易元慧, 許丁帆, 董洪雨, 劉艷軍

(天津農(nóng)學(xué)院園藝園林學(xué)院, 天津 300384)

甜瓜(CucumismeloL.)為葫蘆科一年生蔓性草本植物,又名哈密瓜、香瓜等。甜瓜可溶性糖含量高,且含有維生素C、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)[1]。近年來,中國的甜瓜國際貿(mào)易發(fā)展迅速,但市場上抗逆性強的優(yōu)良品種較少,優(yōu)良種質(zhì)資源的缺乏使得生產(chǎn)成本不斷增加、生產(chǎn)技術(shù)難以支撐,制約了中國甜瓜產(chǎn)業(yè)國際競爭力的提升[2]。國內(nèi)外對甜瓜的研究主要是栽培技術(shù)以及選種育種等方面[3-7],有關(guān)甜瓜的愈傷組織研究也較多,但多采用器官誘導(dǎo)不定芽等建立再生體系[8-12],這種再生苗生長勢弱,遺傳穩(wěn)定性低,大大制約了種質(zhì)資源創(chuàng)新、誘變育種等技術(shù)的發(fā)展。松散型胚性愈傷組織是具有獨特性質(zhì)的愈傷組織,主要由彼此聯(lián)系且松散的愈傷組織細胞構(gòu)成,特點是其具有一定的胚性,即這些細胞可以在一定條件下經(jīng)過分化與分裂,逐步發(fā)育成胚狀體,進而形成一個完整植株。形成的再生體系能為植物組織脫毒、轉(zhuǎn)基因育種等研究提供平臺,從而有效解決甜瓜生產(chǎn)中枯萎病、炭疽病等[13-14]病蟲害以及坐果、含糖量等[15-16]問題。

松散型胚性愈傷組織的誘導(dǎo)是組織培養(yǎng)方法的一大創(chuàng)新,目前未見甜瓜松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)的相關(guān)報道。本研究以甜瓜成熟葉片為外植體,誘導(dǎo)甜瓜松散型胚性愈傷組織,建立高效的甜瓜松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)體系,為甜瓜種質(zhì)資源創(chuàng)新、植物組織脫毒、人工種子研制及遺傳轉(zhuǎn)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

本試驗選用天津津潤益農(nóng)公司提供的薄皮甜瓜。截取一段已開花結(jié)果的甜瓜葉片作為外植體。

1.2 方 法

1.2.1外植體制備與消毒

用自來水將甜瓜葉片表面沖洗干凈,剪下備用。在超凈工作臺中將葉片剪成小塊,用70%乙醇浸泡2 s,再用2%的次氯酸鈉溶液浸泡10 min,消毒期間不斷搖晃,充分消毒。消毒后用無菌水將葉片表面沖洗干凈,去除次氯酸鈉殘留。將洗凈的甜瓜葉片用無菌濾紙吸干表面水分備用。

1.2.2愈傷組織的誘導(dǎo)

以MS+7.0 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基,附加不同質(zhì)量濃度的激素和蔗糖,pH值調(diào)節(jié)到5.8。

將消毒處理后的甜瓜葉片在超凈臺中剪成大小0.5～1.0 cm的小塊,并將其接種到MS培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)。接種的甜瓜葉片背面朝上,保證葉片與培養(yǎng)基緊密接觸。每個三角瓶中接種5～8塊外植體,每個處理接種10瓶,重復(fù)3次。30 d后統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.3松散型愈傷組織的誘導(dǎo)

以MS+30 g/L蔗糖+7.0 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基,附加不同質(zhì)量濃度的激素,pH值調(diào)節(jié)到5.8。

將誘導(dǎo)出的甜瓜愈傷組織從葉片外植體上切下,轉(zhuǎn)接到含有不同激素的MS培養(yǎng)基上進行松散型愈傷組織誘導(dǎo)。每瓶接種5塊,每個處理接種10瓶,重復(fù)3次。經(jīng)過3次繼代后,統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.2.4胚性愈傷組織誘導(dǎo)

以MS+7.0 g/L瓊脂為基本培養(yǎng)基,附加不同質(zhì)量濃度的激素和蔗糖,pH值調(diào)節(jié)到5.8。

將誘導(dǎo)的甜瓜松散型愈傷組織轉(zhuǎn)接到含有不同激素的MS培養(yǎng)基上,進行松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)。每瓶接種5塊,每個處理接種10瓶,重復(fù)3次。15 d后,結(jié)合壓片觀察選擇結(jié)構(gòu)松散且細胞個體小,細胞質(zhì)濃度高,外形為球狀的愈傷組織團進行繼代轉(zhuǎn)接。5次繼代培養(yǎng)后,統(tǒng)計愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.3 培養(yǎng)條件

