王萌 趙虎 徐曉美 潘堯鏵 趙曾菁 吳星 王日升

關(guān)鍵詞：辣椒；全基因組重測序；胞質(zhì)雄性不育；恢復基因；分子標記

辣椒（Capsicumspp.）是世界最大的調(diào)味料作物和世界第三大蔬菜作物，也是我國種植面積最大、加工方式最多、消費功能最多的蔬菜和最大的調(diào)味品[1]。目前辣椒雜交制種生產(chǎn)仍較多采用人工去雄，種子生產(chǎn)成本高，與國外品種相比缺乏市場競爭力[2]。利用辣椒胞質(zhì)雄性不育（CMS）進行三系雜交制種不僅可以確保雜交種子純度，更有利于保護品種的知識產(chǎn)權(quán)，是辣椒育種發(fā)展的主要趨勢[3]。開發(fā)與辣椒CMS恢復基因緊密連鎖的分子標記，大規(guī)模對自交系及中間材料進行恢復基因篩選，可大大提高三系育種效率。

辣椒CMS育性恢復的遺傳控制多樣且復雜，多數(shù)研究者認為辣椒Rf基因由1個顯性基因控制的[4-5]，WEI等[6]認為辣椒CMS恢復基因（Rf）是受2個主加性－顯性上位基因和1個加性-顯性多基因控制，也有認為辣椒CMS育性恢復與1個主QTL和4個小QTL有關(guān)[7]。針對辣椒Rf基因，前人已經(jīng)開發(fā)了多種類型的分子標記用于輔助育種，這些標記包括隨機擴增多態(tài)性（RAPD）標記[8]、簡單重復序列（SSR）標記[9]、插入/缺失（InDel）標記[10]、切割擴增多態(tài)性序列（CAPS）標記[11]、序列特征擴增區(qū)（SCAR）標記[12]和競爭性等位基因特異性PCR（KASP）標記[6，13]等。其中應用最廣泛的標記CRF-SCAR[12，14]在不同自然群體中對育性恢復性狀的準確率最高，同一標記在不同群體間準確率差異較大，準確率較高的報道有89.1%[4]、79.2%[15]和100%[16]。這些結(jié)果進一步說明，辣椒基因組包含多個候選Rf基因，不同恢復系可能具有基因型特異性的Rf基因[11，15，17-18]，目前尚無通用標記，特異的恢復基因需要開發(fā)相應的標記才更有效。

目前，最廣泛使用的CRF-SCAR標記[15，17]不能區(qū)分本單位的不育系014A和恢復系014C，說明恢復系014C可能具有不同Rf基因，需要開發(fā)相應的連鎖標記。深度測序結(jié)合BSA法，在不構(gòu)建遺傳圖譜的情況下，可快速定位正向遺傳學的性狀位點[19]，快速篩選目標基因以獲得緊密連鎖分子標記[20]，目前已用于多種作物質(zhì)量性狀或主效基因的定位，如尹明智等[21]利用該方法定位了油菜野芥胞質(zhì)雄性不育恢復基因；LI等[22]利用BSA法結(jié)合基因組測序和轉(zhuǎn)錄組測序，聯(lián)合分析獲得了大白菜中與葉狀頭形成相關(guān)的共同候選基因。本研究以不育系014A和恢復系014C構(gòu)建了F2分離群體，利用BSA法結(jié)合全基因組重測序，獲得辣椒CMS恢復基因相關(guān)定位區(qū)間，根據(jù)區(qū)間內(nèi)的差異SNP/InDel設(shè)計引物，篩選恢復基因連鎖分子標記，為加速選育辣椒CMS恢復系奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

以不育系014A×恢復系014C構(gòu)建F2分離群體，正常田間管理，于花期調(diào)查育性，構(gòu)建測序所需基因可育混池和不育混池，可育混池單株分別隔離，單株留種，每個單株種植30個子代，調(diào)查育性分離情況，判斷可育混池內(nèi)單株基因型為RfRf或Rfrf。試驗材料種植于廣西農(nóng)業(yè)科學院基地。

