王宇琦,達(dá)哇卓瑪,張雨薇,劉川川,樊海寧

泡型包蟲病(alveolar echinococcosis, AE)是由多房棘球絳蟲幼蟲感染引起的致死性人獸共患寄生蟲病,主要流行于北半球區(qū)域[1]。嚙齒類動物和人等中間宿主通過食入含有寄生蟲蟲卵而感染[2-3]。蟲卵在寄生宿主腸道內(nèi)孵化后可穿透腸壁,通過門靜脈進(jìn)入肝臟,在肝臟中向后絳幼蟲階段轉(zhuǎn)變[4]。多房棘球絳蟲囊腫由許多小泡組成,這些小泡呈浸潤性生長,像惡性腫瘤一樣,與正常肝組織分界不清[2-4]。由于AE病灶不受限制的生長,導(dǎo)致中間宿主肝組織內(nèi)血管和膽管阻塞,最終導(dǎo)致器官衰竭發(fā)生[2]。AE的另一個特征是廣泛的肝纖維化發(fā)生,可導(dǎo)致肝實質(zhì)完全消失,這很可能與慢性感染時肝星狀細(xì)胞的激活有關(guān)[5-6]。手術(shù)切除AE病灶組織是唯一可靠、有效的治療方法,但對大多數(shù)患者來說并不可行,多數(shù)患者基于苯并咪唑的化學(xué)藥物治療是唯一的治療選擇。然而,苯并咪唑只能起到寄生蟲抑制作用,而且必須長期服用(通常是終身服用),這就強(qiáng)調(diào)了針對AE新治療方案的必要性[2]。

噻蟲啉(thiacloprid, Thia)是一種新型氯代煙堿類殺蟲劑。我們先前研究已經(jīng)確定,噻蟲啉在體內(nèi)和體外均能發(fā)揮抗AE作用[7-8]。噻蟲啉已知作用于昆蟲神經(jīng)接合后膜,通過與煙堿乙酰膽堿受體(nicotinic acetylcholine receptor, nAChR)結(jié)合,干擾昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)正常傳導(dǎo),引起神經(jīng)通道阻塞,造成乙酰膽堿的大量積累,從而使昆蟲異常興奮,全身痙攣、麻痹而死。隨著多房棘球絳蟲基因組測序的完成,多種乙酰膽堿受體被鑒定出來[9]。而多房棘球絳蟲的發(fā)育和幼蟲的生長完全是由一群體壁干細(xì)胞驅(qū)動的,這些干細(xì)胞是多房棘球絳蟲中唯一存在有絲分裂活性的細(xì)胞,并產(chǎn)生所有分化的細(xì)胞類型[10]。利用體外培養(yǎng)系統(tǒng)也證實可以培養(yǎng)后絳幼蟲囊泡和生發(fā)層細(xì)胞[11-14]。但迄今為止,還沒有關(guān)于多房棘球絳蟲乙酰膽堿受體以及受體與小分子藥物相互作用的研究。

本文通過對多房棘球絳蟲已鑒定出的乙酰膽堿受體結(jié)構(gòu)分析,對其中的一種乙酰膽堿受體進(jìn)行生物信息學(xué)分析和異源表達(dá),結(jié)果表明該受體存在與噻蟲啉結(jié)合的空間構(gòu)象。進(jìn)一步的實驗也初步證明噻蟲啉能引發(fā)乙酰膽堿受體離子通道的開放。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和試劑 HEK293細(xì)胞由武漢普諾賽公司提供,經(jīng)STR鑒定正確。RNA提取試劑盒購自北京天根公司;噻蟲啉、人乙酰膽堿(acetychiline,ACh)購自美國Sigma公司;0.2 μm聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)購自美國Millipore公司;GFP抗體、Cy3標(biāo)記羊抗小鼠二抗、HRP標(biāo)記羊抗小鼠二抗購至Abclonal公司;超敏化學(xué)發(fā)光試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo Scientific公司;青鏈霉素混合液(PS, 100×)、0.25%胰蛋白酶、MEM培養(yǎng)基購自武漢普諾賽公司;胎牛血清(FBS)購至美國Gibco公司;Rhod-2 AM鈣離子熒光探針購至上海懋康生物。pCMV-N-EGFP質(zhì)粒、EcoR I內(nèi)切酶、SpeI內(nèi)切酶、PstI內(nèi)切酶、卡那霉素購于上海碧云天公司。cDNA第一鏈合成試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、T4 DNA連接酶、FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix試劑盒、qPCR試劑盒購于北京天根公司。

