吳岳，要星辰，史湘君，徐子彧，任杰，時(shí)銘，黎萌，劉俊鵬，杜心如

（首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院骨科，北京 100020）

骨肉瘤（osteosarcoma,OS）多源于間葉組織，在骨骼系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)病率列第一，以青少年為主，血行轉(zhuǎn)移后患者5 年存活率較低，具有惡性程度高、預(yù)后差特點(diǎn)，為臨床難題［1～3］。微小RNA（microRNA,miRNA）被證實(shí)參與細(xì)胞生長、分化/裂、凋亡等過程，在腫瘤診斷、預(yù)后評估中有重要作用［4］；不同腫瘤組織miRNA 表達(dá)譜不一，miR-494 或基因蛋白等參與OS 發(fā)病、進(jìn)展［5，6］。miR-17-92 基因簇分布在人13q31.3 染色體，包括miR-17、miR-18a、miR-19a/b 等共7 個(gè)成熟miRNA，屬于原癌基因miRNA 代表，參與多種惡性腫瘤發(fā)生、進(jìn)展［7，8］。miR-17-92 基因簇被發(fā)現(xiàn)在人胃癌組織中高表達(dá)，與腫瘤直徑、TNM 分期有關(guān)；其過表達(dá)可能通過上調(diào)Integrin β1 表達(dá)、增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase,MMP）-2 活性以促M(fèi)GC-803 細(xì)胞侵襲［9］。有研究稱miR-17-92 基因簇對腫瘤發(fā)展起抑制作用，有抑癌效應(yīng)［10］?？梢婈P(guān)于miR-17-92 基因簇在不同腫瘤中的表達(dá)趨勢不一，尚無統(tǒng)一定論。Arabi 等［11］研究表明，miR-17-92 簇及其旁鏈106a-363/106b-25 在OS 細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，與臨床結(jié)局、促凋亡靶點(diǎn)等密切相關(guān)；認(rèn)為miR-17-92簇及其2 個(gè)副鏈在OS 生物學(xué)中有致病、預(yù)后影響的關(guān)鍵作用。林金鑾等［12］研究表明，人OS 組織中miR-17-92 基因簇相比正常骨組織均高表達(dá)，且與預(yù)后相關(guān)，認(rèn)為miR-17-92 基因簇可能參與OS 發(fā)生、進(jìn)展，有望成為OS 患者預(yù)后評估的新標(biāo)志物。但由于OS 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前對于miR-17-92 基因簇在OS 發(fā)生、進(jìn)展中的作用機(jī)制尚不清楚，且國內(nèi)相關(guān)報(bào)道不多。對此本研究以O(shè)S 細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，旨在探究miR-17-92 基因簇對OS MG-63 細(xì)胞增殖、侵襲的影響，并從相關(guān)信號(hào)通路方面分析其可能作用機(jī)制，為OS 診斷、治療提供新的腫瘤標(biāo)記物、靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

MG-63、hFOB1.19（正常細(xì)胞株）均購于中科院上海細(xì)胞研究所，本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)保存。胎牛血清（上海吉泰依科賽生物科技有限公司）；PBS（美國Sigma）；RPMI1640 培養(yǎng)基與DMEM/F12 培養(yǎng)液（武漢普諾賽生命科技有限公司）；Lipofectamine 2000 試劑盒（賽默飛世爾科技(中國)有限公司）；miR-17-92 基因簇模擬物與陰性對照（美國signosis公司）；TaqMan miRNA Isolation Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國AB Applied Biosysytems 公司）；miR-17-92 基因簇引物［生工生物工程（上海）股份有限公司］ ；Trizol 裂解液與miRNA 分離試劑盒（美國Invotrogen 公司）；CCK-8 試劑盒（北京沃比森科技有限公司）；轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor beta 1,TGF-β1）、Smad3、MMP-2、MMP-9 單克隆抗體與HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗（日本Takara 公司）。

1.2 細(xì)胞分組與體外轉(zhuǎn)染處理

OS 細(xì)胞MG-63、人成骨細(xì)胞hFOB1.19 分別在含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基、DMEM/F12 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，前者設(shè)置溫度37℃，后者為34℃，均5% CO2。選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，依據(jù)Lipofectamine 2000 操作說明書將miR 模擬物轉(zhuǎn)染到OS 細(xì)胞MG-63 細(xì)胞內(nèi)，分為miR-17-92 基因簇模擬物組（miR-17-92 組）與陰性對照組（miR-NC 組）。

1.3 檢測方法與指標(biāo)

