潘加歡 潘艷云 祁晨陽 朱敏 毛威

內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）是一種具有分化及增殖能力的成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）的前體細(xì)胞［1］。其可以在體內(nèi)分化為成熟ECs，通過遷移、黏附、增殖，相互連接之后組成血管腔樣的結(jié)構(gòu)，直接形成新血管；也可以結(jié)合入血管內(nèi)膜，釋放保護(hù)性旁分泌因子參與內(nèi)皮細(xì)胞損傷后的修復(fù)過程，加速血管內(nèi)皮再生、改善血管內(nèi)皮功能［1-2］。因此EPCs 成為防治多種血管疾病的重要靶細(xì)胞。然而，內(nèi)源性EPCs 在高血壓、糖尿病、高血脂等疾病環(huán)境中數(shù)量減少且功能減退，不能很好在病變組織中執(zhí)行修復(fù)任務(wù)［2-6］。GIANNOTTI 等［6］研究進(jìn)一步表明EPCs 數(shù)量和功能受損是導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙重要原因之一。EPCs 移植已被應(yīng)用在多種血管損傷動物疾病模型中包括肺動脈高壓（PAH）、動脈粥樣硬化（AS）等，其被證實(shí)可作為一種全新的內(nèi)皮損傷的治療方式；國內(nèi)外學(xué)者也已完成多項(xiàng)通過輸注自體EPCs 治療心血管病患者的臨床研究并獲得較好的療效［7-10］。但目前研究證明即使移植的EPC 功能在炎癥環(huán)境中也會受損［8-10］，因此，研究EPCs 損傷的機(jī)制將是未來EPC 治療的關(guān)鍵方向。

慢性炎癥浸潤是大多數(shù)心血管疾病的典型病理改變［9，11］。促炎介質(zhì)可溶性CD40 配體（sCD40L）血漿濃度升高是包括PAH、AS 等炎癥相關(guān)血管疾病的特征改變之一［11］。CD40L及其受體CD40 屬于腫瘤壞死因子超家族［12］。除了跨膜形式，CD40L 也有較短的可溶性形式sCD40L，并具有更強(qiáng)的生物學(xué)活性。CD40/CD40L 軸在參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的免疫、炎癥反應(yīng)中具有多種作用，包括單核細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞（SMCs）、巨噬細(xì)胞、ECs 和EPCs 等［11-13］。已有大量證據(jù)證明CD40 通路的激活可以減少EPCs 數(shù)量并損害EPCs 活性［13-14］，但其潛在機(jī)制仍不明確。

一氧化氮（NO）作為重要體液因子，不僅能夠維持血管正常舒張功能，還能抑制血小板聚集并修復(fù)血管損傷，調(diào)節(jié)體內(nèi)糖、脂代謝平衡；同時也調(diào)控多種管壁細(xì)胞包括ECs、SMCs 的生長周期和增殖等，是防治心血管疾病重要的分子物質(zhì)。存在于人體內(nèi)NO 的含量不多，主要由ECs 生成合成，其一氧化氮合酶（NOS）可分為nNOS、iNOS 積eNOS 三種亞型，三者在維持心血管內(nèi)平衡起重要調(diào)節(jié)作用。血管NO 合成很大程度上與eNOS 有關(guān)，且eNOS 活性或蛋白水平將決定NO 合成水平的高低，多種心血管疾病發(fā)病機(jī)制中包含eNOS/NO 失調(diào)的因素。NO 生物利用度的降低可能是CD40 通路激活后介導(dǎo)EPCs 數(shù)量減少和能力損傷的關(guān)鍵因素；而NO 生物利用度的升高可能部分逆轉(zhuǎn)炎癥條件下EPCs 的功能障礙。