1.2 實驗材料來源

1.2.1 多房棘球絳蟲原頭節(jié)分離 多房棘球絳蟲原頭節(jié)最初是從中國青海玉樹自然感染的高原鼠兔中分離出來,經(jīng)擴(kuò)增nad1、nad5、Cox1基因鑒定為多房棘球絳蟲來源[7]。通過腹膜內(nèi)注射在蒙古長爪沙鼠體內(nèi)長期保種。蒙古長爪沙鼠經(jīng)異氟烷吸入麻醉后頸椎脫臼安樂死,經(jīng)75%乙醇浸泡消毒 5 min,后置于生物安全柜內(nèi)分離腹腔內(nèi)病灶。將病灶置于磷酸鹽緩沖液(PBS)中并剪碎,并將剪碎后病灶通過四層無菌紗布過濾至無菌50 mL離心管中。通過100 μm細(xì)胞篩過濾去除鈣質(zhì)顆粒后,吸取部分原頭節(jié)于EP管中,經(jīng)12 000 r/min離心2 min收集沉淀用于后續(xù)RNA提取實驗。部分原頭節(jié)用PBS調(diào)整濃度約為6 000個/mL,用于后續(xù)構(gòu)建繼發(fā)性小鼠AE感染模型。

1.2.2 繼發(fā)性小鼠感染模型構(gòu)建 6只SPF級雌性C57BL/c小鼠購于北京華阜康生物科技有限公司(合格證號:110322210101187827),動物飼養(yǎng)于本實驗室IVC籠具中(3只/籠)。取上述分離原頭節(jié)0.3 mL(濃度約為6 000個/mL)通過腹腔注射感染C57BL/c小鼠3只,另取3只小鼠注射等量PBS。小鼠飼養(yǎng)6周后,經(jīng)2%戊巴比妥鈉麻醉后經(jīng)眼球取血分離包蟲病小鼠血清和正常小鼠血清,用于后續(xù)實驗研究。

1.3 生物信息學(xué)分析 從Uniprot數(shù)據(jù)庫獲取nAchR蛋白序列(蛋白ID:A0A068YBH0),利用ExPASy系統(tǒng)中的ProtParam tool在線分析軟件分析nAchR蛋白的相對分子質(zhì)量、等電點、穩(wěn)定性及平均親水系數(shù),并使用ProtScale在線工具分析親/疏水性氨基酸比重;SignalP 5.0分析信號肽序列和剪切位置;TMHMM Server v. 2.0分析蛋白跨膜區(qū)域位置;SOPMA預(yù)測蛋白二級結(jié)構(gòu);Swiss-Model預(yù)測蛋白三級結(jié)構(gòu)。

1.4 分子對接 以nAChR氨基酸序列(蛋白ID:A0A068YBH0)為模板,使用Swiss-Model同源建模軟件進(jìn)行同源性建模[15],獲得蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。使用Ramachandran圖建模結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評估[16]。當(dāng)模型的相似度大于30%時,可以得到合理的構(gòu)象[17]。進(jìn)一步的分析是基于Swiss-Model同源建模軟件構(gòu)建的可比蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息。將nAChR建模結(jié)構(gòu)上傳到POCASA以預(yù)測其潛在的結(jié)合位點[18]。根據(jù)其可能的結(jié)合位點設(shè)置Grid box坐標(biāo)和box size,使用Autodock Vina. 1.1.2進(jìn)行分子對接[19]。從PubChem獲取噻蟲啉的三維結(jié)構(gòu)。