1.3.1 qRT-PCR 檢測

對轉(zhuǎn)染前MG-63、hFOB 細(xì)胞及轉(zhuǎn)染MG-63 后的miR-17-92 組、miR-NC 組miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20、miR-92 相對表達(dá)量測定：OS 細(xì)胞MG-63、人成骨細(xì)胞hFOB1.19 應(yīng)用PBS 洗滌2 次，離心提取細(xì)胞沉淀，依據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，于7500 Fast Real-Time PCR 儀上開展，20 μl 反應(yīng)體系中進(jìn)行，稀釋逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 后取其2 μl 和TaqMan 引物2 μl 混合，95℃10 min 變性，接著95℃15 s，60℃60 s，共40 個(gè)循環(huán)，完成后記錄各反應(yīng)管Ct 值，選擇U6 為內(nèi)參，經(jīng)由2-△△CT 法計(jì)算miR-17-92 基因簇相對表達(dá)量。相關(guān)引物序列：U6 正向、反向引物分別為CTCGCTTCGGCAGCACA、AACGCTTCACGAATTTGCGT、has-miR-17、has-miR-18a、has-miR-19a、has-miR-19b、hasmiR-20、has-miR-92；引物序列分別為5'-GCAAAG TGCTTACAGTGCAGGTAG-3'、5'-UAAGCUCGAUGU AGUGCAGUAAC-3'、5'-TGTGCAAATCTATGCAAA ACTG-3'、5'GCATCCCAGTGTGCAAATCC-3'、5'-G GTAAAGTGCTTATAGTGCAGGTAG-3'、5'-ATTGCA CTTGTCCCGGCCTGT-3'。

1.3.2 CCK-8 檢測

測定轉(zhuǎn)染后miR-17-92 組、miR-NC 組MG-63細(xì)胞增殖能力：轉(zhuǎn)染后選擇對數(shù)生長期細(xì)胞，經(jīng)由胰酶消化，洗滌2 次，借助完全培養(yǎng)基調(diào)控細(xì)胞到3×103 個(gè)/ml，各孔（96 孔板）接種細(xì)胞液100 μl。培養(yǎng)1、2、3 d 時(shí)分別加入調(diào)配好的CCK-8 試劑（共100 μl，CCK-8 試劑、完全培養(yǎng)基分別10 μl、90 μl）孵育120 min，通過CLARIOstar 全功能多功能酶標(biāo)儀對450 nm 處光密度（optical density,OD） 檢測，OD450 代表細(xì)胞增殖能力。

1.3.3 Transwell 檢測

測定轉(zhuǎn)染后miR-17-92 組、miR-NC 組MG-63細(xì)胞侵襲數(shù)量：MG-63 細(xì)胞被消化后經(jīng)由含血清DMEM 培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞到3×105個(gè)/ml，提細(xì)胞液100 μl 接種至Transwell 小室之上室，下室則為20% FBS DMEM 培養(yǎng)基500 μl，隨后Transwell 小室放入培養(yǎng)箱內(nèi)1 d。CO2培養(yǎng)箱內(nèi)取出Transwell 培養(yǎng)板，舍棄Transwell 小室上層液體，棉簽對小室上層輕拭后倒扣之，室溫放置180～300 s。舍棄孔內(nèi)液體，無鈣PBS 清洗2 次，4%甲醛固定0.5 h，1%結(jié)晶紫染色，時(shí)長10 min。顯微鏡下觀察Transwell 培養(yǎng)板，隨機(jī)選擇5 個(gè)視野拍照且計(jì)數(shù)。

1.3.4 Western blot 檢測

測定轉(zhuǎn)染后miR-17-92 組、miR-NC 組MG63 細(xì)胞相關(guān)蛋白水平：轉(zhuǎn)染MG-63 細(xì)胞、培養(yǎng)48 h 后通過Western blot 檢測細(xì)胞內(nèi)TGF-β1、Smad3、MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平測定。依據(jù)1∶10（g/ml）比例滴進(jìn)RIPA 裂解液，參考BCA 蛋白定量試劑盒對各組細(xì)胞總蛋白含量檢測。裂解、提取各組蛋白后行SDS-PAGE 電泳分離，之后將其置于硝酸纖維素膜，處理后將該膜放入5%脫脂奶粉溶液中封閉120 min，常規(guī)室溫。TBST 洗滌3 次。一抗滴入，4℃孵育過夜。再漂洗3 次，HRP 標(biāo)記之而抗體滴入，室溫孵育120 min，漂洗3 次。ECL 工作液顯色，經(jīng)由Image J 圖像分析系統(tǒng)分析相關(guān)蛋白顯影圖，GAPDH為內(nèi)參，測定相關(guān)蛋白水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料滿足正態(tài)分布以±s表示，兩組間行獨(dú)立t檢驗(yàn)；組內(nèi)時(shí)間點(diǎn)比較采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩個(gè)細(xì)胞株miR 的mRNA 表達(dá)

