楊文曲,韓沖芳,王 慧,陳 焱,賀建東,師高翔,段應(yīng)磊,趙雪麗,常 鑫

心肌缺血再灌注損傷是心臟手術(shù)和冠心病病人非心臟手術(shù)中常見的病理生理過程,在損傷心肌組織的同時,還會引發(fā)腦細(xì)胞線粒體膜去極化和線粒體功能障礙,同時表現(xiàn)出認(rèn)知功能下降[1-3]。自噬是一種分解、清除細(xì)胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的分解代謝機(jī)制,可在神經(jīng)元細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和突觸可塑性調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用[4]。研究表明,激活海馬體自噬對術(shù)后認(rèn)知功能障礙有神經(jīng)保護(hù)作用[5]。而心肌缺血再灌注所致認(rèn)知障礙與海馬體自噬之間的關(guān)系尚未明確,本研究擬探討心肌缺血再灌注致大鼠認(rèn)知障礙與海馬體自噬的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組

選取SD大鼠60只,19～21月齡,體質(zhì)量300～350 g,采用隨機(jī)數(shù)字表法分為未處理組(U組)、假手術(shù)組(S組)和心肌缺血再灌注組(I/R組),每組20只。大鼠于潔凈、干燥環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2 模型制備方法

制備心肌缺血再灌注致認(rèn)知障礙模型。大鼠禁食12 h后進(jìn)行麻醉[3%仙臺病毒(SeV)誘導(dǎo),2% SeV維持]。行光棒引導(dǎo)下氣管插管,連接動物呼吸機(jī)行機(jī)械通氣(頻率60次/min,潮氣量20 mL/kg,吸/呼比1∶2),經(jīng)BL-420F生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)行心電圖(ECG)監(jiān)測。參考文獻(xiàn)[1],采用結(jié)扎左冠狀動脈前降支(LAD)30 min后開放LAD的方法制備心肌缺血再灌注致認(rèn)知障礙模型。經(jīng)第3肋與第4肋間開胸,在左心耳根部與肺動脈圓錐之間用6-0絲線結(jié)扎LAD。結(jié)扎后ECG顯示ST段抬高,結(jié)扎線以下心肌組織發(fā)紺,說明實(shí)現(xiàn)心肌缺血。30 min后去除絲線,恢復(fù)灌注,關(guān)閉胸腔,采用荷包縫合法縫皮。去除絲線后ECG顯示ST-T段降低50%以上,先前缺血的心肌復(fù)紅,表明實(shí)現(xiàn)心肌再灌注。S組僅穿線不結(jié)扎,U組不處理。

1.3 Morris水迷宮行為學(xué)試驗(yàn)

進(jìn)行Morris水迷宮行為學(xué)試驗(yàn)。1)造模前連續(xù)6 d行定向航行訓(xùn)練(每日3次)檢測大鼠空間學(xué)習(xí)、運(yùn)動能力,平臺固定于SE象限,大鼠在平臺上學(xué)習(xí)30 s后,進(jìn)入水迷宮水池中。經(jīng)水浴池上方的攝像系統(tǒng)化軟件跟蹤記錄其游泳速度和潛伏期,潛伏期上限設(shè)置為60 s,潛伏期≥60 s者均記為60 s并被引導(dǎo)至平臺停留學(xué)習(xí)15 s。2)造模次日行空間探索試驗(yàn)檢測造模后記憶水平變化。撤去平臺,將系統(tǒng)識別平臺位置設(shè)置為造模前試驗(yàn)平臺區(qū)域。將大鼠隨機(jī)放入水迷宮水池中,跟蹤記錄大鼠穿越平臺的次數(shù)。

1.4 海馬體Beclin1、微管相關(guān)蛋白輕鏈3Ⅱ(LC3Ⅱ)的蛋白表達(dá)檢測

采用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量法檢測海馬體Beclin1、LC3Ⅱ的蛋白濃度,并采用蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)?？臻g探索試驗(yàn)后立即處死大鼠取海馬體,加入RIPA裂解液研磨、超聲粉碎,4℃下,13 000 r/min離心30 min,取上清液,經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳、轉(zhuǎn)膜后,脫脂牛奶4 ℃封閉2 h。加入一抗Beclin1(1∶1 000)、LC3Ⅱ(1∶1 000)4 ℃過夜后,用TBST漂洗后分別加入抗鼠(1∶500)、抗兔(1∶500),室溫孵育90 min。TBST漂洗后經(jīng)化學(xué)發(fā)光法顯影,采用Image J軟件分析,以條帶灰度值反映Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Morris水迷宮試驗(yàn)結(jié)果

定向航行試驗(yàn):3組大鼠各時間點(diǎn)游泳速度和潛伏期比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),且潛伏期逐日縮短。詳見表1、圖1?？臻g探索試驗(yàn):U組穿越平臺次數(shù)為(6.50±0.56)次,S組穿越平臺次數(shù)為(4.60±0.43)次,I/R組穿越平臺次數(shù)為(3.15±0.42)次。與U組比較,S組和I/R組穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05);與S組比較,I/R組穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05)。詳見圖2。