1 CD40通路的激活損害EPC的功能

ECs 損傷被認(rèn)為是血管損傷發(fā)生發(fā)展過程中的前哨事件，并隨后誘導(dǎo)血管重構(gòu)［1，4］。EPCs 向ECs 的分化已被認(rèn)為是其治療益處的主要機(jī)制。EPCs 的正常黏附、增殖、分化和并入血管結(jié)構(gòu)是內(nèi)皮修復(fù)的關(guān)鍵。EPCs 的這些功能在患者中受損［5-6］。離體實(shí)驗(yàn)也證實(shí)：sCD40L 預(yù)處理后，體外培養(yǎng)的正常EPCs 的黏附、遷移、增殖功能受損，旁分泌的炎性因子增多，且該效應(yīng)呈劑量相關(guān)［13］。研究報(bào)道sCD40L 處理后，EPCs 在VLA-5 配體纖維連接蛋白、Mac-1 配體纖維蛋白原、Mac-1 與淋巴細(xì)胞功能相關(guān)抗原-1 聯(lián)合配體細(xì)胞間黏附分子-1、VLA-4 配體VCAM-1 上的增殖和黏附減少，細(xì)胞活力也明顯呈劑量依賴性下降。管壁局部EPCs 的數(shù)量依賴于細(xì)胞本身的增殖和與血管中表達(dá)的黏附分子，這對于內(nèi)皮修復(fù)至關(guān)重要［15］。此外，細(xì)胞動員前的骨髓局部EPCs 的增殖能力及數(shù)量也被認(rèn)為在后期的遷移歸巢運(yùn)動中起關(guān)鍵作用［16］。EPCs 功能障礙與新生內(nèi)膜重塑增加和再內(nèi)皮化減弱相關(guān)。在體動物研究發(fā)現(xiàn)：與經(jīng)sCD40L 預(yù)處理的EPCs 相比，通過輸注對照EPCs 可改善內(nèi)膜層的完整性、連續(xù)性，減少炎癥浸潤及血管重構(gòu)，同時經(jīng)EPCs 免疫熒光定位證實(shí)，經(jīng)sCD40L預(yù)處理的EPCs 移植后在血管內(nèi)膜層的定位減少，而CD40 基因敲除的EPCs 更好定植在內(nèi)膜層，且增殖數(shù)量明顯多于對照組，這不僅和EPCs 的趨化相關(guān)，更與其細(xì)胞本身良好的增殖、黏附、分泌等功能有密切關(guān)聯(lián)。以上充分表明CD40 通路的激活能改變本體甚至移植EPCs 的功能［13］。

2 CD40通路的激活損害EPC的運(yùn)動

動員、趨化、歸巢、遷移是EPCs 的主要運(yùn)動形式。大部分EPCs 存在于造血干細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞提供的造血微環(huán)境中并保持靜止?fàn)顟B(tài)。作為對損傷和細(xì)胞因子等外周刺激的反應(yīng)，EPCs 動員釋放到外周血中，隨后進(jìn)入新血管或受損組織的所在地，稱為歸巢［17-18］。歸巢是EPCs 黏附并分化并入內(nèi)膜層的先決條件。EPCs 數(shù)量越大，血管健康狀況和修復(fù)潛力越好［1-4］。除了增殖能力外，EPCs 對外周刺激的敏感性對EPCs 數(shù)量至關(guān)重要。然而，血管疾病患者的循環(huán)EPCs 數(shù)量和正?；顒訙p少［5-6］。EPCs 從骨髓中釋放出后能否有效遷移、歸巢至受損部位，是血管再生和損傷修復(fù)的關(guān)鍵。EPCs 的歸巢機(jī)制尚不十分清楚，目前多數(shù)觀點(diǎn)認(rèn)為歸巢的啟動源于缺血損傷微環(huán)境中各種信號的釋放。主要包括基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF-1），血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）以及黏附因子（VCAM-1）等。在這些信號因子作用下，激活EPCs 上的相應(yīng)受體通路SDF-1α/CXCR4，ICAM-1/CD18（integrinβ2）和 VCAM-1/integrinα4 等，介導(dǎo)EPCs 向血管損傷部位集中，并修復(fù)血管。SDF-1α/CXCR4 信號軸又被認(rèn)為是EPCs 歸巢的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。CD40 通路的激活被證明會減弱EPCs 的運(yùn)動能力［13-14，17］。sCD40L 預(yù)處理后，SDF-1 和VEGF 誘導(dǎo)的EPCs 遷移呈劑量依賴性減弱［14］。晚期抗原-4（VLA-4）和VCAM 也在EPCs 的歸巢中發(fā)揮重要作用，經(jīng)sCD40L 預(yù)處理后，其與EPCs 的相互作用也減弱［15］。相反，動物模型移植EPCs 的實(shí)驗(yàn)中，用帶慢病毒熒光載體標(biāo)記移植細(xì)胞，免疫共聚焦定位后發(fā)現(xiàn)，野生型EPCs在炎癥環(huán)境下可進(jìn)入組織間隙及管壁各層，而CD40 基因沉默的EPCs 并不會減弱歸巢能力，反而能更好定植在血管內(nèi)膜層而不是外膜或中膜層［13］。

