韓 娜,張 芳,劉小小,楊笑天,趙文超

1)鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 鄭州 450014 2)鄭州大學(xué)河南醫(yī)學(xué)院 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與神經(jīng)生物學(xué)系 鄭州 450001

食管癌是世界上常見(jiàn)的惡性腫瘤之一,病理類型包括食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和腺癌[1-2]。在我國(guó),90%以上的食管癌為ESCC[3-4]。ESCC患者的早期臨床癥狀并不典型,確診時(shí)往往處于中晚期,預(yù)后較差,5 a生存率較低[5-6]。維斯科特-奧爾德里奇綜合征蛋白(Wiskott-Aldrich syndrome protein,WASP)是一類肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié)蛋白,可協(xié)助肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白2/3復(fù)合物(actin-related protein2/3 complex,Arp2/3)促進(jìn)微絲的聚合,參與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的維持[7-8],調(diào)控細(xì)胞的吞噬、胞質(zhì)分裂、胞內(nèi)膜轉(zhuǎn)運(yùn)和遷移等[9-10]。研究[11-12]表明,WASP家族的多個(gè)成員參與了宮頸癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌以及前列腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。肌動(dòng)蛋白、細(xì)胞膜和微管相關(guān)的WASP同源物(WASP homolog associated with actin,membranes and microtubules,WHAMM)是WASP家族成員之一,在腫瘤中的作用尚未闡明。本研究觀察WHAMM在ESCC組織中的表達(dá)及對(duì)ESCC細(xì)胞生物學(xué)行為和患者預(yù)后的影響,探討WHAMM對(duì)ESCC發(fā)生發(fā)展的影響。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本的獲取選擇2020年11月1日至2021年12月30日于鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的ESCC患者22例,收集切除的ESCC組織以及配對(duì)的癌旁正常食管黏膜組織(距離腫瘤邊緣≥5 cm)標(biāo)本?；颊咝g(shù)前均未進(jìn)行抗腫瘤治療。TNM分期按照國(guó)際抗癌聯(lián)盟/美國(guó)癌癥聯(lián)合會(huì)食管癌分期標(biāo)準(zhǔn)(2017年第8版):Ⅰ期4例,Ⅱ期11例,Ⅲ期6例,Ⅳ期1例?；颊咧心?6例,女6例,年齡47～76歲,中位年齡65.5歲。本研究經(jīng)該院倫理委員會(huì)審查后批準(zhǔn),患者或家屬知情同意。

1.2 細(xì)胞和主要試劑人ESCC細(xì)胞系EC109和KYSE510購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)。RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)HyClone公司。攜帶WHAMM過(guò)表達(dá)載體的慢病毒及攜帶空載體的對(duì)照病毒購(gòu)自中國(guó)吉瑪基因公司。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。PrimeScript RT reagent反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。WHAMM一抗購(gòu)自中國(guó)百遠(yuǎn)生物公司,二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司,CCK-8試劑購(gòu)自中國(guó)索萊寶公司。Transwell小室購(gòu)自美國(guó)康寧公司。

1.3 ESCC和癌旁正常食管黏膜組織中WHAMM mRNA的表達(dá)

1.3.1數(shù)據(jù)庫(kù)信息 收集基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)數(shù)據(jù)集(GSE67269和GSE161533)中ESCC組織和癌旁正常食管黏膜組織WHAMM mRNA表達(dá)的數(shù)據(jù)(n=75和28)并分析兩種組織中WHAMM mRNA表達(dá)的差異。收集癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)中的有生存狀況的84例ESCC患者的相關(guān)數(shù)據(jù),分析WHAMM mRNA的表達(dá)與ESCC患者預(yù)后的關(guān)系。

