丁輝陽 雷雯 許露 肖尚杰 周佳亮 原麗科 黃蓉 張亮 朱小春

1廣東省婦幼保健院新生兒外科，廣州 511400；2廣東省婦幼保健院婦幼研究所，廣州 511400

先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung's disease，HSCR，OMIM 142623）是一種先天性疾病，其特征是缺乏腸神經(jīng)節(jié)細胞，導(dǎo)致胃腸動力障礙，是新生兒功能性腸梗阻的主要原因，其發(fā)病率為1/4 000～1/5 000，男女發(fā)病率比為4∶1。目前普遍認為，HSCR主要發(fā)病機制與腸神經(jīng)嵴細胞的正常遷移、增殖、分化和存活異常有關(guān)，以及與腸祖細胞壁的相互作用受損，這個過程對于腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）的正常發(fā)育至關(guān)重要。ENS是一個十分復(fù)雜的過程，受其自身各種基因與環(huán)境中各種調(diào)控因子的影響和精確調(diào)節(jié)。許多報道已經(jīng)研究了HSCR可能的遺傳原因，據(jù)報道超過24個基因和7個染色體位點在HSCR的發(fā)展中起著重要作用，其中配體酪氨酸蛋白激酶受體（RET）和內(nèi)皮素受體B（EDNRB）作為與HSCR疾病相關(guān)的主要基因在多個病例中被檢測到［1-3］。RET基因突變占散發(fā)病例的20%和家族性病例的50%［2］。EDNRB基因突變占所有HSCR病例的5%～10%［3］。對東亞人群中的短段型HSCR（short-segment HSCR，S-HSCR）病例進行全外顯子組測序（WES）分析，EDNRB基因突變總體風險高于RET［4］。當家族中出現(xiàn)HSCR復(fù)發(fā)時，子代患病的風險會增加200倍［5-6］，即使在具有明顯單基因遺傳的家系中，家系內(nèi)和家系間表現(xiàn)出不完全外顯率和表型嚴重程度不一致的情況，這可能推論出其他一些因素參與到HSCR形成過程，例如基因修飾、隨機表達、環(huán)境因素等［7］。

資料與方法

1.臨床資料

患者1：母親（Ⅱ2）被診斷為HSCR（具體病情不詳）并在3歲時接受手術(shù)，術(shù)后未發(fā)生并發(fā)癥，此后也未出現(xiàn)腸道相關(guān)問題。

患者2：患者1的女兒（Ⅲ1），通過輔助生殖技術(shù)孕2產(chǎn)1，在妊娠40周后于2021年4月14日出生，出生體質(zhì)量為3 150 g。出生后當天患兒進食后出現(xiàn)腹脹，伴嘔吐綠色胃液，未自行排胎便，無嘔血、發(fā)熱、發(fā)紺等異常，予灌腸后可見較多墨綠色胎糞，腹部平片提示腸管積氣并明顯擴張，灌腸造影顯示直腸段及乙狀結(jié)腸遠端狹窄，直腸壺段呈“S”形，降橫結(jié)腸明顯擴張，回盲部結(jié)構(gòu)未見異常。該患兒被診斷為HSCR常見型，并在出生84 d時接受了外科手術(shù)。

本研究經(jīng)廣東省婦幼保健院醫(yī)學倫理委員會審批通過（202001101），已簽署知情同意書。

2.WES和Sanger測序

2.1.樣品和DNA提取 該患兒家屬簽訂知情同意書后，收集了該家庭成員的外周血樣本。獲得母親的兄弟和他女兒的口腔拭子用于測序驗證?；蚪MDNA提取使用RelaxGene血液DNA試劑盒（中國北京天根生物科技有限公司）從300 μl外周血樣本或口腔拭子中獲得。提取的DNA于-20 ℃保存，為測序做準備。

2.2.WES檢測 使用Agilent SureSelect Human All Exon Kit v6（Agilent Technologies， Inc.， Santa Clara， CA， USA）進行基因組DNA雜交；使用Illumina HiSeq X Ten 平臺（Illumina，Inc.， San Diego，美國加利福尼亞州）測序及文庫構(gòu)建。

