張家豪,劉怡文,何珂瑤,張哲源,李若楠,龍情柔,孫 蔚,孔金玉,楊海軍,周福有

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院胸外科 河南新鄉(xiāng) 453003 2)河南科技大學臨床醫(yī)學院;河南科技大學第一附屬醫(yī)院;河南省腫瘤表觀遺傳重點實驗室;河南省微生態(tài)與食管癌防治重點實驗室 河南洛陽 471003 3)安陽市腫瘤醫(yī)院病理科 河南安陽 455000 4)安陽市腫瘤醫(yī)院胸外科;河南省食管癌精準防治醫(yī)學重點實驗室 河南安陽 455000

食管癌發(fā)病率和死亡率極高,我國以食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)為主,ESCC病因至今尚未完全明確[1]。作者所在團隊[2-3]已證實,ESCC組織中具核梭桿菌(Fusobacteriumnucleatum,Fn)定植率約為40%,且Fn感染陽性的ESCC患者生存期顯著縮短;Fn長期定植不僅可激活癌細胞中炎癥相關(guān)信號通路,還可重塑免疫微環(huán)境,誘導(dǎo)癌細胞免疫逃逸。

吲哚胺2,3-雙加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)為色氨酸分解代謝的關(guān)鍵限速酶,其過表達可導(dǎo)致色氨酸耗竭,使免疫微環(huán)境中正向調(diào)節(jié)的T細胞增殖及活化受阻,導(dǎo)致機體抗腫瘤免疫失能[4-5]。幽門螺桿菌、乙肝病毒及人乳頭瘤病毒均可通過激活I(lǐng)DO,抑制具有殺傷功能的CD8+T細胞的增殖及活化,協(xié)助癌細胞逃避免疫監(jiān)視,促進胃癌、肝癌及宮頸癌的惡性增殖及遠處轉(zhuǎn)移[6-8]。

本研究初步分析了Fn感染對ESCC細胞中IDO蛋白表達及CD8+T細胞浸潤的影響,并分析Fn感染與ESCC預(yù)后的關(guān)系,為ESCC病因?qū)W研究及臨床防治策略的制定提供新思路。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器ESCC細胞系KYSE140、KYSE150及Fn菌株ATCC 25586為作者所在實驗室凍存,健康人外周血來自本實驗室志愿者;Ficoll-paque分離液(美國GE公司),磁珠分選試劑盒、hIL-2、hIL-7-Fc、TexMACS培養(yǎng)基(美國Miltenyi公司),細胞內(nèi)固定與透化緩沖液套件、熒光標記抗體IDO-PE及羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯(carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester,CFSE)細胞增殖檢測試劑盒(美國eBioscienceTM公司),IDO抑制劑(美國Selleckchem公司),RNAscope試劑盒及Fn特異性探針(美國ACD公司),IDO及CD8兔抗人單克隆抗體(英國Abcam公司),免疫組化試劑盒(中國ZSGB-BIO公司),檸檬酸鈉抗原修復(fù)液、DAB顯色液(中國Solarbio公司);厭氧工作站(美國COY公司),流式細胞儀(美國貝克曼公司)。

1.2 Fn感染后ESCC細胞中IDO表達的檢測厭氧工作站中常規(guī)培養(yǎng)Fn;培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)KYSE140、KYSE150細胞[2-3]。待ESCC細胞生長達70%融合度時,收集細胞,調(diào)整細胞密度至1×106個/mL。將對數(shù)生長期的Fn加入細胞培養(yǎng)基(感染復(fù)數(shù)MOI=10),分別感染24、48、72 h。設(shè)未感染Fn的細胞為對照。采用細胞內(nèi)固定與透化緩沖液套件對細胞進行固定及破膜后,加IDO-PE孵育30 min,采用流式細胞儀檢測細胞中IDO表達量,以相對熒光強度表示。采用Summit 5.3軟件分析數(shù)據(jù),具體步驟參考說明書。實驗重復(fù)3次。

1.3 與ESCC細胞共培養(yǎng)后CD8+T細胞增殖率的檢測取健康人外周血于抗凝管,用生理鹽水按體積比1∶1稀釋后,緩慢鋪于適量Ficoll-paque分離液表面。800×g離心20 min,分層后吸取白膜層,800×g離心5 min,沉淀為人外周血單個核細胞。采用磁珠分選試劑盒從中分選出CD8+T細胞,于含hIL-2(50 U/mL)、hIL-7-Fc(70 μg/L)的TexMACS培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)。

