王 立, 殷劍美, 韓曉勇, 蔣 璐, 郭文琦, 金 林, 張培通

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所,江蘇 南京 210014)

淀粉是儲(chǔ)存在葉片葉綠體或儲(chǔ)存器官中的主要化合物,被用作種子休眠和植物生長(zhǎng)的能量來(lái)源,也是人類(lèi)和動(dòng)物最重要的能量來(lái)源,并被廣泛用作工業(yè)生產(chǎn)的原料。植物主要合成支鏈淀粉和直鏈淀粉,兩者的結(jié)構(gòu)和比例決定了淀粉的理化特性,如溶脹、溶解性、可塑性和黏度等[1-2]。

研究結(jié)果顯示,可溶性淀粉合成酶(SSS)通過(guò)催化形成α-1,4糖苷鍵延長(zhǎng)合成具有不同長(zhǎng)度的支鏈淀粉,決定支鏈淀粉的鏈條長(zhǎng)度和鏈長(zhǎng)分布,從而影響支鏈淀粉的理化性質(zhì)以及淀粉粒的結(jié)構(gòu)和品質(zhì)[2-3]。SSS主要存在于植物葉片和貯藏組織,主要分為4個(gè)亞家族,即SSI、SSII、SSIII和SSIV,大多存在于質(zhì)體基質(zhì)中。SSI主要參與支鏈淀粉的短鏈產(chǎn)生,SSII和SSIII參與支鏈淀粉的鏈條延伸[3]。研究結(jié)果顯示,SSI在馬鈴薯塊莖淀粉合成中的酶活性較弱,而在水稻和玉米胚乳中具有較強(qiáng)的活性;下調(diào)SSII的轉(zhuǎn)錄水平會(huì)影響馬鈴薯塊莖中的鏈長(zhǎng)分布,改變淀粉結(jié)構(gòu)和其他淀粉合成酶活性[2,4-5]。此外,SSS每個(gè)亞家族又含有同工酶,但是這些同工酶如何影響植物中合成的支鏈淀粉的數(shù)量和組成尚待闡明。目前關(guān)于芋可溶性淀粉生物合成的研究相對(duì)較少,對(duì)于淀粉合成酶的功能尚不清楚。

本研究在靖江香沙芋轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基礎(chǔ)上,克隆獲得3個(gè)芋可溶性淀粉合成酶CeSS家族基因,通過(guò)分析氨基酸序列、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和親緣進(jìn)化關(guān)系,檢測(cè)3個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)譜,探索其與淀粉豐度形成的關(guān)系,從而加快芋可溶性淀粉合成機(jī)理的深入研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為靖江香沙芋, 種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院六合試驗(yàn)基地。分別在種植60 d、90 d、120 d、150 d和180 d取樣。地上部組織取樣部位為葉片和葉柄,地下部組織取樣部位為母芋、子芋和根。葉片打孔取樣,葉柄切段取樣,球莖去皮取樣,根洗去雜質(zhì)取樣,統(tǒng)一貯存于-80 ℃冰箱。每個(gè)組織取樣質(zhì)量約1.5 g,設(shè)3份重復(fù)。

1.2 cDNA合成

采用 RNAprep Pure Plant Kit[天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品]提取樣品RNA,cDNA合成采用寶生物工程(大連)有限公司PrimeScript RT reagent Kit和RNA PCR Kit,試驗(yàn)方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

1.3 基因克隆

根據(jù)已獲得的靖江香沙芋轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),通過(guò)BLASTx方法比對(duì)獲得CeSS基因信息,使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)基因克隆引物和基因表達(dá)引物(表1)。PCR擴(kuò)增方法參考王立等[6]的方法。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送北京鼎國(guó)科技公司完成序列測(cè)定。