試驗過程中培養(yǎng)基均采用100 mL廣口三角瓶為容器,每個三角瓶加入約30 mL的培養(yǎng)基,pH值調(diào)至5.8～6.0,121 ℃、0.1 MPa下滅菌30 min。培養(yǎng)條件均為24 h光照,光照強度為2 000 lx,培養(yǎng)溫度為(23±2)℃。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel2013軟件統(tǒng)計分析。

愈傷組織誘導(dǎo)率/%=(形成愈傷組織的外植體數(shù)/外植體總數(shù))×100%;

胚性愈傷組織誘導(dǎo)率/%=(核占比大于30%的細胞數(shù)/總的細胞數(shù))×100%。

用測微尺分別測量被觀測細胞核與細胞的直徑,再計算比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織誘導(dǎo)情況

接種甜瓜葉片后,大約培養(yǎng)10 d,在葉片傷口部位有明顯愈傷組織。從表1可知,在不添加任何激素處理下,外植體出愈率為12.25%,顯著低于其他處理,隨著培養(yǎng)時間增長,葉片變黃,傷口褐變。在添加2,4-D的培養(yǎng)基中均能誘導(dǎo)出愈傷組織,且2,4-D濃度為2.0 mg/L時愈傷組織誘導(dǎo)速度較快,在接種5 d后葉片體積膨大,15 d左右有明顯愈傷組織形成。降低蔗糖含量至20 g/L能有效地提高葉片誘導(dǎo)愈傷速度,培養(yǎng)10 d后有大量愈傷組織形成。在2,4-D的作用下誘導(dǎo)出的白色且結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較軟的松軟型愈傷組織,后期多數(shù)會褐變死亡。加入一定量的分裂素能有效控制褐變情況,當(dāng)6-BA濃度為0.1 mg/L時(圖1),愈傷組織呈黃綠色且結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬,具有多種應(yīng)用方向,可以持續(xù)誘導(dǎo),產(chǎn)生不同類型的愈傷組織。但從愈傷組織生長速度和形態(tài)來看,蔗糖用量與分裂素配合使用都會對誘導(dǎo)結(jié)果產(chǎn)生較大的影響。因此,理想的甜瓜愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.1 mg/L 6-BA+2.0 mg/L 2,4-D+20 g/L蔗糖。

表1 不同培養(yǎng)基對甜瓜葉片外植體愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果Table 1 Callus induction results of Cucumis melo L. leaf explants in different media

2.2 松散型愈傷組織誘導(dǎo)情況

從表2可以看出,在原培養(yǎng)基上持續(xù)誘導(dǎo),會使得愈傷組織質(zhì)地變軟,隨著分裂素的增加,愈傷組織質(zhì)地越來越硬,過高濃度的分裂素使得生長速度變慢,且結(jié)構(gòu)變得緊密。與6-BA相比分裂素KT與2,4-D組合誘導(dǎo)的愈傷組織生長速度慢且結(jié)構(gòu)更加緊密,質(zhì)地硬,顏色呈黃色(圖2A1),細胞組織化嚴重(圖2A2),達不到理想的松散狀態(tài)。而0.5 mg/L的6-BA與2.0 mg/L 2,4-D結(jié)合處理下可以誘導(dǎo)出松散型的愈傷組織,但高濃度的2,4-D會使得愈傷組織快速生長,細胞分裂減少,體積膨大,形成細胞核較小的大細胞(圖2B1),導(dǎo)致愈傷組織稀軟(圖2B2),不利于后期愈傷組織的胚性化。當(dāng)降低2,4-D濃度至1 mg/L時,結(jié)合0.1 mg/L低濃度的6-BA愈傷組織(圖2C1)呈現(xiàn)出結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地軟的狀態(tài)且顏色為黃白色,而壓片觀察發(fā)現(xiàn)細胞體積大都呈長條形,核占比小(圖2C2)。當(dāng)2,4-D濃度為1 mg/L時,提高分裂素6-BA能改變愈傷組織質(zhì)地,當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L時,愈傷組織結(jié)構(gòu)松散、質(zhì)地較硬,且生長速度較快,呈黃綠色(圖2D1),顯微鏡下細胞近似圓形,體積適中,數(shù)目較多(圖2D2)是松散型愈傷組織的最佳狀態(tài)。綜上所述,理想的甜瓜松散型愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為:MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖。

圖1 0.1 mg/L BA+2.0 mg/L 2,4-D下誘導(dǎo)的松軟型愈傷組織 Fig.1 Soft callus induced under 0.1 mg/L BA+2.0 mg/L 2,4-D

注:A1為外源激素KT作用下愈傷組織;A2為A1對應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);B1為高濃度(2.0 mg/L)2,4-D下誘導(dǎo)的愈傷組織;B2為B1對應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);C1為0.1 mg/L BA+1.0 mg/L 2,4-D下誘導(dǎo)的愈傷組織;C2為C1對應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);D1為理想的甜瓜松散型愈傷組織;D2為D1對應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm)。圖2 不同外源激素下誘導(dǎo)的愈傷組織狀態(tài)以及細胞學(xué)鑒定Fig.2 Callus state induced by different exogenous hormones and cytological identification

表2 不同激素配比對甜瓜松散型愈傷組織的影響Table 2 Effects of different hormone ratios on loose callus of Cucumis melo L.