1.3.2ESCC和癌旁正常食管黏膜組織中WHAMM mRNA表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè) ESCC和癌旁正常食管黏膜組織研磨后采用Trizol裂解,加入氯仿放置3 min后離心取上清,異丙醇沉淀RNA,體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇洗滌RNA沉淀兩次,無(wú)酶水溶解RNA后采用miScript Ⅱ RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA。采用qRT-PCR檢測(cè)組織中WHAMM mRNA的表達(dá)。WHAMM上游引物序列5’-TATTGCAGCCATT TAGGGCTATG-3’,下游引物序列5’-GGCAACTAC CCTTCTAGGACC-3’。GAPDH上游引物序列5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’,下游引物序列5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’。反應(yīng)體系:10 μL熒光染料,終濃度為0.4 μmol/L的上、下游引物各4 μL,cDNA 0.4 μL,添加無(wú)酶水至總體積20 μL。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃ 10 s,60 ℃ 10 s,72 ℃ 10 s,40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,計(jì)算2-ΔΔCt,作為基因的表達(dá)水平。

1.4 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

1.4.1細(xì)胞分組 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109和KYSE510細(xì)胞接種至24孔板(5×104個(gè)/孔),當(dāng)細(xì)胞融合至80%時(shí)分兩組:過(guò)表達(dá)組細(xì)胞加入攜帶WHAMM過(guò)表達(dá)的慢病毒,陰性對(duì)照組加入攜帶空載體的對(duì)照病毒。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后加入嘌呤霉素(1 mg/L)篩選,采用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞熒光。當(dāng)感染效率達(dá)到80%以上時(shí),用于以下實(shí)驗(yàn)。

1.4.2WHAMM蛋白的Western blot檢測(cè) PBS清洗各組細(xì)胞后加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液,冰上放置30 min后12 000 ×g離心10 min,提取上清后二喹啉甲酸法測(cè)定蛋白濃度,加入5×上樣緩沖液后煮沸5 min備用。制備濃縮膠和分離膠(80 g/L的SDS-PAGE),蛋白上樣后于150 mV電泳1.5 h,230 mV轉(zhuǎn)膜1.5 h,50 g/L脫脂牛奶封閉1 h后加入一抗4 ℃孵育過(guò)夜,清洗后50 g/L脫脂牛奶封閉1 h,加入二抗孵育1 h,加入增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液后上機(jī)顯影。Image J分析各條帶灰度,以WHAMM和β-actin條帶的灰度值比值代表WHAMM蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.3細(xì)胞增殖的CCK-8法檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109和KYSE510細(xì)胞消化后重懸,接種于96孔板(4×103個(gè)/孔),于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于第1、2、3和4天棄去舊培養(yǎng)基,加入CCK-8試劑與無(wú)血清培養(yǎng)基(體積比為1∶9),培養(yǎng)箱中放置1.5 h后采用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4.4細(xì)胞遷移和侵襲能力檢測(cè) 處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EC109和KYSE510細(xì)胞消化后采用不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基重懸,取200 μL細(xì)胞懸液(含5×104個(gè)細(xì)胞)加入Transwell上室,在Transwell下室加入600 μL培養(yǎng)基(體積分?jǐn)?shù)10%FBS)培養(yǎng),24 h后固定30 min,結(jié)晶紫染色30 min,生理鹽水清洗后棉簽擦拭小室上層,100倍顯微鏡下觀察并拍照。侵襲實(shí)驗(yàn)中,Transwell上室加入100 μL的基質(zhì)膠并放置24 h。采用Image J分析遷移或侵襲細(xì)胞數(shù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 21.0分析數(shù)據(jù)。采用配對(duì)資料的t檢驗(yàn)比較ESCC組織和癌旁正常食管黏膜組織中WHAMM mRNA的表達(dá)水平。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線,Log-rank檢驗(yàn)分析WHAMM mRNA的表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系。兩組細(xì)胞WHAMM mRNA和蛋白的相對(duì)表達(dá)量,吸光度值、遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ESCC組織和癌旁正常食管黏膜組織中WHAMM mRNA的表達(dá)GSE67269、GSE161533數(shù)據(jù)集和本研究收集標(biāo)本中,ESCC組織中WHAMM mRNA的表達(dá)高于癌旁正常食管黏膜組織(表1)。