MG-63 細(xì)胞miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20、miR-92 相對表達(dá)量均顯著高于hFOB 細(xì)胞（P＜0.05），見表1。

表1 兩株細(xì)胞miR 的mRNA 表達(dá)（相對表達(dá)量，±s）與比較

表1 兩株細(xì)胞miR 的mRNA 表達(dá)（相對表達(dá)量，±s）與比較

指標(biāo)miR-17 miR-18a miR-19a miR-19b miR-20 miR-92 MG-63 細(xì)胞（n=10）4.1±1.0 2.3±0.5 2.0±0.4 2.1±0.4 6.2±2.2 5.1±1.9 hFOB 細(xì)胞（n=10）1.2±0.3 1.4±0.5 1.3±0.4 1.2±0.3 1.4±0.4 1.7±0.5 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

2.2 轉(zhuǎn)染后MG-63 細(xì)胞miR 的mRNA 表達(dá)

miR-17-92組miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20、miR-92 相對表達(dá)量均顯著高于miRNC 組（P＜0.05），見表2。

表2 MG-63 陽性與陰性轉(zhuǎn)染miR-17-92 后檢測結(jié)果（±s）與比較

表2 MG-63 陽性與陰性轉(zhuǎn)染miR-17-92 后檢測結(jié)果（±s）與比較

指標(biāo)mRNA 檢測(相對表達(dá)量)miR-17 miR-18a miR-19a miR-19b miR-20 miR-92細(xì)胞增殖(OD)1 d 2 d 3 d P 值細(xì)胞侵襲(%)蛋白表達(dá)(相對表達(dá)量)TGF-β1 Smad3 MMP-2 MMP-9 miR-17-92 組（n=5）miR-NC 組（n=5）P 值7.1±2.2 3.6±0.6 4.4±1.0 4.6±1.0 9.3±2.1 8.7±2.3 4.1±1.3 2.3±0.7 2.1±0.5 2.2±0.5 6.2±2.0 5.0±1.4 0.030 0.014 0.002＜0.001 0.044 0.015 0.013 0.045 0.038 0.5±0.1 0.9±0.2 1.2±0.3＜0.001 65.3±13.5 0.3±0.1 0.6±0.2 0.8±0.2 0.002 40.6±10.3 0.012 3.7±1.3 1.4±0.4 0.7±0.2 1.2±0.4 1.0±0.3 0.5±0.2 0.4±0.1 0.6±0.2 0.002 0.004 0.017 0.017

2.3 轉(zhuǎn)染后MG-63 細(xì)胞的增殖

miR-17-92 組與miR-NC 培養(yǎng)1、2 和3 d 的OD450 值均呈現(xiàn)上升趨勢，且miR-17-92 組培養(yǎng)1、2 和3d 的OD450 值均顯著高于miR-NC 組，見表2。

2.4 轉(zhuǎn)染后MG-63 細(xì)胞的侵襲

miR-17-92 組侵襲細(xì)胞數(shù)顯著多于miR-NC 組（P＜0.05），見表2。

2.5 轉(zhuǎn)染后MG-63 細(xì)胞蛋白表達(dá)

miR- 17- 92 組 TGF- β1、Smad3、MMP- 2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平均顯著高于miR-NC 組（P＜0.05），見表2、圖1。

圖1 Western blot 檢測相關(guān)蛋白電泳圖。

3 討 論

目前關(guān)于circRNA-miRNA 在OS 中的研究較多，為臨床熱點(diǎn)之一［13］。miR-17-92 基因簇可產(chǎn)生miR-17、miR-92 等多個(gè)單獨(dú)的miRNA，有報(bào)道稱，OS 組織中多個(gè)miRNA 異常上升或下降，其中miR-17-92 基因簇各miRNA 表達(dá)均上升［14］。Arabi 等［15］報(bào)道稱miR-19a、miR-19b、miR-92a 在OS 組織中高表達(dá)，且與TNM 分期有關(guān)，miR-17-92 基因簇高表達(dá)患者短期預(yù)后更差。Li 等［16］發(fā)現(xiàn)OS 患者中血清miR-17 水平相對健康者明顯高，與預(yù)后相關(guān)?？梢妋iR-17-92 基因簇可能促OS 發(fā)生、進(jìn)展。對OS來說，惡性程度從高到低為143B、MG-63、U2OS、Saos-2，為此本研究選擇惡性程度第二高的MG-63細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，一方面與臨床OS 惡性程度較高相符，另一方面僅選擇一種細(xì)胞株研究可減少不同細(xì)胞株對數(shù)據(jù)的偏倚。結(jié)果顯示相比正常人成骨細(xì)胞hFOB1.19，OS 細(xì)胞MG-63 中miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20、miR-92 表達(dá)水平顯著升高。表明miR-17-92 基因簇于MG-63 細(xì)胞株中高表達(dá)，這與上述報(bào)道相符。同時(shí)對MG-63 細(xì)胞轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)相比miR-NC 組，miR-17-92 組MG-63 細(xì)胞株中miR-17-92 基因簇各獨(dú)立miRNA 顯著增高，提示將模擬物成功導(dǎo)入至MG63 細(xì)胞。