2.3 松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)情況

將甜瓜松散型愈傷組織轉(zhuǎn)接到胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上,培養(yǎng)一段時間后,愈傷組織質(zhì)地變得較硬,顏色加深,外表光滑,不同培養(yǎng)基下愈傷組織外觀差異不大,但經(jīng)顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn),愈傷組織細胞的形態(tài)和特性有明顯差異。從表3可知,在原培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,降低2,4-D濃度,愈傷組織生長速度逐漸減慢,質(zhì)地逐漸變硬,當(dāng)2,4-D濃度為0.25 mg/L時,愈傷組織出現(xiàn)少量胚性細胞(圖3A1)所示,胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為18.75%,顯著高于原培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率。但愈傷組織質(zhì)地硬,游離細胞少,多數(shù)組織化,顏色呈發(fā)黃且生長速度慢,老化快(圖3A2)。單一的降低2,4-D濃度可以誘導(dǎo)產(chǎn)生部分細胞胚性化,但相對高濃度的6-BA就會降低愈傷組織生長速度,導(dǎo)致愈傷組織質(zhì)地過硬,出現(xiàn)組織化的現(xiàn)象。當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L,2,4-D濃度為0.5 mg/L時胚性愈傷組織誘導(dǎo)率為15%,顯著高于1,2,3組處理,但愈傷組織生長狀態(tài)與2,4-D濃度為0.25 mg/L時相同,壓片觀察不同視野下,細胞總數(shù)少。從而說明胚性愈傷組織的誘導(dǎo)不僅需要調(diào)節(jié)6-BA與2,4-D濃度的高低,二者比例大小的調(diào)節(jié)也至關(guān)重要。當(dāng)2,4-D濃度為0.5 mg/L時,隨著6-BA濃度的降低愈傷組織生長速度逐漸加快,降至0.25 mg/L時,愈傷組織結(jié)構(gòu)松散,質(zhì)地較硬,生長速度較快呈黃綠色(圖3B2),但胚性愈傷組織誘導(dǎo)率較低,細胞多數(shù)進行無絲分裂形成體積較大,核較小的大細胞(圖3B1)。在0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D上誘導(dǎo)時發(fā)現(xiàn)降低6-BA濃度能加快生長速度,細胞數(shù)量增多(圖3C1、C2),但胚性愈傷組織誘導(dǎo)率與在0.5 mg/L6-BA+0.25 mg/L 2,4-D上誘導(dǎo)的無差異。配合蔗糖用量的改變,調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓,能有效控制愈傷組織生長速度以及胚性化程度。提高蔗糖用量,增加培養(yǎng)基滲透壓利于愈傷組織細胞向著胚性轉(zhuǎn)變。當(dāng)蔗糖提高到40 g/L時,胚性愈傷組織誘導(dǎo)率顯著提高,添加濃度為0.25 mg/L 6-BA以及0.5 mg/L 2,4-D時,愈傷組織顏色加深,生長速度較快,細胞數(shù)量增多,細胞體積小,核占比較大(圖3D1、D2),胚性愈傷誘導(dǎo)率為33.58%,顯著高于同樣激素下30 g/L蔗糖的誘導(dǎo)率。在0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D+40 g/L蔗糖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)4～5代后可明顯觀察到愈傷組織細胞變小、細胞質(zhì)濃度增大和細胞核加大等胚性細胞的一些特征(圖3E1、E2),胚性愈傷誘導(dǎo)率顯著高于其他處理,達69.44%。綜上試驗結(jié)果,理想的甜瓜松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D+40 g/L蔗糖。