1.5 目的基因引物設(shè)計 通過GeneDB數(shù)據(jù)庫獲取nAchR基因(EmuJ_000984000)CDS序列,使用金斯瑞在線引物設(shè)計軟件設(shè)計引物為:F: 5′-cgGAATTCATGCTCTCACCTGCCGTGGA-3′(下劃線部分為EcoR I酶切位點),R:5′-ggACTAGTTCAGTGTCTGGGGAGAATAATA-TG-3′(下劃線部分為SpeI酶切位點),理論產(chǎn)物長度為1 633 bp。引物由上海生工生物公司合成。

1.6 nAChR重組質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)天根RNA提取試劑盒說明書提取多房棘球蚴原頭節(jié)總RNA。取2 μg總RNA按cDNA第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA,置于-80 ℃保存。以合成的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為:2×Taq PCR MasterMix Ⅱ 10 μL,Primer F(10 μmol/L) 0.5 μL,Primer R(10 μmol/L) 0.5 μL,cDNA模板 1 μL,雙蒸水 8 μL。反應(yīng)條件為:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s, 72 ℃ 2 min, 30個循環(huán);72 ℃ 5min。PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。PCR產(chǎn)物經(jīng)回收純化后,使用限制性內(nèi)切酶EcoR I和SpeI進(jìn)行雙酶切。將雙酶切后的基因片段和雙酶切后的pCMV-N-EGFP質(zhì)粒(pCMV-EGFP)用T4 DNA連接酶16 ℃連接過夜,重組后質(zhì)粒命名為pCMV-EGFP-nAChR。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α后涂布于含有卡那霉素(50 μg/mL)LB固體平板,37 ℃倒置培養(yǎng)48 h。挑取單克隆使用LB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增,用特異性引物進(jìn)行PCR鑒定及單酶切鑒定。陽性克隆送上海生工測序鑒定,使用在線Multiple Sequence Alignment比對軟件對所得序列與Wormbase Parasite數(shù)據(jù)庫nAChR序列比對。

1.7 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞 HEK293細(xì)胞在含10%滅活胎牛血清和1% PS的MEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),將HEK293細(xì)胞以6×105/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞密度達(dá)到60%～70%后,用PBS洗滌細(xì)胞后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按照Lipofectamine 3000試劑盒說明書分別將pCMV-EGFP質(zhì)粒和pCMV-EGFP-nAChR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照組(Control)。轉(zhuǎn)染48 h后,在Zeiss倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光表達(dá)情況,并用ACEA NovoCyte流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.8 Real-time PCR檢測nAChRmRNA的表達(dá) 使用Trizol試劑提取轉(zhuǎn)染pCMV-EGFP質(zhì)粒和pCMV-EGFP-nAChR質(zhì)粒后細(xì)胞總RNA。瓊脂糖凝膠電泳觀察28S和18S核糖體RNA條帶用于評估RNA完整性。用NanoDrop 2000分光光度計測定總RNA純度和濃度。使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix根據(jù)說明將2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA產(chǎn)物分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆谩Ｌ禺愋砸镉缮虾Ｉど锕竞铣?引物序列為:nAchR-F:5′-TGTACAACAACGTGGACGGCAA-3′;nAchR-R:5′-AAGTACTCCATGTCGATTCTGCAGGC-3′;β-actin-F:5′-CCACGGCTGCTTCCAGCTCC-3′,β-actin-R:5′-GGG-CAGCGGAACCGCTCATT-3′。使用天根qPCR試劑盒根據(jù)說明配制反應(yīng)液。qPCR反應(yīng)使用ABI Q5檢測系統(tǒng),反應(yīng)程序設(shè)置為:95 ℃預(yù)變性15 min,然后進(jìn)行40個循環(huán)(95 ℃ 10 s,60 ℃ 34 s)。

