李秀萍, 簡(jiǎn)瑩娜, 胡 勇, 王戈平, 郭文業(yè), 馬利青*

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院,青海 西寧 810016;2.青海省門(mén)源種馬場(chǎng),青海 門(mén)源 810200)

志賀氏菌也稱(chēng)痢疾桿菌,屬于革蘭氏陰性短小桿菌,臨床上可引起細(xì)菌性痢疾,腸道的炎癥反應(yīng)是志賀氏菌病的一個(gè)重要特征,主要表現(xiàn)為結(jié)腸的水腫、潰瘍及炎癥[1]。志賀氏菌包括4個(gè)種48個(gè)血清型,4個(gè)種分別為痢疾志賀氏菌(Shigelladysenteriae)、弗氏志賀氏菌(Shigellaflexneri)、宋內(nèi)氏志賀氏菌(Shigellasonnei)和鮑迪氏志賀氏菌(Shigellaboydii),其中弗氏志賀氏菌和宋內(nèi)氏志賀氏菌主要引起地方性流行性痢疾,鮑迪氏志賀氏菌主要引起重癥菌痢(此病少見(jiàn))[2]。弗氏志賀氏菌致病率最高[3],也是我國(guó)的主要流行菌株[4,5]。

邊緣無(wú)漿體病(Anaplasmosis)是由邊緣無(wú)漿體(Anaplasmamarginale)引起的,經(jīng)節(jié)肢動(dòng)物傳播、寄生于反芻動(dòng)物紅細(xì)胞內(nèi)的一種傳染病,又稱(chēng)邊蟲(chóng)病。該病以發(fā)熱、貧血、黃疸、流產(chǎn)、衰弱和漸進(jìn)性消瘦為特征,但急性發(fā)病時(shí)也可造成動(dòng)物死亡[6]。系統(tǒng)進(jìn)化分析法表明無(wú)漿體科分為4個(gè)屬,即無(wú)漿體屬、埃希氏體屬、沃爾巴克氏體屬、新立克次氏體屬,4個(gè)屬內(nèi)部微生物相似性分別為96.1%、97.7%、95.6%和94.9%。無(wú)漿體屬于立克次氏體目(Rickettsiales)無(wú)漿體科(Anaplasmataceae)無(wú)漿體屬(Anaplasma)。無(wú)漿體屬中的邊緣無(wú)漿體(A.marginale)、中央無(wú)漿體(A.centrale)和綿羊無(wú)漿體(A.ovis)3個(gè)種能感染反芻動(dòng)物[7]。中央無(wú)漿體因大多寄居于紅細(xì)胞的中央而得名,因其低致病性而被用于制作活疫苗,但是偶爾也能造成臨床疾病的發(fā)生。綿羊無(wú)漿體宿主較廣,只能感染羊,不會(huì)引發(fā)牛的持續(xù)感染[8]。

1 材料與方法

1.1病料來(lái)源

青海省門(mén)源種馬場(chǎng)飼養(yǎng)的一群成年牦牛于2022年7月份開(kāi)始出現(xiàn)腹瀉、精神狀態(tài)差、逐漸消瘦等癥狀,嚴(yán)重者最后衰竭死亡,共發(fā)病100余頭、死亡12頭。當(dāng)?shù)孬F醫(yī)站工作人員前往發(fā)病地點(diǎn)采集了病牛的糞樣及病死牛的內(nèi)臟2份,送至青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院獸醫(yī)生物技術(shù)研究室進(jìn)行檢測(cè)。

1.2試驗(yàn)材料

營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基購(gòu)自海博生物科技有限公司;鮮血平板為營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加入5%脫纖維綿羊血,為本實(shí)驗(yàn)室自制;實(shí)驗(yàn)用小白鼠購(gòu)自青海央宗藥業(yè)有限公司;分子試劑瓊脂糖、Trans 2K DNA marker等購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1細(xì)菌的分離培養(yǎng) 將采集送檢病牛的糞樣及病死牦牛的2份內(nèi)臟(心、肝、脾、肺、腎及腹瀉糞便)病料(標(biāo)記為1#、2#)分別無(wú)菌接種至鮮血平板、普通肉湯和厭氣肝湯等培養(yǎng)基中,在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,之后對(duì)培養(yǎng)物進(jìn)行染色鏡檢。

1.3.2致病性試驗(yàn) 將分離純化的可疑菌在37℃條件下培養(yǎng)18 h,經(jīng)腹腔注射給2只實(shí)驗(yàn)小白鼠,小白鼠約18 g/只左右,2只實(shí)驗(yàn)小白鼠注射培養(yǎng)物分別為0.2 mL/只、0.5 mL/只,對(duì)照組小白鼠一只,腹腔注射營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基0.5 mL。

1.3.3分子生物學(xué)檢測(cè) 對(duì)病料組織(1#脾臟、2#脾臟)進(jìn)行組織DNA提取,對(duì)純化后的分離菌進(jìn)行細(xì)菌基因組DNA提取,對(duì)提取的組織以及細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增,將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行切膠,然后送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3.4藥物敏感性試驗(yàn) 對(duì)分離純化且具有致病性的菌株用K-B擴(kuò)散法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)的標(biāo)準(zhǔn)判定為敏感(S)、中敏(I)或耐藥(R)[9]。

2 結(jié)果

2.1細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

腹瀉糞便在血平板培養(yǎng)基中生長(zhǎng)出β溶血菌落,菌落形態(tài)圓形凸起、光滑透明狀,經(jīng)染色鏡檢發(fā)現(xiàn)其形態(tài)為革蘭氏陰性桿菌,詳見(jiàn)圖1。1#脾臟在血平板培養(yǎng)基中生長(zhǎng)出β溶血大菌落,經(jīng)染色鏡檢發(fā)現(xiàn)其形態(tài)同為革蘭氏陰性桿菌(與糞便分離菌的形態(tài)一致),未分離到其他疑似致病細(xì)菌。