1.2方法

1.2.1育性調(diào)查2020年對F2群體1008個單株進行插牌編號，田間正常管理，于辣椒開花期開展3次以上育性調(diào)查并記錄，參考花粉指數(shù)（PI）法：根據(jù)肉眼觀察花粉數(shù)量分為1～4級，每株調(diào)查10朵花，在開花當天進行觀察。1級：花藥上布滿花粉，同可育親本無明顯差異；2級：有花粉，但不及可育親本的一半，花粉量明顯減少；3級：有很少量的花粉；4級：花藥干癟皺縮，無可見的花粉。對于不易判定等級的調(diào)查的單株，采用多次調(diào)查的方法，同時調(diào)查自然坐果率和果內(nèi)種子數(shù)量進行輔助判斷并記錄。

1.2.2建池、測序與數(shù)據(jù)處理在F2群體采集單株葉片提取DNA，同時分別選擇1級和4級各30個單株，分別取幼嫩葉片0.1g用于DNA的提取，DNA分別等量混合構(gòu)建不育基因池和可育基因池。2個混池連同親本建庫后使用HiseqX10PE150上機測序，測序深度為30×。樣本由廣州基迪奧生物科技有限公司完成建庫和測序。測序得到的原始數(shù)據(jù)先進行過濾，獲得cleanreads，再利用Burrows-WheelerAligner（BWA，v0.7.16a-r1181）將過濾后的reads與辣椒參考基因組Ensembl_release47（http：//plants.ensembl.org/Capsicum_annuum/Info/Index）進行比對。比對結(jié)果使用GATK（v3.5）VariantFiltration模塊對SNP和InDel進行變異檢測。

1.2.3基于SNP-index的BSA分析與Fisher精確檢驗對辣椒育性連鎖定位區(qū)間進行篩選時，首先過濾不育和可育混池中SNP-index均小于0.3或大于0.7的位點，計算各混池的SNP-index和混池間的Δ（SNP-index），然后以滑動窗口法對Δ（SNP-index）在各個染色體上的分布制圖。置信區(qū)間設(shè)置為95%和99%，取正向置信水平99%以上窗口作為候選區(qū)間[23]。

采用Fisher精確檢驗法（SPSS21.0）對2個混池中的等位基因深度比例進行檢驗，顯著性使用P值表示，再次按照滑窗的方法對計算獲得的P值結(jié)果進行擬合，取P值的-log10后繪制曼哈頓圖。原始的P值進行FDR校正后獲得q值，篩選q值小于閾值（0.05）的位點作為顯著位點，連續(xù)的顯著位點合并成一個區(qū)間，獲得顯著區(qū)間。

1.2.4DNA提取與引物篩選采用改良的CTAB法提取親本及F2群體所有單株DNA，檢測合格后將濃度統(tǒng)一調(diào)整至50ng/μL用于后續(xù)試驗。根據(jù)定位區(qū)間獲得的基因、InDel/SNPs信息，結(jié)合前人報道恢復基因類型信息，每個基因至少設(shè)計1對以上的引物，優(yōu)先選擇位于外顯子區(qū)域的SNP和多態(tài)性差異5bp以上的InDel作為第一輪SSR/InDel分子標記，篩選在親本間呈現(xiàn)多態(tài)性的引物。在第一輪多態(tài)性引物附近，第二輪根據(jù)基因信息和InDel/SNPs設(shè)計更多的標記，再次利用雙親進行標記篩選，然后結(jié)合F2、F3育性田間調(diào)查結(jié)果，利用確定了基因型的30個可育混池單株（基因型為RfRf或Rfrf）、30個不育混池單株（基因型為rfrf）進行篩選，獲得準確率最高的分子標記，最后使用F2群體進行準確率驗證。

提取目標位點兩翼各150bp的堿基序列，使用Oligo6軟件進行引物設(shè)計。引物序列均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應總體系均為10μL，其中50ng/μL模版DNA1μL，TaqDNA聚合酶5μL，上下游引物（10μmol/L）各0.5μL，ddH2O3μL。PCR擴增程序參照王日勇等[24]的方法。擴增產(chǎn)物用8%變性聚丙烯酰胺凝膠110V電泳分離95min，用銀染法進行顯影；根據(jù)標記特征，分離群體內(nèi)驗證也可使用2%瓊脂糖，電壓120V，電泳35min；觀察結(jié)果并拍照保存。