1.9 Western blot檢測nAChR蛋白的表達(dá) HEK293細(xì)胞于轉(zhuǎn)染48 h后,收集細(xì)胞沉淀,以RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白。經(jīng)BCA法定量后,以30 μg蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入GFP抗體(1∶1 000)、泡型包蟲病小鼠血清(1∶300)和正常小鼠血清(1∶300)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜后,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶5 000)或辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(1∶5 000)室溫孵育1 h。TBST洗膜后,使用ECL超敏化學(xué)發(fā)光液于GE Amersham Imager 600化學(xué)發(fā)光儀中顯像蛋白條帶。以β-actin為內(nèi)參對照。

1.10 免疫熒光染色 HEK293細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,24 h后轉(zhuǎn)染pCMV-EGFP質(zhì)粒和pCMV-EGFP-nAChR質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h。HEK293細(xì)胞經(jīng)PBS輕柔洗滌后,加入4%多聚甲醛室溫固定20 min。經(jīng)含有1%BSA-PBS洗滌后加入正常小鼠血清(1∶50)和泡型包蟲病小鼠血清(1∶50)于4 ℃孵育過夜。第2 d,細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌后,加入Cy3標(biāo)記羊抗小鼠二抗室溫避光孵育1 h。隨后,經(jīng)PBS洗滌后,于Zeiss LSM 880激光共聚焦顯微鏡下觀察并采集圖像。

1.11 全細(xì)胞膜電流分析 轉(zhuǎn)染pCMV-EGFP質(zhì)粒和pCMV-EGFP-nAChR細(xì)胞接種于含有蓋玻片的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)24 h后進(jìn)行全細(xì)胞膜電流檢測。將鋪有細(xì)胞的蓋玻片置于倒置顯微鏡中的記錄浴槽中,工作液以及不含化合物的外液利用重力灌流的方法流經(jīng)記錄浴槽從而作用于細(xì)胞,在記錄中利用真空泵進(jìn)行液體交換。細(xì)胞外液:140 mmol/L NaCl,3.5 mmol/L KCl,2 mmol/L CaCl2·2H2O,1 mmol/L MgCl2·6H2O,10 mmol/L HEPES,10 mmol/L D-Glucose,1.25 mmol/L NaH2PO4,NaOH調(diào)節(jié)pH=7.4;細(xì)胞內(nèi)液:50 mmol/L CsCl,10 mmol/L NaCl,20 mmol/L EGTA,60 mmol/L CsF,10 mmol/L HEPES,CsOH調(diào)節(jié)pH=7.2。所有電生理試驗在室溫下進(jìn)行。

用微電極拉制儀將毛細(xì)玻璃管拉制成記錄電極。在倒置顯微鏡下操縱微電極操縱儀將記錄電極接觸到細(xì)胞上,給予負(fù)壓抽吸,形成GΩ封接。形成GΩ封接后進(jìn)行快速電容補(bǔ)償(pF),然后繼續(xù)給予負(fù)壓,吸破細(xì)胞膜,形成全細(xì)胞記錄模式。然后進(jìn)行慢速電容的補(bǔ)償并記錄膜電容(pF)及串聯(lián)電阻。全細(xì)胞膜片鉗記錄刺激方案如下:當(dāng)形成全細(xì)胞封接后細(xì)胞膜電壓鉗制于-70 mV。在Gap-free模式下進(jìn)行記錄,先給予細(xì)胞外液,后細(xì)胞外液+15 μmol/L Thia或細(xì)胞外液+100 μmol/L人乙酰膽堿灌流給藥10 min后,觀察并記錄電流,以細(xì)胞外液下記錄的電流值作為對照。試驗數(shù)據(jù)由EPC-10放大器(HEKA)進(jìn)行采集并儲存于PatchMaster(HEKA)軟件中。

1.12 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度分析 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染nAChR-HEK293細(xì)胞接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板24 h后,細(xì)胞分別與5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL噻蟲啉共同作用6 h、12 h和24 h。干預(yù)后細(xì)胞與2 μmol/L Rhod-2 AM在37 ℃避光孵育25 min進(jìn)行鈣離子熒光探針加載。細(xì)胞經(jīng)PBS緩沖液洗滌兩次后,在37 ℃再次避光孵育30 min。使用蔡司Vert.A1熒光顯微鏡拍攝圖像,用image J軟件分析圖像熒光強(qiáng)度。