2.3.數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)分析結(jié)果進行分析和注釋，生成的bam文件由SAMtools進行排序?；蚪M分析工具包（GATK；https：//software.broadinstitute.org/gatk/）用于檢測SNV和插入缺失（＜50 bp），并應(yīng)用CNVki（t17）檢測拷貝數(shù)變異（CNV）。為了使用SNV數(shù)據(jù)計算純合子比率，采用了以下規(guī)則：（1）去除了深度＜20x的SNP；（2）只有變異等位基因頻率在0.2和0.8之間的SNP被認為是雜合。

2.4.EDNRB基因外顯子2測序 通過PCR擴增EDNRB基因的外顯子2。正向（F）和反向（R）引物序列如下：EDNRB（F）5'-CAGAGATAATGACGCCACCC-3'和（R）5'-CGATCAAGATATTGGGACCG-3'，擴增程序包括95 ℃變性步驟（10 min），95 ℃（30 s）、52 ℃（20 s）和72 ℃（40 s）40個循環(huán)。PCR產(chǎn)物用正向引物測序。

3.文獻檢索

檢索萬方、維普、中國知網(wǎng)、PubMed、Medline數(shù)據(jù)庫，搜索關(guān)鍵詞“：先天性巨結(jié)腸（Hirschsprung's disease）“”EDNRB基因（EDNRB gene）”，檢索2022年10月前公開發(fā)表的文獻。剔除標準：（1）剔除無法獲得全文資料的文獻；（2）對同一作者、醫(yī)院、研究所、數(shù)據(jù)庫重復(fù)報道突變予以剔除。檢索到15篇相關(guān)文獻（共報道26個可能致病的突變位點）。

結(jié)果

1.基因分析

WES和Sanger測序在4個家系成員中鑒定出1個新的EDNRB基因重復(fù)突變c.367delinsTT（p.L123Fter32），該突變會導(dǎo)致基因移碼，32個核苷酸的變化（c.123_155ter），使155位的氨基酸過早產(chǎn)生終止密碼子，從而生成功能區(qū)完全缺失的蛋白質(zhì)（圖1、2）。外婆和母親的染色3inv（3）（p11.2p23）和染色體9inv（9）（p12q13）均出現(xiàn)倒置。該家系的RET基因未檢測到突變。4名家系成員均是EDNRB雜合突變攜帶者，其中母親和女兒患病通過手術(shù)治療成功，外婆和舅舅并未表現(xiàn)出巨結(jié)腸的臨床癥狀，見表1。該雜合突變在家系中的外顯率為50%。

表1 4例EDNRB基因雜合突變攜帶者的臨床資料

圖1 三代家族系譜（Ⅰ～Ⅲ）

圖2 經(jīng)Sanger測序驗證的二代測序結(jié)果。Z001：患者1（母親），Z002：患者2（女兒），Z003：外婆，Z004：父親，Z005：母親的弟弟，Z006：弟弟的女兒

2.文獻分析

以“EDNRB基因”“HSCR”中英文為關(guān)鍵詞，檢索萬方、維普、中國知網(wǎng)、PubMed、Medline數(shù)據(jù)庫。在HSCR患者中報道了EDNRB基因的多種突變，包括缺失/插入突變、無義突變、剪接突變和幾種錯義突變。EDNRB基因突變被發(fā)現(xiàn)存在于幾種臨床癥狀中，最常見的是在HSCR和Shah-Waardenburg綜合征（WS4）［8］，或者HSCR合并唐氏綜合征［9］，HSCR合并多發(fā)性硬化癥（MS）［10］，這些報道表明EDNRB基因位于多個基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中并影響早期胚胎發(fā)育。EDNRB遺傳風險預(yù)測具有輔助診斷、提供遺傳咨詢、告知治療方案的潛在臨床應(yīng)用價值。與HSCR致病相關(guān)的EDNRB變異位點，包括我們在研究中發(fā)現(xiàn)的位點，如表2所示。