表1 CeSS家族基因特異引物

1.4 氨基酸序列和進(jìn)化分析

采用DNAman完成氨基酸序列同源性比較,在MEGA v4.0中構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。采用SMART在線數(shù)據(jù)庫(kù)(http://smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè),在ExPaSy網(wǎng)站(http://web.expasy.org/compute_pi/)計(jì)算等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量,采用Cell-PLoc 2.0 package預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位。

1.5 轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

以Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因。采用SYBR PremixExTaqKit進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè),按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。定量RT-PCR反應(yīng)體系為20 μl,程序如下:95 ℃ 30 s;每循環(huán)95 ℃ 3 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán);最后95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,每個(gè)樣品3次重復(fù)。參考Livak等[7]的方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.6 支鏈淀粉含量測(cè)定

采用何潔等[8]雙波長(zhǎng)法測(cè)定芋球莖中的支鏈淀粉含量。取播種后不同時(shí)期球莖干燥樣品,質(zhì)量為0.1 g,用1 ml無(wú)水乙醇+9 ml 1 mol/L KOH研磨,沸水浴加熱溶解10 min,冷卻后定容至100 ml。檢測(cè)535 nm、757 nm下的吸光值,計(jì)算支鏈淀粉含量。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用 Microsoft Excel 2010 軟件和 SPSS 17.0 軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 芋可溶性淀粉合成酶家族基因克隆及序列分析

經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì),共鑒定獲得3個(gè)芋可溶性淀粉合成酶SS基因,分別命名為CeSSI、CeSSII、CeSSIII。CeSSI基因堿基序列全長(zhǎng)為1 932 bp,編碼643個(gè)氨基酸(圖1),蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)分別為70 795和6.02(表2)。CeSSII基因堿基序列全長(zhǎng)為2 409 bp,編碼802個(gè)氨基酸(圖2),蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)分別為88 702和5.75(表2)。CeSSIII基因堿基序列全長(zhǎng)為3 606 bp,編碼1 202個(gè)氨基酸(圖3),蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量和理論等電點(diǎn)分別為136 248和5.47(表2)。蛋白質(zhì)親水性預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果(表2)顯示,3個(gè)CeSS蛋白均為親水性蛋白質(zhì),且均定位在葉綠體。

圖2 CeSSII氨基酸序列分析Fig.2 Amino acid sequence analysis of CeSSII

圖3 CeSSIII氨基酸序列分析Fig.3 Amino acid sequence analysis of CeSSIII

表2 CeSS基因家族及其編碼蛋白質(zhì)的生化特性

2.2 芋可溶性淀粉合成酶氨基酸序列和進(jìn)化分析

圖4顯示,3個(gè)SS蛋白的氨基酸序列比較相似,均含有Glyco_transf結(jié)構(gòu)域,其中CeSSI和CeSSII蛋白含有1個(gè)Glyco_transf_5結(jié)構(gòu)域(CeSSI,Asn135～Ser393;CeSSII,Asn312～Glu555)和1個(gè)Glyco_trans_1_4結(jié)構(gòu)域(CeSSI,Asp448～I(xiàn)le597;CeSSII,Leu608～Thr762),而CeSSIII僅含有1個(gè)Glyco_trans_4結(jié)構(gòu)域(Gly770～Gly944),以及3個(gè)CBM_25結(jié)構(gòu)域(Gly316～Glu402、Glu492～Pro583、Gly654～Thr745)。

圖4 CeSS蛋白Pfam結(jié)構(gòu)分析Fig.4 Pfam structure of CeSS protein

系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果(圖5)表明,3個(gè)SS蛋白聚類(lèi)分為3組,表現(xiàn)出進(jìn)化差異:CeSSI與海棗(Phoenixdactylifera, XP_008783178.1)中SS蛋白最接近,序列相似度為62.9%,其次是菜豆(Phaseolusvulgaris,BAD18845.1)和擬南芥(Arabidopsisthaliana, NP_197818.1),序列相似度分別為59.7%和59.4%;CeSSII與蘆筍(Asparagusofficinalis,XP_020257302.1)中相應(yīng)蛋白質(zhì)較相近,序列相似度為56.3%,其次是菠蘿(Ananascomosus,XP_020104470.1)和繁穗莧(Amaranthuscruentus,ABA64552.1);CeSSIII與藥用稻(Oryzaofficinalis,AIU99454.1)SS蛋白相似度最高,序列相似度為55.5%,其次是玉米(Zeamays, AFW59498.1)和擬南芥(Arabidopsisthaliana,NP_172637.2)。