癌細(xì)胞侵襲是癌癥轉(zhuǎn)移的重要前提與關(guān)鍵；癌細(xì)胞明顯增殖后借助侵襲作用經(jīng)由細(xì)胞外基質(zhì)轉(zhuǎn)移至其他器官/組織，導(dǎo)致癌癥轉(zhuǎn)移，影響預(yù)后［17，18］。本研究中，轉(zhuǎn)染miR-17-92 基因簇至MG-63 細(xì)胞后，CCK-8 檢測發(fā)現(xiàn)miR-17-92 組不同時(shí)間點(diǎn)的OD450 值相比miR-NC 組顯著升高，且隨時(shí)間推移不斷增強(qiáng)。同時(shí)miR-17-92 組細(xì)胞侵襲能力也顯著總結(jié)。表明轉(zhuǎn)染miR-17-92 基因簇模擬物能促進(jìn)OS MG-63 細(xì)胞進(jìn)一步增殖、侵襲。而關(guān)于miR-17-92對MG-63 細(xì)胞的作用機(jī)制較多且復(fù)雜。Yang 等［19］表明OS 發(fā)生、進(jìn)展與miR-17-92 基因簇/QKI2/catenin 調(diào)控軸有關(guān)。Wu 等［20］研究表明OS 細(xì)胞系中miR-17 表達(dá)顯著上調(diào)，敲除miR-17 后OS 細(xì)胞下游SASH1、MMP-2、MMP-9 等表達(dá)上升，其中SASH1 是miR-17 靶基因。認(rèn)為miR-19 通過靶向SASH1 促細(xì)胞增殖、侵襲。TGF-β1 為腫瘤細(xì)胞常見信號(hào)通路之一，與細(xì)胞分化、生長、增殖等有關(guān)［21］。有研究表明，青花鈣素A 通過對OS 中TGFβ1/Smad2/3 信號(hào)通路抑制以阻斷TGF-β1 誘導(dǎo)的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化［22］。Smad3 被TGF-β 誘導(dǎo)會(huì)出現(xiàn)磷酸化，p-Smade3 形成至細(xì)胞核，和對應(yīng)靶點(diǎn)結(jié)合以激活信號(hào)通路［23］。本研究中，通過Western blot 檢測發(fā)現(xiàn)，相比miR-NC 組，miR-17-92 基因簇mimic 組MG-63 細(xì)胞TGF-β1、Smad3 蛋白水平顯著升高。提示miR-17-92 基因簇可能通過TGF-β1/Smad3 信號(hào)通路促進(jìn)MG-63 細(xì)胞增殖、侵襲。MMP-2、MMP-9與細(xì)胞外基質(zhì)密切相關(guān)，被激活后可至細(xì)胞外基質(zhì)最前端，參與細(xì)胞外基質(zhì)降解過程。腫瘤細(xì)胞中MMP-2、MMP-9 水平均顯著上調(diào)，促腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。胡曉波等［24］研究表明，相比正常骨組織，OS 組織中MMP-9 mRNA 表達(dá)水平顯著升高，通過沉默MMP-9 能顯著減弱OS 細(xì)胞增殖、侵襲能力，且高表達(dá)MMP-9 者總生存率比低表達(dá)者顯著低，表明MMP-9 與OS 增殖、侵襲、預(yù)后相關(guān)。本研究中相比miR-NC 組，miR-17-92 組MG-63 細(xì)胞MMP-2、MMP-9 蛋白水平顯著升高。表明miR-17-92 基因簇對MG-63 細(xì)胞增殖、侵襲可能與上調(diào)MMP-2、MMP-9 蛋白水平有關(guān)。

綜上所述，骨肉瘤MG-63 細(xì)胞株中miR-17-92基因簇各單獨(dú)miRNA 表達(dá)均上升，它可能是通過增強(qiáng)TGF-β1/Smad3/MMP-9 信號(hào)通路以提高骨肉瘤MG-63 細(xì)胞增殖、侵襲能力。本研究僅于體外行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，且未涉及其他骨肉瘤細(xì)胞株，后續(xù)會(huì)于體內(nèi)、增多不同類型細(xì)胞株進(jìn)一步分析miR-17-92 基因簇的作用機(jī)制。