1.13 鈣流分析 將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的nAChR-HEK293細(xì)胞消化,將細(xì)胞密度調(diào)整為1×106/mL,然后用PBS洗滌細(xì)胞,用4 μm Rhod-2AM在37 ℃避光孵育20 min進(jìn)行鈣離子熒光探針加載,細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌2次后在37 ℃條件下避光孵育30 min。將細(xì)胞重懸浮于HEPES緩沖溶液中(含1 mmol/L CaCl2、0.5 mmol/L MgCl2、0.1% BSA、10 mmol/L HEPES、pH 7.2)中,加入終濃度為15 μg/mL噻蟲啉在37 ℃孵育15 min后,在靜息狀態(tài)下測量2 min的基線鈣水平(樣品體積25 μL,樣品速度14 μL/min),然后立即用流式細(xì)胞儀繼續(xù)監(jiān)測5 min(樣品體積75 μL,樣品速度14 μL/min)。使用FlowJo 10軟件計算曲線下區(qū)域相對面積。

2 結(jié) 果

2.1 nAChR蛋白理化性質(zhì)分析 Protparam tool工具分析顯示,nAChR蛋白含有538個氨基酸,相對分子質(zhì)量約為62.08 kD;理論等電點為8.46;不穩(wěn)定系數(shù)為54.27,為不穩(wěn)定蛋白;平均親水性系數(shù)為-0.029,為親水性蛋白。ProtScale工具分析顯示,nAChR蛋白親水性氨基酸占53.96%,疏水性氨基酸占46.04%(圖1)。

注:正值代表疏水區(qū);負(fù)值代表親水區(qū)圖1 多房棘球絳蟲nAChR蛋白親/疏水性分析Fig.1 Hydrophilic/hydrophobic analysis of the Echinococcus multilocularis nAChR protein

2.2 nAChR信號肽及跨膜區(qū)分析 信號肽為新合成多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)移的N-末端的氨基酸序列。SignalP工具分析顯示,依據(jù)平均SP值大于0.5為信號肽的判斷標(biāo)準(zhǔn),nAChR蛋白N-端1～20個氨基酸序列的平均SP值為0.567,為信號肽序列,信號肽剪切位點在甘氨酸(G20)和甘氨酸(G21)之間(圖2)。TMHMM工具分析顯示,nAChR蛋白的跨膜區(qū)域位于250～497氨基酸之間,其中,250～272、279～301、314～336和475～497為與膜脂結(jié)合的多肽序列(圖3),表明nAChR蛋白為信號肽介導(dǎo)的細(xì)胞質(zhì)膜定位的4次跨膜蛋白。

圖3 nAChR跨膜區(qū)分析Fig.3 nAChR transmembrane region analysis

2.3 nAChR蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 SOPMA軟件分析顯示,nAChR蛋白可能含有4種二級結(jié)構(gòu):α螺旋占27.14%,β轉(zhuǎn)角占4.83%,無規(guī)則卷曲占44.42%,延伸鏈組成占23.61%,可見α螺旋和無規(guī)則卷曲是該蛋白的主要組成部分(圖4)。

圖4 nAChR蛋白二級結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Secondary structure analysis of nAChR protein

2.4 nAChR蛋白三級結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域預(yù)測 Swiss-Model分析顯示,該蛋白胞外結(jié)構(gòu)域主要由無規(guī)則卷曲組成,胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域主要由α螺旋和無規(guī)則卷曲組成,與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致,見圖5A。SMART分析表明,nAChR蛋白存在兩個受體結(jié)構(gòu)域,其中一個為細(xì)胞外配體門控離子通道活性部位,表明nAChR蛋白存在與配體結(jié)合的能力,從而激活下游信號功能。應(yīng)用Swiss-Model數(shù)據(jù)庫對nAChR蛋白進(jìn)行同源建模,參考模板為neuronal acetylcholine receptor subunit alpha-4(PDB ID: 6usf.1.D),兩者相似度為40.40%,得到nAChR蛋白的3D結(jié)構(gòu)(圖5B)。利用拉氏圖(Ramachandran Plot)檢測nAChR蛋白的立體化學(xué)構(gòu)象是否合理。由預(yù)測結(jié)果可知,nAChR蛋白結(jié)構(gòu)的G-factor計分總平均值為0.62。所有的氨基酸殘基的二面角都落在了最適宜區(qū)域(圖5C)。由此可見nAChR蛋白3D模型的立體構(gòu)象和二面角分布較為合理,符合立體化學(xué)ψ、φ二面角分布的要求。