3 CD40通路對EPC的作用機(jī)制

局部eNOS/NO 的生物活性是維持EPCs 正常歸巢和修復(fù)能力的核心條件［19-20］。然而，大多數(shù)血管疾病通常以NO 生物活性降低為特征。血管損傷動物模型移植EPCs 治療后血清eNOS 上升，而 PI3K/Akt/eNOS 途徑也是EPCs 介導(dǎo)血管內(nèi)膜修復(fù)的關(guān)鍵途徑［19］。NO 生物活性受損會減弱骨髓對外周刺激的反應(yīng)，導(dǎo)致循環(huán)EPCs 水平下降。在骨髓中，破壞細(xì)胞與基質(zhì)微環(huán)境之間的黏附相互作用是EPCs 動員的關(guān)鍵［17-18，21］。趨化因子如VEGF、SDF-1、白細(xì)胞介素（IL）-8、粒細(xì)胞集落刺激因子和Grob 誘導(dǎo)的EPC 動員主要依賴于基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-9 的局部分泌［22-24］。NO 在調(diào)節(jié)MMP-9 的基礎(chǔ)表達(dá)和活性中起關(guān)鍵作用。降低NO 水平不能有效刺激MMP9表達(dá)，導(dǎo)致EPCs 進(jìn)入循環(huán)受阻［22-24］。研究證實(shí)野生型EPCs在應(yīng)用于循環(huán)時有效，但不能從eNOS 缺乏小鼠的骨髓中釋放（NOS3-/-）；此外，靜脈輸注或骨髓移植NOS3-/-細(xì)胞也不能挽救野生型動物受損的新生血管［22］。糖尿病周圍血管病患者EPCs 中eNOS、NO 的表達(dá)明顯減少，EPC 的遷移、黏附、增殖功能下降。高水平的NO 合成酶抑制劑可導(dǎo)致EPCs的分化、增殖、黏附和并入血管結(jié)構(gòu)的能力呈濃度依賴性降低［23］。相反，提高NO 生物活性的物質(zhì)，如生長激素和胰島素生長因子（IGF），對循環(huán)EPC 水平有刺激作用。促紅細(xì)胞生長素可通過動員EPC，促進(jìn)損傷內(nèi)膜再內(nèi)皮化過程，抑制新生內(nèi)膜的過度增殖［24］。同樣，他汀類藥物可以通過PI3K/Akt 通路激活eNOS，增加EPCs 的數(shù)量并促進(jìn)其分化［20］。

研究發(fā)現(xiàn)sCD40L 與NO 的生物活性密切相關(guān)。一方面，sCD40L 可以直接降低eNOS mRNA 和蛋白質(zhì)水平、eNOS mRNA 穩(wěn)定性和/或eNOS 轉(zhuǎn)錄活性、eNOS 酶活性，最終降低細(xì)胞NO 水平，這些下調(diào)作用可被抗CD40L 或抗CD40 抗體有效阻斷［12，25］。因此，激活CD40 通路誘導(dǎo)的eNOS 和NO降低可能導(dǎo)致EPCs 功能障礙。另一方面，氧化應(yīng)激是炎癥反應(yīng)的特征也是CD40 軸調(diào)控NO 的機(jī)制［26］。氧化應(yīng)激損害EPCs 的黏附、遷移和再內(nèi)皮化能力，同時促進(jìn)EPCs 的凋亡和衰老［27］。除了直接損害細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞器和分子外，更重要的是，高濃度的活性氧降低了對氧化應(yīng)激高度敏感的NO 可用性，并拮抗內(nèi)皮細(xì)胞NO 生成的保護(hù)作用［27］。O2-可以消耗NO 形成過氧亞硝酸鹽（ONOO-），并觸發(fā)p38、ERK1/2 和NF-κb 的激活，從而降低eNOS 水平和NO 的生物活性［25，27］。sCD40L 降低線粒體膜電位、過氧化氫酶、ATP 水平和SOD 活性，同時激活NAD（P）H 氧化酶，從而刺激細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS），從而改變NO 的生物活性［25-26］。然而，經(jīng)過NAD（P）H 氧化酶抑制和超氧化物歧化酶（SOD）處理后，NO 的生物活性得以恢復(fù)，再內(nèi)皮化反應(yīng)也得以恢復(fù)［27］。

4 小結(jié)

EPC 移植作為一種新興的治療方法，離廣泛的臨床應(yīng)用還有較長的路。尋找合理的優(yōu)化方法是EPC 治療的未來研究方向。血管內(nèi)膜損傷常伴有慢性炎癥浸潤。但直接抗炎治療在AS/PAH 等血管疾病的臨床應(yīng)用中尚存爭議，因此進(jìn)一步深入了解其潛在病理發(fā)生機(jī)制有助于確立新的研究靶點(diǎn)及臨床治療方案。本文對經(jīng)典促炎信號通路CD40 通路進(jìn)行深入分析，并提出NO 生物活性可能是CD40 通路介導(dǎo)EPC 功能改變的關(guān)鍵因素?？梢钥紤]在EPC 輸注時采用NO 相關(guān)基因修飾的EPC 治療或臨時靶向信號通路輔助治療。