常規(guī)培養(yǎng)KYSE140及KYSE150細胞,待細胞生長達70%融合度時,用CFSE(濃度為1 μmol/L)標記CD8+T細胞,并按細胞數(shù)之比10∶1的比例將標記后的CD8+T細胞加入KYSE140或KYSE150細胞培養(yǎng)基進行共培養(yǎng)。具體步驟參考說明書及本課題組前期研究[3]。KYSE140及KYSE150共培養(yǎng)體系均分為4組:對照組、Fn組、IDO抑制劑組及Fn+IDO抑制劑組。按分組感染Fn(感染復(fù)數(shù)MOI=10)、加入IDO抑制劑(濃度為1 μmol/L)[9]分別培養(yǎng)24、48及72 h,用流式細胞儀檢測共培養(yǎng)體系中CD8+T細胞的增殖情況。采用Summit 5.3軟件分析數(shù)據(jù),CD8+T細胞增殖率以熒光強度減弱細胞百分比表示,具體步驟參考說明書及本課題組前期研究[3]。實驗重復(fù)3次。

1.4 ESCC組織Fn感染、IDO表達及CD8+T細胞浸潤情況的檢測

1.4.1標本來源 選取2015年1月至2017年1月安陽市腫瘤醫(yī)院手術(shù)切除的ESCC患者癌組織石蠟包埋標本為研究對象。納入標準:術(shù)后病理診斷明確為ESCC,未合并其他腫瘤;術(shù)前未接受放、化療和免疫治療;臨床資料齊全。最終納入243例ESCC患者。243例中男166例,女77例;<60歲78例;146例有吸煙史;142例有飲酒史;低分化61例,中高分化182例;侵及外膜187例,未侵及外膜56例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移163例;TNM分期Ⅰ/Ⅱ期92例,Ⅲ/Ⅳ期151例。本研究獲安陽市腫瘤醫(yī)院倫理委員會審核批準(2022WZ16K01)。

1.4.2Fn感染的檢測 取石蠟包埋的ESCC組織病理切片(片厚2 μm),經(jīng)脫蠟及水化后,采用RNAscope試劑盒中的靶標修復(fù)液修復(fù)、雙氧水處理及蛋白酶孵育,加Fn特異性探針4 ℃孵育過夜,用RNAscope顯色劑顯色[3]。結(jié)果判定:細胞胞質(zhì)出現(xiàn)紅色顆粒為Fn rRNA陽性;單個細胞中單獨的紅色顆?！?個為Fn陽性細胞;陽性細胞占比≥30%為Fn感染陽性樣本。陽性對照、陰性對照及評分細則見本課題組前期研究[2-3]。

1.4.3IDO表達及CD8+T細胞浸潤情況的檢測 取2張同批常規(guī)石蠟包埋的ESCC組織連續(xù)切片(片厚2.5 μm),經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)后,采用免疫組化試劑盒中的過氧化物酶阻斷劑及山羊血清封閉。分別加入IDO及CD8抗體(按1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜,經(jīng)山羊抗兔聚合物及SP孵育后,DAB顯色、蘇木精復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。結(jié)果判讀:IDO陽性細胞及CD8+T細胞為胞質(zhì)及胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒。陽性對照、陰性對照及免疫組化評分標準參照本課題組前期研究[3]及參考文獻[10]。

1.5 隨訪從患者確診開始隨訪,截至2022年1月?；颊叱鲈汉?安陽市腫瘤醫(yī)院隨訪中心每1個月電話聯(lián)系一次患者或家屬直至隨訪結(jié)束。以死亡為終點事件。

1.6 統(tǒng)計學處理采用GraphPad 5.0及SPSS 26.0處理數(shù)據(jù)。采用析因設(shè)計的方差分析比較Fn感染與未感染ESCC細胞中IDO表達的差異及各共培養(yǎng)體系中CD8+T細胞增殖率的差異。采用Kappa系數(shù)分析ESCC組織中Fn感染與IDO表達的一致性,采用χ2檢驗分析Fn感染及IDO表達與CD8+T細胞浸潤的關(guān)聯(lián)。采用Kaplan-Meier法繪制Fn感染與未感染者的生存曲線并進行Log-rank檢驗。采用Cox回歸分析Fn感染對ESCC患者預(yù)后的影響。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Fn感染對ESCC細胞中IDO表達的影響結(jié)果見表1。由表1可知,Fn感染可誘導(dǎo)ESCC細胞中IDO高表達,且具有時間依賴性。