注:A:nAChR同源建模結(jié)果;B:nAChR同源五聚體結(jié)構(gòu)預(yù)測,ECD:細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域;TMD:跨膜結(jié)構(gòu)域;ICD:細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域;C:拉氏圖。圖5 nAChR三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Tertiary structure prediction of nAChR protein

注:A:噻蟲啉與nAChR分子對接表面圖;B:噻蟲啉與nAChR分子對接二維結(jié)構(gòu);C:噻蟲啉與nAChR分子對接三維結(jié)構(gòu)。圖6 噻蟲啉與nAChR分子對接Fig.6 Molecular docking of thiacloprid and nAChR

2.5 噻蟲啉與nAChR分子對接 用Autodock vina 1.1.2軟件計算nAChR蛋白與噻蟲啉的結(jié)合能量為-6.4 kcal/mol。對接完成后,由表面圖可以看出,噻蟲啉和nAChR蛋白表面結(jié)合較為緊密,兩者之間具有較好的匹配性,為噻蟲啉結(jié)合到此處提供了可能。由噻蟲啉和nAChR蛋白的相互作用圖可以看出,噻蟲啉與活性位點附近的PHE 207、PHE 241兩個氨基酸形成Pi-Pi相互作用,與LEU 60之間形成一個鹽橋,此外與ARG 244之間形成一個Pi-Pi相互作用。這些氫鍵相互作用促使噻蟲啉穩(wěn)定結(jié)合到nAChR蛋白活性位點,進(jìn)而發(fā)揮殺蟲活性。

2.6nAChR基因擴(kuò)增及重組質(zhì)粒構(gòu)建 經(jīng)PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示單一的擴(kuò)增條帶(圖7A),與研究的nAChR基因預(yù)期大小符合。將nAChR基因連接到pCMV-N-EGFP質(zhì)粒,pCMV-EGFP-nAChR重組質(zhì)粒經(jīng)PstI酶切后得到2個條帶,大小分別在1 500 bp和5 000 bp附近,與理論大小相符合(圖7B)。pCMV-EGFP-nAChR重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定證實序列與Wormbase Parasite數(shù)據(jù)庫nAChR序列一致(圖7C)。這些結(jié)果表明pCMV-EGFP-nAChR重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

注:A為nAChR基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果;B為pCMV-EGFP-nAChR重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖;C為重組質(zhì)粒測序結(jié)果與Wormbase Parasite數(shù)據(jù)庫nAChR序列比對。圖7 nAChR基因PCR產(chǎn)物和重組質(zhì)粒鑒定Fig.7 Identification of nAChR gene PCR products and recombinant plasmids

2.7 nAChR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞檢測 pCMV-EGFP-nAChR重組質(zhì)?；騪CMV-EGFP質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,經(jīng)過嘌呤霉素篩選后,熒光顯微鏡下觀察到分別轉(zhuǎn)染兩種質(zhì)粒組細(xì)胞中明顯表達(dá)綠色熒光蛋白(圖8A)。流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染后表達(dá)EGFP熒光細(xì)胞比例,pCMV-EGFP組和pCMV-EGFP-nAChR組轉(zhuǎn)染成功比例均達(dá)到95%以上(圖8B)。

A:EGFP熒光觀察(100×);B:流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率。圖8 重組nAChR質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞Fig.8 Recombinant nAChR plasmid transfected into HEK293 cells