Amaranthus cruentus:繁穗莧;Ananas comosus:菠蘿;Arabidopsis lyrata subsp. lyrata:擬南芥琴亞科;Arabidopsis thaliana:擬南芥;Asparagus officinalis:蘆筍;Brassica napus:甘藍(lán)型油菜;Capsella rubella:芥菜;Colocasia esculenta:芋;Elaeis guineensis:油棕;Glycine max:大豆;Ipomoea batatas:甘薯;Malus domestica:蘋(píng)果;Manihot esculenta:木薯;Morus notabilis:川桑;Nelumbo nucifera:蓮;Oryza officinalis:藥用稻;Oryza sativa Japonica group:粳稻;Phaseolus vulgaris:菜豆;Phoenix dactylifera:海棗;Populus euphratica:胡楊;Prunus mume:梅花;Ricinus communis:蓖麻;Solanum lycopersicum:番茄;Theobroma cacao:可可;Triticum aestivum:小麥;Vitis vinifera:葡萄;Zea mays:玉米。圖5 不同植物SS家族基因系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of SS family genes in different plant species

2.3 芋可溶性淀粉合成酶家族基因的表達(dá)水平分析

圖6顯示,芋可溶性淀粉合成酶家族的3個(gè)基因CeSSI、CeSSII、CeSSIII在芋的不同組織中均有表達(dá),但在母芋和子芋中高表達(dá),在根、葉片和葉柄中低表達(dá),說(shuō)明同一基因的組織表達(dá)譜差異較大;而在同一組織中,尤其是母芋和子芋中,CeSSII基因表達(dá)量最高,其次是CeSSI和CeSSIII。圖7顯示,在芋發(fā)育過(guò)程中,葉片中CeSSI、CeSSII、CeSSIII基因表達(dá)趨勢(shì)基本不變,而球莖中的表達(dá)水平均高于葉片。球莖中的CeSSI、CeSSII基因在種植60 d后表達(dá)量開(kāi)始提高,在種植150 d表達(dá)水平達(dá)到峰值,隨后略有下降;而CeSSIII基因在種植60 d后在球莖中表達(dá)量開(kāi)始上調(diào),在種植120 d時(shí)表達(dá)增速最快,隨后表達(dá)水平趨緩,在種植180 d時(shí)表達(dá)水平最高。

同一基因不同組織間不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6 CeSSI、CeSSII和CeSSIII在不同芋組織中的表達(dá)Fig.6 Expression of CeSSI, CeSSII and CeSSIII in different tissues of taro

同一組織間不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7 CeSSI (A)、CeSSII (B) 和 CeSSIII (C)在芋不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)Fig.7 Expression of CeSSI (A), CeSSII (B) and CeSSIII (C) at different developmental stages of taro

2.4 CeSSIII的基因表達(dá)與芋球莖支鏈淀粉含量相關(guān)性分析

圖8顯示,芋球莖支鏈淀粉含量呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì),在種植120～150 d增長(zhǎng)速率最高,球莖支鏈淀粉含量在種植180 d達(dá)到較大值。相關(guān)性分析結(jié)果顯示,芋球莖CeSSIII的表達(dá)水平與支鏈淀粉含量之間存在明顯正相關(guān)性。

不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。圖8 不同發(fā)育時(shí)期芋球莖中支鏈淀粉含量分析Fig.8 Amylopectin contents in corms of taro at different development stages