圖1 3組定向航行試驗(yàn)潛伏期比較

圖2 3組穿越平臺次數(shù)比較

表1 3組定向航行試驗(yàn)游泳速度比較(±s) 單位:cm/s

2.2 Western Blot檢測大鼠海馬體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與U組比較,S組和I/R組海馬體Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05);與S組比較,I/R組Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)上調(diào)(P<0.05)。詳見圖3。

圖3 各組大鼠海馬體Beclin1、LC3Ⅱ蛋白表達(dá)條帶圖

2.3 I/R組大鼠穿越平臺次數(shù)與海馬體自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,心肌缺血再灌注后大鼠在空間探索試驗(yàn)中穿越平臺次數(shù)與Beclin1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.578,P<0.05),與LC3Ⅱ蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.513,P<0.05)。

3 討 論

Morris水迷宮試驗(yàn)是檢驗(yàn)嚙齒類動物神經(jīng)認(rèn)知疾病模型的典型方案,常用試驗(yàn)方法有定向航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)[6]。本研究通過參照文獻(xiàn)[7],采用結(jié)扎LAD 30 min后開放LAD的方法建立心肌缺血再灌注致認(rèn)知障礙模型,并利用Morris水迷宮試驗(yàn)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽淝闆r。造模前,通過定向航行試驗(yàn)評價大鼠造模前的學(xué)習(xí)和運(yùn)動能力,結(jié)果顯示,3組大鼠各時間點(diǎn)游泳速度和潛伏期比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,潛伏期逐日縮短,表明造模前各組大鼠學(xué)習(xí)、運(yùn)動能力相仿且確實(shí)形成了對平臺所在空間位置的記憶,為大鼠心肌缺血再灌注后通過空間探索試驗(yàn)檢驗(yàn)?zāi)Ｐ椭苽淝闆r奠定基礎(chǔ),并排除大鼠學(xué)習(xí)記憶和運(yùn)動能力低下對檢驗(yàn)結(jié)果的影響?？臻g探索試驗(yàn)可評價大鼠長期記憶水平,本研究于心肌缺血再灌注次日進(jìn)行空間探索試驗(yàn),結(jié)果顯示,心肌缺血再灌注后大鼠穿越平臺次數(shù)較未經(jīng)處理或假手術(shù)大鼠穿越平臺次數(shù)明顯減少,表明心肌缺血再灌注后大鼠出現(xiàn)認(rèn)知水平下降,模型制備成功。

心肌缺血再灌注損傷會引發(fā)腦細(xì)胞線粒體功能障礙、蛋白異常聚集和神經(jīng)元損傷[1,8]。自噬是細(xì)胞內(nèi)異常蛋白質(zhì)和細(xì)胞器的分解、清除代謝途徑之一,可在應(yīng)激狀態(tài)下維持神經(jīng)元活性[9]。LC3Ⅱ可參與自噬體形成,并介導(dǎo)自噬體與溶酶體融合,因其表達(dá)量與細(xì)胞中自噬體和自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)數(shù)量呈正相關(guān),而廣泛用于評估自噬活性[10]。Beclin1通過翻譯后修飾參與調(diào)節(jié)自噬體形成和成熟過程,是調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬活性的核心參與者[11-12]。本研究中,心肌缺血再灌注后大鼠腦海馬體組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3Ⅱ表達(dá)較未經(jīng)處理或假手術(shù)大鼠上調(diào),表明大鼠心肌缺血再灌注過程伴隨有腦海馬體神經(jīng)元自噬水平的提高。

自噬可以降解神經(jīng)元內(nèi)受損線粒體和異常蛋白質(zhì),也可以參與神經(jīng)元的生長和成熟與突觸的可塑性調(diào)節(jié),從而維持神經(jīng)元的活性和功能[4]。本研究應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析方法,探討心肌缺血再灌注所致大鼠認(rèn)知水平下降與大鼠腦海馬體神經(jīng)元自噬水平提高的關(guān)系,結(jié)果顯示,心肌缺血再灌注后大鼠空間探索試驗(yàn)穿越平臺次數(shù)與其腦海馬體組織中自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3Ⅱ蛋白表達(dá)均呈正相關(guān),提示大鼠心肌缺血再灌注過程中伴隨的腦海馬體神經(jīng)元自噬水平的提高可能有利于維持空間記憶、保護(hù)認(rèn)知功能。有研究表明,可通過下調(diào)自噬相關(guān)抑制性受體增強(qiáng)小鼠海馬體神經(jīng)元自噬功能,減輕敗血癥相關(guān)性腦病及其認(rèn)知缺陷[13]。也有研究表明,大鼠腦缺血再灌注1 h后海馬體神經(jīng)元自噬水平明顯增強(qiáng),而再灌注24 h后溶酶體相關(guān)功能障礙的出現(xiàn)會導(dǎo)致自噬通量受損,神經(jīng)元損傷[14]。本研究中大鼠心肌缺血再灌注后雖有腦海馬體神經(jīng)元自噬水平的提高,但仍導(dǎo)致了不同程度的認(rèn)知障礙,可能與神經(jīng)元自噬水平提高不足或受限有關(guān),其具體機(jī)制有待通過自噬激活劑干預(yù)或?qū)ψ允赏窟M(jìn)一步研究。

綜上所述,大鼠心肌缺血再灌注過程伴隨有腦海馬體神經(jīng)元自噬水平的提高,且可能有利于減輕心肌缺血再灌注過程所致大鼠認(rèn)知障礙。