2.8 nAChR在HEK293細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá) 在之前研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步明確多房棘球絳蟲nAChR基因在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)。qPCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pCMV-EGFP-nAChR質(zhì)粒后能檢測到明顯的nAChR基因表達(dá)(圖9A)Western blot結(jié)果顯示,在27 kDa和70～100 kDa之間可見GFP陽性反應(yīng);在70～100 kDa之間的蛋白條帶能與泡型包蟲病小鼠血清發(fā)生免疫反應(yīng),而正常小鼠血清孵育后在70～100 kDa之間未見陽性反應(yīng)條帶(圖9B)。使用泡型包蟲病小鼠血清對轉(zhuǎn)染后HEK293中nAChR進(jìn)行免疫熒光鑒定。免疫熒光結(jié)果顯示,經(jīng)泡型包蟲病小鼠血清孵育后,在HEK293細(xì)胞膜上觀察到陽性表達(dá),而正常小鼠血清未見陽性反應(yīng)(圖9C)。這些結(jié)果表明,nAChR在HEK293細(xì)胞膜上穩(wěn)定表達(dá)。

A:qPCR檢測nAChR基因表達(dá);B:Western blot檢測nAChR蛋白表達(dá);C:免疫熒光檢測nAChR蛋白表達(dá)。圖9 nAChR在HEK293細(xì)胞中表達(dá)鑒定Fig.9 Identification of nAChR expression in HEK293 cells

2.9 噻蟲啉對nAChR-HEK293細(xì)胞全細(xì)胞膜電流的影響 為了檢測噻蟲啉對nAChR-HEK293細(xì)胞全細(xì)胞膜電流的影響,通過細(xì)胞旁灌流給藥檢測10 μg/mL噻蟲啉作用后全細(xì)胞膜電流的改變。通過在熒光顯微鏡下觀察pEGFP-N-nAChR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后呈現(xiàn)明顯的綠色熒光,并能清楚的觀察到微電極鉗制nAChR-HEK293細(xì)胞(圖10A)。給予細(xì)胞外液終濃度為10 μg/mL噻蟲啉細(xì)胞旁灌流給藥,灌流速度為0.3 mL/min。10 μg/mL噻蟲啉干預(yù)pEGFP-N-nAChR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞誘發(fā)出內(nèi)向型膜電流,而轉(zhuǎn)染LV-EGFP并未誘發(fā)出電流(圖10B)。此外,100 μmol/L人乙酰膽堿作用于pEGFP-N-nAChR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293未誘發(fā)出膜電流(圖10B)。

A:電極鉗制細(xì)胞代表性圖像;B:噻蟲啉對轉(zhuǎn)染后HEK293細(xì)胞全細(xì)胞膜電流的影響。圖10 pEGFP-N-nAChR重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293后全細(xì)胞膜電流記錄Fig.10 Recording of whole cell membrane currents after transfection of HEK293 with pEGFP-N-nAChR

2.10 噻蟲啉對細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響 為了初步探討噻蟲啉能與多房棘球絳蟲nAChR結(jié)合引起離子通道開放,我們用鈣離子探針檢測穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的nAChR-HEK293細(xì)胞中鈣離子濃度的變化。5 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL噻蟲啉分別與nAChR-HEK293細(xì)胞孵育6 h(F=30.04,P<0.000 1)、12 h(F=177.10,P<0.000 1)和24 h(F=48.64,P<0.000 1),細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)(圖11A)。結(jié)果表明,噻蟲啉可能激活多房棘球絳蟲的nAChR離子通道。進(jìn)一步使用流式細(xì)胞術(shù)分析鈣離子流變化如圖11B所示。經(jīng)噻蟲啉處理20 min后流式檢測可見,靜止的nAChR-HEK293細(xì)胞顯示穩(wěn)定的鈣離子基線。經(jīng)不同濃度噻蟲啉處理后,鈣離子濃度增加,并在接下來的5 min內(nèi)保持穩(wěn)定。