2結(jié)果與分析

2.1F2代分離群體育性調(diào)查

通過不育系014A和恢復系014C雜交構(gòu)建的F2代分離群體1008個單株育性調(diào)查結(jié)果表明，花粉正常可育單株為785株，不育的單株為223株，可育、不育分離比例均接近3∶1，按1對基因的控制模式分別進行χ2測驗，χ2值為1.341，P值為0.247，P>0.05，符合理論預測，即可育和不育分離比符合3∶1的分離規(guī)律（表1），表明辣椒CMS育性恢復性狀受1對顯性基因控制。30個測序用的極端可育單株通過種植調(diào)查F3群體分離情況，育性不發(fā)生分離則親本為純合可育（RfRf），育性發(fā)生分離則親本為雜合可育（Rfrf），連同30個純合不育單株（rfrf）用于后續(xù)分子標記篩選與驗證。

2.2重測序混池數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

根據(jù)親本和混池重測序的相關(guān)數(shù)據(jù)結(jié)果顯示（表2），此次測序共得到450.60Gb原始數(shù)據(jù)，經(jīng)數(shù)據(jù)質(zhì)控過濾后獲得448.27Gb高質(zhì)量有效數(shù)據(jù)。樣品的GC堿基含量為36.08%～36.84%，測序質(zhì)量控制標準Q30>93.75%。不育、可育測試樣品與參考基因組的比對率分別為97.84%、97.67%。基因組覆蓋度20×比例約為80%以上。全基因組范圍內(nèi)分別檢測到950253個InDel和15142397個SNP。由此可知，本研究樣本數(shù)據(jù)量足夠，GC分布正常，測序質(zhì)量合格，測序數(shù)據(jù)與參考基因組比對結(jié)果正常，覆蓋度飽和，可用于后續(xù)的變異分析及目標性狀的基因定位。

2.3與辣椒CMS育性關(guān)聯(lián)的連鎖區(qū)間定位

基于SNP-index的BSA分析結(jié)果顯示，正向置信水平99%以上窗口有12個區(qū)間分別位于6號、8號、11號染色體上（表3，圖1）。由圖1可知，6號染色體定位區(qū)間峰值高、峰形寬大，8號染色體存在多個小峰，11號染色體也存在一個峰值高的狹窄峰。由表3可知，6號染色體的第一個定位區(qū)間最大，長度為26.72Mb，約占總區(qū)間長度32%，其中包含540個基因，約占基因總數(shù)的64%，基因分布相對集中。

為進一步縮小定位區(qū)間，采用Fisher精確檢驗法對2個混池中的等位基因深度比例進行檢驗，得到基于-log10（p）值的全基因組分布曼哈頓圖（圖2），獲得的定位區(qū)間為6號染色體1.44～8.28Mb，該區(qū)間內(nèi)包含4441個SNP、266個Indel和227個基因。

2.4分子標記開發(fā)

根據(jù)6號染色體1.44～8.28Mb候選區(qū)間內(nèi)227個基因及SNP/InDel位點，共設(shè)計了316對引物，擴增親本，篩選出27對在親本間差異顯著的標記。根據(jù)基因注釋獲得的3個恢復基因候選基因，然后重點在這3個基因附近設(shè)計引物并篩選，最終獲得了能穩(wěn)定擴增出特異條帶的標記OP59和PP5。OP59引物序列為F：5-TGGAACAGAGTCATATTTTTCTTTCAT-3、R：5-CCAATTCCGATAAAGGGTTTT-3。PP5引物序列為F：5-TCATTCTTTAGGGGAAGCTTAGG-3、R：5-CGGTGTGGACAGACATTTCA-3。根據(jù)SNP位點設(shè)計的標記OP59，在純合可育材料可擴增出282bp條帶，不育材料可擴增出278bp條帶，雜合單株能擴增出2條帶（圖3）。根據(jù)InDel位點設(shè)計的標記PP5，在不育親本、F2雜合可育單株、不育單株中均可擴增出約300bp的條帶，而純合可育親本和F2純合可育單株中無擴增條帶，該標記可使用瓊脂糖電泳更方便快速（圖4）。2個標記在極端群體驗證中準確率均達到100%。