表2 目前已報道的EDNRB基因變異位點

討論

在此研究中，我們調(diào)查了1個患有HSCR疾病的家系，并發(fā)現(xiàn)了1個新的EDNRB突變。其中4個家系成員中攜帶1個新的 c.367delinsTT（p.L123Fter32） EDNRB雜合突變。該突變導(dǎo)致155位的氨基酸過早形成終止密碼子，產(chǎn)生功能區(qū)完全缺失的蛋白質(zhì)。我們得出結(jié)論，EDNRB基因c.367delinsTT（p.L123Fter32）突變可能對HSCR具有致病性。EDNRB（Chr 14位置103814625-103844173 bp）被確定為HSCR的潛在候選基因。人類基因組包含EDNRB基因的單個拷貝，該基因長度24 kb，包含7個外顯子和6個內(nèi)含子，編碼442個氨基酸的蛋白質(zhì)［25-26］。EDNRB是黑色素母細胞和腸神經(jīng)母細胞遷移所必需的，通過EDNRB的信號傳導(dǎo)對于ENS的發(fā)育至關(guān)重要，EDNRB基因的突變導(dǎo)致人類HSCR神經(jīng)節(jié)細胞缺乏癥。Shin等［27］確定EDNRB在胚胎第10天和第12.5天之間的神經(jīng)嵴發(fā)育期內(nèi)是必需的。Lee等［28］研究表明，EDNRB蛋白及其配體edn3在小鼠的腸神經(jīng)嵴細胞系及人黑色素瘤細胞系的發(fā)育及分化過程中起至關(guān)重要的作用。EDNRB基因點突變的小鼠模型表現(xiàn)出HSCR表型。

患兒雜合突變基因遺傳自她健康的外婆，這一事實表明其他未鑒定的基因區(qū)域（內(nèi)含子和啟動子）或其他因素可能導(dǎo)致該家系中HSCR疾病的發(fā)生。表觀遺傳變異在人類疾病的發(fā)展過程中起著重要作用。啟動子甲基化引起的轉(zhuǎn)錄沉默已被認為是抑癌基因失活的一種常見機制［29］。EDNRB的5’端含有大量的CpG重復(fù)序列，這些CpG位點的甲基化可以調(diào)節(jié)基因表達［30］。啟動子甲基化可引起基因表達的沉默，異常甲基化與mRNA轉(zhuǎn)錄減少有關(guān)［30］。Eberle等［30］檢測到在HSCR中EDNRB基因低甲基化水平高于對照組，EDNRB表達的調(diào)節(jié)可能是由于在HSCR中檢測到的異常甲基化引起的。本家系中HSCR疾病的外顯率為50%，我們推測EDNRB基因啟動子區(qū)域的不同甲基化方式使外婆和舅舅不患病，而母親和女兒表現(xiàn)HSCR癥狀。

HSCR中EDNRB異常表達的可能有至少兩種機制：基因突變和異常啟動子甲基化［31］。該突變對劑量敏感，純合子和雜合子發(fā)生HSCR的風險分別為74%和21%［22］。本研究中EDNRB基因雜合突變的風險為50%，高于常見的雜合突變。臨床觀察男性的巨結(jié)腸發(fā)生率顯著高于女性，而該家系未出現(xiàn)男性患病情況。目前，對于HSCR的發(fā)病機制沒有統(tǒng)一的定論，基因突變也只能解釋70%左右的病例，說明HSCR是一種具有復(fù)雜遺傳模式的多基因遺傳?。?2］。任何影響ENS發(fā)育過程的調(diào)控因子出現(xiàn)異常，這些調(diào)控基因均可能成為HSCR致病基因。

我們研究了患有HSCR家系中EDNRB突變的遺傳原因，4名成員是EDNRB雜合子突變攜帶者，2名患病成員有明顯HSCR癥狀，而其他人則表現(xiàn)健康。我們假設(shè)新的EDNRB（L123Fter32）突變只是致病因素之一。WES會忽略內(nèi)含子區(qū)域和啟動子區(qū)域甲基化程度。EDNRB基因的啟動子區(qū)低甲基化可能在HSCR的發(fā)生發(fā)展中起作用。啟動子甲基化對突變基因的致病外顯率影響需要更多HSCR病例進行基因修飾分析來證實。外婆和母親均有倒置染色體3inv（3）（p11.2p23）和染色體9inv（9）（p12q13），但與疾病無相關(guān)性。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明丁輝陽：醞釀和設(shè)計試驗，實施研究，采集、分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，獲取研究經(jīng)費；雷雯：醞釀和設(shè)計試驗，實施研究，采集、分析/解釋數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計分析；許露：醞釀和設(shè)計試驗，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，指導(dǎo)；肖尚杰、周佳亮、原麗科、黃蓉：對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，指導(dǎo)，支持性貢獻；張亮：醞釀和設(shè)計試驗，實施研究，分析/解釋數(shù)據(jù)，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，統(tǒng)計分析，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻；朱小春：醞釀和設(shè)計試驗，實施研究，采集數(shù)據(jù)，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，獲取研究經(jīng)費，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)，支持性貢獻