表1 各組ESCC細胞中IDO表達的比較(n=3)

2.2 Fn感染及IDO抑制劑對共培養(yǎng)體系中CD8+T細胞增殖的影響結(jié)果見表2。由表2可知,Fn感染可抑制共培養(yǎng)體系中CD8+T細胞增殖,IDO抑制劑則促進增殖,二者聯(lián)用有拮抗作用,且作用具有時間依賴性。

2.3 ESCC組織中Fn感染、IDO表達及CD8+T細胞浸潤的關(guān)聯(lián)性結(jié)果見圖1,表3、4。ESCC組織中Fn感染及IDO表達具有一致性,而二者均與CD8+T細胞浸潤呈負關(guān)聯(lián)。

上排:陽性樣本;下排:陰性樣本;A、D:RNAscope法;B、C、E、F:SP法

表3 ESCC組織中Fn感染與IDO表達的一致性分析 例

表4 ESCC組織中Fn感染及IDO表達與CD8+T細胞浸潤的關(guān)聯(lián)性分析 例

2.4 Fn感染對ESCC患者預(yù)后的影響243例隨訪3～60個月,中位隨訪時間32個月;截至2022年1月,仍存活59例。

Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示Fn感染患者預(yù)后較差(χ2=27.500,P<0.001)(圖2)。

圖2 Fn陽性組與陰性組ESCC患者的Kaplan-Meier生存曲線

以性別(女為對照)、年齡(<60歲為對照)、吸煙、飲酒為調(diào)整因素,采用Cox回歸分析Fn感染對ESCC患者生存的影響,結(jié)果(表5)顯示,Fn感染影響ESCC患者的預(yù)后。

表5 Fn感染對ESCC患者生存影響的Cox回歸分析

3 討論

資料[11]顯示,病原微生物可通過重塑腫瘤免疫微環(huán)境,削弱機體抗腫瘤免疫反應(yīng)。作者所在團隊前期研究[2-3]發(fā)現(xiàn),Fn感染與ESCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。IDO是介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的關(guān)鍵檢查點分子,為色氨酸代謝過程中的限速酶,其異常激活可引起T細胞活化增殖所必需的色氨酸分解耗竭,抑制T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng),且色氨酸代謝物也可抑制T細胞及NK細胞增殖,進一步加重機體的免疫抑制[12]。人乳頭瘤病毒、乙肝病毒及人類皰疹病毒均可誘導(dǎo)癌細胞高表達IDO,招募調(diào)節(jié)性T細胞并阻礙CD8+T細胞增殖及活化,抑制免疫反應(yīng),促進宮頸癌、肝癌及口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展[13-15]。本研究發(fā)現(xiàn),隨Fn感染時間的延長,ESCC細胞中IDO表達逐漸增強,表明Fn感染可誘導(dǎo)ESCC細胞中IDO高表達,且具有時間依賴性。我們建立了人CD8+T細胞與ESCC細胞共培養(yǎng)體系模擬腫瘤微環(huán)境,結(jié)果表明Fn感染可抑制共培養(yǎng)體系中CD8+T細胞增殖,IDO抑制劑則可促進增殖,而Fn+IDO抑制劑組細胞增殖率升高,表明抑制IDO的活性可阻斷Fn對CD8+T細胞的負性調(diào)控作用,也提示IDO抑制劑使用的情況下,Fn對共培養(yǎng)體系中CD8+T細胞增殖仍有一定抑制作用。

此外,本研究還發(fā)現(xiàn),243例ESCC組織中Fn感染及IDO表達具有一致性,而二者均與CD8+T細胞浸潤呈負關(guān)聯(lián)。Fn感染的患者中位生存時間更短,Fn感染增加了ESCC患者死亡的風險,提示有效清除Fn對延長ESCC患者生存期具有重要意義。

綜上所述,Fn可能通過誘導(dǎo)IDO表達,抑制CD8+T細胞增殖,削弱機體抗腫瘤免疫反應(yīng),促進ESCC惡性演變。由于病原微生物感染與腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個多因素、多步驟的復(fù)雜過程,Fn對ESCC免疫微環(huán)境的重塑機制仍有待進一步實驗驗證。