注:A1為A2對應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);A2為0.5 mg/L BA+0.25 mg/L 2,4-D下誘導(dǎo)的愈傷組織;B1為B2對應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);B2為0.25 mg/L BA+0.5 mg/L 2,4-D下誘導(dǎo)的愈傷組織;C1為C2對應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);C2為0.25 mg/L BA+0.25 mg/L 2,4-D下誘導(dǎo)的愈傷組織;D1為D2對應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);D2為0.25 mg/L BA+0.5 mg/L2,4-D下誘導(dǎo)的愈傷組織(高滲透壓);E1為E2對應(yīng)的愈傷組織顯微觀察(bar=200 μm);E2為0.25 mg/L BA+0.25 mg/L 2,4-D下誘導(dǎo)的愈傷組織(高滲透壓)。圖3 不同激素與滲透壓下誘導(dǎo)的愈傷組織狀態(tài)以及胚性化程度的細胞學(xué)鑒定Fig.3 Callus state induced by different hormones and osmotic pressure and cytological identification for degree of embryogenesis

表3 激素與滲透壓對甜瓜愈傷組織胚性化的影響Table 3 Effects of hormones and osmotic pressure on embryogenesis of Cucumis melo L. callus

3 結(jié)論與討論

誘導(dǎo)胚性愈傷是一個前后連接的過程,前期愈傷組織的性質(zhì)會影響后期愈傷組織的胚性化程度,因此誘導(dǎo)愈傷組織的選材非常關(guān)鍵,不同外植體誘導(dǎo)的愈傷其生理特性也有所不同。在甜瓜愈傷組織誘導(dǎo)的研究進程中,大多數(shù)研究者采用無菌苗的子葉和下胚軸為外植體,魏曉明等[17]、駱開明等[18]利用子葉以及下胚軸研究不同激素對愈傷誘導(dǎo)率的影響;陳千紅和管和[19]利用甜瓜下胚軸研究外源激素對愈傷的組織效應(yīng),王愛玲等[20]、趙燕等[21]利用子葉下胚軸建立再生體系。本研究采用了經(jīng)開花結(jié)果的甜瓜莖段作為外植體,對于無菌苗的子葉以及下胚軸來說成熟的莖段生長能力以及細胞分裂能力相對較低,誘導(dǎo)愈傷組織的時間可能較長。如武云鵬等[22]、喬永旭[11]研究表明,子葉和下胚軸的誘導(dǎo)愈傷組織的速度明顯高于真葉,且子葉誘導(dǎo)的愈傷組織生長速度最快、品質(zhì)最好、數(shù)量最多。而劉麗鋒等[23]研究發(fā)現(xiàn),田間葉片誘導(dǎo)愈傷組織效率高于無菌苗葉片?？紤]到甜瓜品種以及實驗環(huán)境的不同從而導(dǎo)致二者的結(jié)論的相悖。在生產(chǎn)上,真葉的誘導(dǎo)實用性更強,取材更加直觀、便捷,節(jié)約生產(chǎn)成本。外植體幼嫩程度也可能會在誘導(dǎo)出的松散型胚性愈傷形成胚狀體過程中有一定影響,本次試驗誘導(dǎo)出了松散型胚性愈傷還有待進一步研究體胚的誘導(dǎo)。

碳源在誘導(dǎo)愈傷組織過程中是必不可少的,尤其在誘導(dǎo)胚性愈傷過程中[25]。植物愈傷組織誘導(dǎo)中蔗糖在眾多碳源中被普遍運用,本試驗研究發(fā)現(xiàn),適當(dāng)升高蔗糖的濃度到40 g/L更加利于甜瓜胚性愈傷的誘導(dǎo)。這一現(xiàn)象在洋蔥以及珍珠黃楊等胚性愈傷誘導(dǎo)上同樣適用。代月等[25]研究發(fā)現(xiàn),適當(dāng)增加蔗糖濃度有利于洋蔥胚性愈傷的誘導(dǎo)。李華[26]研究得出胚性愈傷組織狀態(tài)調(diào)整中,最適蔗糖濃度為45～55 g/L。提高蔗糖濃度一方面增加了營養(yǎng)的供給,另一方面也適當(dāng)增加了培養(yǎng)基滲透壓。高滲透壓下更有利于細胞體積變小,液泡濃縮,細胞核增大。研究表明,胚胎發(fā)生細胞的共同特征包括小尺寸,致密的細胞質(zhì)內(nèi)容物,大核,突出的增大的核,小液泡[25],根據(jù)愈傷組織狀態(tài)提高蔗糖濃度能達到此種狀態(tài)特征,從而高效的誘導(dǎo)胚性愈傷。

本試驗以成熟葉片為外植體誘導(dǎo)甜瓜松散型胚性愈傷組織誘導(dǎo),以MS+0.25 mg/L 6-BA+0.25 mg/L 2,4-D+40 g/L蔗糖為最佳培養(yǎng)樣基,為甜瓜快速繁殖、大規(guī)模量產(chǎn)、體細胞離體誘變育種及植物組培脫毒等研究提供參考。有關(guān)甜瓜胚性愈傷組織的體細胞胚胎發(fā)生還在進一步研究中。