表1 ESCC組織和癌旁正常食管黏膜組織中WHAMM的表達(dá)

2.2 WHAMM的表達(dá)與ESCC患者生存的關(guān)系根據(jù)WHAMM mRNA表達(dá)的中位數(shù)8.964,將TCGA-ESCC數(shù)據(jù)集中的84例ESCC患者分為WHAMM低表達(dá)組(≤8.964)和WHAMM高表達(dá)組(>8.964),兩組生存曲線比較見(jiàn)圖1。WHAMM低表達(dá)組的生存狀況好于高表達(dá)組(χ2=5.155,P=0.023)。

圖1 WHAMM低表達(dá)組和高表達(dá)組患者的生存曲線

2.3 兩組EC109和KYSE510細(xì)胞中WHAMM蛋白的表達(dá)與陰性對(duì)照組比較,過(guò)表達(dá)組EC109和KYSE510細(xì)胞中WHAMM蛋白表達(dá)增加,見(jiàn)表2。

表2 兩組EC109和KYSE510細(xì)胞中WHAMM蛋白表達(dá)的比較

2.4 兩組EC109和KYSE510細(xì)胞增殖情況與陰性對(duì)照組比較,過(guò)表達(dá)組EC109和KYSE510細(xì)胞的增殖能力增加,見(jiàn)表3、4。

表3 兩組EC109細(xì)胞的吸光度值比較

表4 兩組KYSE510細(xì)胞的吸光度值比較

2.5 兩組EC109和KYSE510細(xì)胞的遷移和侵襲情況與陰性對(duì)照組比較,過(guò)表達(dá)組EC109和KYSE510細(xì)胞的遷移和侵襲能力增加,見(jiàn)表5。

表5 兩組EC109和KYSE510細(xì)胞的遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)比較

3 討論

微絲是細(xì)胞骨架的主要成分之一,參與細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞形態(tài)的維持、大分子物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及細(xì)胞遷移等[13-14]。WASP家族蛋白是一類成核促進(jìn)因子,其C末端的結(jié)構(gòu)域能夠與Arp2/3和肌動(dòng)蛋白單體結(jié)合,促進(jìn)微絲的成核反應(yīng),最終參與細(xì)胞的多種生物學(xué)功能[7,15]。WASP家族成員包括神經(jīng)元型WASP(neuronal-WASP,N-WASP)、WASP家族富含脯氨酸同源蛋白1(WASP family verprolin-homologous protein 1,WAVE1)、WAVE2、WAVE3以及WHAMM等[10]。研究發(fā)現(xiàn), N-WASP可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的遷移和侵襲[11],WAVE1可增加卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力等[16]。

本研究結(jié)果顯示ESCC組織中WHAMM mRNA表達(dá)高于癌旁正常食管黏膜組織,WHAMM高表達(dá)患者的生存時(shí)間較短,提示W(wǎng)HAMM可能促進(jìn)了ESCC的發(fā)生發(fā)展。本研究結(jié)果亦顯示W(wǎng)HAMM促進(jìn)了ESCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。這一作用同WAVE1在卵巢癌的作用類似[16]。WHAMM可促進(jìn)視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞內(nèi)自噬體的形成[17],而自噬可以影響細(xì)胞的增殖[18]。作者推測(cè)WHAMM可能通過(guò)促進(jìn)自噬來(lái)增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的增殖能力。微絲是組成細(xì)胞骨架的重要成分,其動(dòng)態(tài)變化不僅是細(xì)胞遷移運(yùn)動(dòng)的基礎(chǔ),也具有調(diào)節(jié)細(xì)胞侵襲功能的作用[19-20]。作者推測(cè)WHAMM可能通過(guò)促進(jìn)微絲的聚合來(lái)促進(jìn)ESCC細(xì)胞的遷移和侵襲,但是這些推測(cè)均需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述,WHAMM促進(jìn)了ESCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,與患者的預(yù)后相關(guān)。