將這2個標記在F2代分離群體隨機挑選的456個單株進行驗證，結(jié)果表明，2個標記在重測序的極端群體中準確率均達到100%。共顯性標記OP59在不育的群體中準確率為100%，在可育單株中準確率為97.21%。標記PP5在不育單株和純合可育單株中準確率均為100%。根據(jù)與參考基因組比對結(jié)果，標記OP59根據(jù)位于6號染色體3877192bp處SNP位點設(shè)計，參考堿基為A，突變堿基為G，該位點位于恢復基因候選PPR基因T459-15819基因間區(qū)，距離為17232bp；標記PP5根據(jù)位于6號染色體3897138bp處InDel位點設(shè)計，參考堿基為G，突變堿基為GT，該位點位于該基因下游318bp。

3討論

本研究表明，辣椒CMS核內(nèi)恢復基因經(jīng)BSA結(jié)合法結(jié)合全基因組重測序，比對參考基因組Ensembl_release47，經(jīng)Fisher精確檢驗，定位在6號染色體頂端1.44～8.28Mb區(qū)間，區(qū)間長度6.84Mb。WEI等[6]通過基于轉(zhuǎn)錄組測序的BSR-seq方法，通過與參考基因組Zunla-1比對，將恢復基因定位在6號染色體末端16.8Mb的區(qū)間，其使用的試驗材料包含的恢復基因被認為是受2個主加性-顯性上位基因和一個加性-顯性多基因控制。ZHANG等[25]也是使用BSA結(jié)合基因組重測序的方法在6號染色體的兩端分別獲得了一個恢復基因，該材料中辣椒CMS育性恢復同時受2對基因控制。本研究所使用的試驗材料F2群體中可育∶不育符合3∶1，因此育性恢復受1對基因控制，這與WEI等[6]、ZHANG等[25]的試驗材料不同，推測確實含有不同的恢復基因。

在許多農(nóng)作物中多個雄性不育恢復基因（Rf）已經(jīng)被鑒定，大多數(shù)恢復基因?qū)儆赑PR基因（編碼蛋白含有五肽重復序列），如水稻[26]、油菜[27]、棉花[28]等。在辣椒作物上，前人報道的恢復基因有PPR6[11]、PPR46[11]、NEDD8[18]、長鏈非編碼RNA[29]等。尹明智等[21]通過對基因定位的候選區(qū)域進行序列分析和基因注釋，發(fā)現(xiàn)其中的PPR基因，再進行基因克隆及功能驗證，這將是分析恢復基因的一種有效手段。本研究初步獲得的候選基因T459-15819也是屬于PPR基因，該基因是否為調(diào)控辣椒育性恢復的關(guān)鍵基因，以及如何影響育性的恢復還需進一步分析驗證。

本研究獲得的標記OP59屬于共顯性標記，不僅能夠區(qū)分基因純合可育（RfRf）植株和不育（rfrf）植株，還能鑒定出雜合可育（Rfrf）的植株，且準確率高，聚丙烯酰胺凝膠電泳即可分辨，在實際應用中非常簡便有效。標記PP5瓊脂糖凝膠電泳檢測即可，實際應用中可先用PP5檢出純合可育株，然后再用OP59檢出其他類型。

本研究構(gòu)建的F2群體中，根據(jù)花粉指數(shù)法將單株劃分為不同的等級，花粉量減少的2、3、4等級全部歸為不育，經(jīng)χ2測驗，可育和不育分離比符合3∶1，推測辣椒CMS育性恢復性狀受1對顯性基因控制，這與多數(shù)研究結(jié)果一致[4-5，9，14]。從本研究不育群體實際調(diào)查數(shù)據(jù)來看，單株間花粉量存在一定的差異，因此，本研究使用的恢復基因除受1對顯性基因控制外，在6號、8號、11號染色體上也可能存在育性修飾的微效基因，或基因表達受到環(huán)境影響，仍需進一步研究。