A:Rhod-2 AM定量檢測細(xì)胞漿內(nèi)游離Ca2+水平(200×);B:流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)鈣動員。**P<0.01 。圖11 噻蟲啉增加nAChR-HEK293細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平Fig.11 Thiacloprid increases calcium levels in nAChR-HEK293 cells

3 討 論

泡型包蟲病是由多房棘球絳蟲的后絳幼蟲期感染宿主引起的一種人獸共患寄生蟲病[20]。多房棘球絳蟲的自然生命周期通常包括犬科類動物(通常是狐貍)作為終宿主和田鼠作為中間宿主[21]。然而,許多哺乳動物(包括人類)通過攝入寄生蟲蟲卵而感染成為中間宿主。甲苯達(dá)唑和阿苯達(dá)唑是目前獲準(zhǔn)用于人類的少數(shù)幾種抗蠕蟲藥物[22]。然而,這些藥物已被證明對泡型包蟲病具有寄生蟲抑制作用而非殺寄生蟲作用[23]。同時,中斷治療后的高復(fù)發(fā)率和副作用限制了它們的應(yīng)用[24]。因此,抗包蟲病新藥物或新靶點的發(fā)現(xiàn)顯得尤為迫切。

靶向人類nAChRs的藥物在臨床上有重要的作用,它們?yōu)槟峁哦〕砂a、阿爾茨海默病和精神分裂癥提供治療方法,以及用于治療一些由nAChR突變引起的神經(jīng)疾病[25-27]。此外,通過靶向無脊椎動物nAChRs已經(jīng)實現(xiàn)了對害蟲和蠕蟲寄生蟲的有效控制[28-30]。一般來說,化合物需要適當(dāng)?shù)挠H脂性才能顯示出高殺蟲作用,因為它們只能在穿過角質(zhì)層和包裹神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞后才能接觸nAChR發(fā)揮殺蟲效應(yīng)。我們通過設(shè)計引物擴(kuò)增出原頭節(jié)nAChR基因,其擴(kuò)增序列與Wormbase Parasite數(shù)據(jù)庫序列一致,進(jìn)一步明確了多房棘球絳蟲原頭節(jié)中nAChR基因的存在。研究表明,HEK293細(xì)胞膜上缺乏相應(yīng)的受體,因而能夠表達(dá)多種異源性基因,同時能為蛋白質(zhì)的加工提供基礎(chǔ)[31]。我們通過將nAChR基因克隆到熒光真核表達(dá)載體上,并在HEK293細(xì)胞上表達(dá)nAChR蛋白。

nAChRs作為膽堿能驅(qū)蟲藥的靶位,可由五個相同亞基或不同亞基組成五聚體膜蛋白,圍繞一個中央陽離子可滲透孔[32-33]。不同nAChR亞基的組合導(dǎo)致在肌肉細(xì)胞上形成異聚受體,從而產(chǎn)生多種受體亞型,每種亞型具有不同的藥理學(xué)和驅(qū)蟲敏感性[34-35]。在本研究中,我們成功在HEK293細(xì)胞膜上表達(dá)多房棘球絳蟲nAChR蛋白。在15 μmol/L噻蟲啉作用于轉(zhuǎn)染后的nAChR-HEK293細(xì)胞,隨著時間的延長,細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。全細(xì)胞膜電流檢測顯示噻蟲啉干預(yù)后誘導(dǎo)內(nèi)向型電流形成,這表明噻蟲啉可能作用于轉(zhuǎn)染后nAChR蛋白導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度增加。但nAChR在HEK293細(xì)胞膜上是否形成同源五聚體仍有待進(jìn)一步研究證實。

總之,本研究在HEK293細(xì)胞上異源表達(dá)了其中一種nAChR,并分析nAChR與噻蟲啉的分子對接構(gòu)象。噻蟲啉作用后證實能引起細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子增加。

利益沖突:無

引用本文格式:王宇琦,達(dá)哇卓瑪,張雨薇,等.噻蟲啉對表達(dá)多房棘球絳蟲nAChR基因HEK293細(xì)胞內(nèi)鈣的影響[J].中國人獸共患病學(xué)報,2023,39(8):739-749. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2023.00.080