3 討 論

3.1 芋可溶性淀粉合成酶家族成員具有各自獨(dú)特功能

在植物葉片和貯藏組織中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了4種形式的淀粉合成酶:SSI、SSII、SSIII和SSIV[1,9]。在馬鈴薯上的研究結(jié)果顯示,SSI和SSII是主要淀粉合酶,會(huì)影響淀粉含量和結(jié)構(gòu),SSIII是支鏈淀粉主要合成酶,其活性占?jí)K莖可溶性淀粉合成酶活性的80%[3]。本研究結(jié)果顯示,靖江香沙芋中存在3個(gè)可溶性淀粉合成酶,均具有類(lèi)似的Glyco_transf結(jié)構(gòu)域,它們與腺苷二磷酸(ADP)葡萄糖結(jié)合,催化合成淀粉,而CeSSIII中除了同樣的Glyco_transf結(jié)構(gòu)域以外,還包含3個(gè)CBM_25結(jié)構(gòu)域,具有淀粉結(jié)合特性,可能與淀粉鏈長(zhǎng)有關(guān)[2]。前人研究發(fā)現(xiàn),SSI氨基末端區(qū)域高度保守的KXGGL基序,是可溶性淀粉合成的起始酶,與糖原合成酶底物ADP-葡萄糖結(jié)合,可能對(duì)芋的短支鏈淀粉合成具有重要作用[10]。SSII可影響支鏈淀粉的分支合成,改變淀粉粒的晶體層結(jié)構(gòu)和淀粉糊化溫度[1]。SSIII中含有的六肽基序(RYGTVPVV)與14-3-3蛋白結(jié)合位點(diǎn)基序相關(guān)[1, 11],后者通過(guò)負(fù)調(diào)控?cái)M南芥中可溶性淀粉合成酶活性,進(jìn)而影響擬南芥葉片中淀粉積累,說(shuō)明CeSSIII與芋淀粉儲(chǔ)藏密切相關(guān)[2]。

3.2 3個(gè)芋可溶性淀粉合成酶基因與淀粉合成緊密相關(guān)

本研究結(jié)果表明,CeSSI、CeSSII和CeSSIII主要在芋球莖中表達(dá),但在芋的不同發(fā)育階段,3個(gè)基因表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。CeSSI和CeSSII在未成熟的芋球莖中表達(dá)水平較高,與馬鈴薯中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)趨勢(shì)相似,即在種植90 d左右明顯上調(diào)表達(dá),表明CeSSI和CeSSII更趨向于參與芋球莖中瞬時(shí)淀粉的合成[2, 5];而CeSSIII的轉(zhuǎn)錄上調(diào)時(shí)間相對(duì)較遲,在種植120 d時(shí)上調(diào)速率最高,在種植180 d的成熟球莖中表達(dá)水平最高,與在香蕉中的表達(dá)模式基本一致,說(shuō)明CeSSIII更傾向于參與貯藏淀粉的合成[12]。

本研究發(fā)現(xiàn),在芋發(fā)育過(guò)程中,芋球莖中支鏈淀粉含量持續(xù)增加,在種植180 d達(dá)到較大值,而且芋球莖中CeSSIII基因表達(dá)量與芋球莖中支鏈淀粉含量呈正相關(guān),表明CeSSIII與芋球莖中淀粉貯藏有關(guān)。該結(jié)果與在馬鈴薯上的研究結(jié)果類(lèi)似,馬鈴薯塊莖中SSIII活性占總SS活性的80%,與貯藏淀粉的合成密切相關(guān)[3]。

本研究結(jié)果表明,芋可溶性淀粉合成酶基因家族的3個(gè)基因與球莖淀粉合成密切相關(guān),其中CeSSI和CeSSII參與芋球莖中瞬時(shí)淀粉的合成,而CeSSIII更傾向于參與貯藏淀粉的合成。今后需要對(duì)芋可溶性淀粉合成酶基因進(jìn)行深入研究,以明確和驗(yàn)證CeSSI、CeSSII和CeSSIII基因功能。