行反復(fù)實(shí)驗(yàn)，本文建立的蘇木、桂枝、當(dāng)歸尾的TLC 鑒別方法，操作簡(jiǎn)便，合理可行，可作為骨傷外洗散的定性鑒別方法；建立的微生物限度檢查法回收比值均在0.5～2，符合2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》的要求，可作為骨傷外洗散的微生物限度檢查方法。