2.2致病性試驗(yàn)結(jié)果

將該β溶血菌落接種至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行純培養(yǎng),37℃培養(yǎng)18 h,將純化后的菌液給小白鼠進(jìn)行腹腔注射,結(jié)果2只小白鼠均于注射后24 h內(nèi)死亡,說(shuō)明該菌有致病性。剖解小鼠發(fā)現(xiàn)其肝臟損傷,出現(xiàn)胃腸鼓氣、腹瀉。將肝臟涂片、瑞特氏染色可見(jiàn)短桿菌,與分離細(xì)菌形態(tài)一致。將解剖小鼠的肝臟無(wú)菌接種至鮮血平板,24 h后血平板中的細(xì)菌菌落形態(tài)與之前分離細(xì)菌一致。

2.3分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果

將1#、2#脾臟組織以及分離菌株經(jīng)細(xì)菌16S rRNA PCR擴(kuò)增,詳見(jiàn)圖2。經(jīng)測(cè)序比對(duì)證實(shí)分離菌株為弗氏志賀氏菌,也被稱(chēng)為痢疾桿菌;1#脾臟組織16S rRNA檢測(cè)到邊緣無(wú)漿體中央亞種,2#脾臟未獲得完整測(cè)序結(jié)果。

2.4分離菌株藥敏試驗(yàn)

分離菌株對(duì)多數(shù)藥物呈現(xiàn)不同程度的耐藥,僅對(duì)氧氟沙星和左氧氟沙星敏感,詳見(jiàn)表1。依據(jù)試驗(yàn)結(jié)果,指導(dǎo)該馬場(chǎng)專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員將氧氟沙星作為首選藥物進(jìn)行治療,均治愈。

表1 分離菌株(弗氏志賀氏菌)的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論與討論

3.1經(jīng)病原菌的分離培養(yǎng)、致病性試驗(yàn)、PCR及測(cè)序分子鑒定,結(jié)合其臨床癥狀,確診本次門(mén)源馬場(chǎng)牦牛死亡是由于弗氏志賀氏菌與邊緣無(wú)漿體中央亞種合并感染所致。本試驗(yàn)通過(guò)16S rRNA基因擴(kuò)增并測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),分離菌為弗氏志賀氏菌,脾臟組織中檢測(cè)出邊緣無(wú)漿體中央亞種。

3.2在本次致病性試驗(yàn)中,將分離菌小白鼠腹腔注射后,小白鼠死亡率為100%。對(duì)志賀氏菌病主要使用抗菌素進(jìn)行治療,但隨著抗生素的濫用和過(guò)度依賴(lài),志賀氏菌的耐藥問(wèn)題日益嚴(yán)重[10]。藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,本次分離菌對(duì)阿莫西林、克林霉素、利福平、多粘菌素E、氨芐青霉素、紅霉素、呋喃妥因、慶大霉素、氨芐西林、先鋒霉素及頭孢吡肟11種藥物耐藥,對(duì)氧氟沙星敏感。將藥敏試驗(yàn)結(jié)果及時(shí)反饋給馬場(chǎng),技術(shù)人員使用氧氟沙星對(duì)病畜給予治療后,該場(chǎng)的病情得到了緩解和控制,說(shuō)明選擇敏感藥物治療可降低死亡率。牛邊緣無(wú)漿體病是由邊緣無(wú)漿體感染牛引起的一種蜱傳性疾病,加強(qiáng)牛只管理、定期進(jìn)行驅(qū)蟲(chóng)是預(yù)防該病的優(yōu)選方法。

3.3志賀氏菌作為一種高度接觸性傳染病,自19世紀(jì)末起開(kāi)始被人們認(rèn)識(shí)和了解[11]。該病發(fā)病率高、分布廣泛,臨床表現(xiàn)是水樣腹瀉、發(fā)熱和腹部疼痛,繼而轉(zhuǎn)為典型痢疾。近年來(lái)的報(bào)道表明,志賀氏菌除了感染人以外,也給養(yǎng)殖生產(chǎn)和動(dòng)物源性食品安全帶來(lái)嚴(yán)重的威脅和挑戰(zhàn)[12,13]。因此,應(yīng)加強(qiáng)志賀氏菌等人獸共患細(xì)菌傳染病的檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)預(yù)報(bào),有效保障動(dòng)物源性食品衛(wèi)生安全。

3.4引起牛腸道腹瀉的常見(jiàn)病原還包括大腸桿菌、副結(jié)核病、沙門(mén)氏菌、病毒性腹瀉和黏膜病毒等[14]。志賀氏菌病與上述疫病的臨床鑒別診斷有如下要點(diǎn):牛大腸桿菌病以1～2周齡的犢牛最易感染發(fā)病,一般體溫不高,排灰白色粥樣糞便;牛副結(jié)核病表現(xiàn)間歇性頑固性腹瀉,下頜腫脹,潛伏期長(zhǎng),4～6月齡多發(fā);牛沙門(mén)氏菌病以出生后30～40 d犢牛最為易感,糞便黃色、惡臭,關(guān)節(jié)腫脹;病毒性腹瀉和黏膜病無(wú)論新生犢牛和成年牛均可感染發(fā)病,而且不分季節(jié),排水樣或血樣糞便,有時(shí)伴有肺炎。本次檢測(cè)及藥敏試驗(yàn)結(jié)果為今后診治牦牛腸道腹瀉病提供了參考。