袁 苗, 劉 鑫, 黨仕卓, 黃嘉俊, 高迎東, 周 娟, 張亞紅

(寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川 750021)

花芽分化受內(nèi)部因素(碳水化合物和激素等)和環(huán)境因素(光和溫度等)相互作用的影響[1-3]。而光照作為植株生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)境因素之一,對(duì)植株形態(tài)建成、物質(zhì)組成和新陳代謝及生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)都有著巨大的調(diào)節(jié)作用[4]。有研究結(jié)果表明,植物對(duì)紅光、藍(lán)光有非常高的生物需求量[5],紅光處理會(huì)提高櫻桃番茄的單株產(chǎn)量,增加維生素C、可溶性糖以及番茄紅素含量,藍(lán)光處理則會(huì)縮短番茄果實(shí)轉(zhuǎn)色時(shí)間,降低硝酸鹽含量[6]。紅/藍(lán)(3∶1)或紅/藍(lán)(1∶1)組合光處理下番茄幼苗生長(zhǎng)健壯,植株的干物質(zhì)積累量大,果實(shí)品質(zhì)較高,葉片厚度增大且光合作用、熒光特性較強(qiáng)[7]。紅藍(lán)復(fù)合光能夠促進(jìn)葡萄的光合作用,且可以增強(qiáng)抗氧化酶活性[8]。相較于自然光,比例為1∶4的藍(lán)紅光處理可促進(jìn)火龍果花芽分化進(jìn)程,提高花芽成花率與坐果率,從而提高了產(chǎn)量[9]。紅光處理顯著增加了鐵皮石斛組培苗的根數(shù)和鮮質(zhì)量,而紅藍(lán)綠復(fù)合光處理既提前了鐵皮石斛的花期又提高了開花率[10]。此外,有研究結(jié)果表明,紅藍(lán)6∶1的組合光可提高不結(jié)球白菜和番茄內(nèi)源激素脫落酸(ABA)、玉米素核苷(ZR)以及生長(zhǎng)素(IAA)的含量[11]。

花芽分化是植物開花的前提,植物激素在這個(gè)過程中起調(diào)節(jié)作用,并在體內(nèi)具有一定的動(dòng)態(tài)平衡,且通過平衡互作調(diào)控參與植物花芽的分化過程,共同調(diào)節(jié)糖類的積累、運(yùn)輸及分配的各個(gè)過程,調(diào)控核酸、碳、氮等物質(zhì)代謝[12]。生長(zhǎng)素作為內(nèi)源生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)之一,在植物生長(zhǎng)發(fā)育、階段轉(zhuǎn)變、成花誘導(dǎo)及花器官發(fā)育中扮演重要角色[13-15]。研究結(jié)果表明,IAA對(duì)于花芽生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控可能涉及參與細(xì)胞分裂和增殖的精確調(diào)控,而這一調(diào)控過程可能誘導(dǎo)更多的花芽形成[16]。

生長(zhǎng)素響應(yīng)因子(Auxin response factor,ARF)不僅是IAA信號(hào)調(diào)控途徑中的重要調(diào)控因子,也是調(diào)節(jié)IAA參與植物響應(yīng)生長(zhǎng)素信號(hào)及外界環(huán)境信號(hào)的關(guān)鍵因子[17]。在大多數(shù)植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了ARF家族基因,比如擬南芥[18]、葡萄[19]、甜橙[20]、水稻[21]、番茄[22]等植物。ARF作為IAA信號(hào)途徑的重要調(diào)控子,可以同下游生長(zhǎng)素響應(yīng)基因的啟動(dòng)子區(qū)域TGTCTC或TGTCCCAT結(jié)合,從而激活或抑制下游基因的表達(dá),在生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中具有關(guān)鍵作用[23-24]。研究結(jié)果表明,ARF轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量在花芽形成過程中有顯著變化,對(duì)頂端分生組織的形成有顯著作用[25]。在模式植物擬南芥中的研究發(fā)現(xiàn),AtARF17促進(jìn)花藥發(fā)育和花粉管壁形成[26],AtARF1和AtARF2參與花器官的發(fā)育和凋謝過程等[17],擬南芥中AtARF6和AtARF8能夠參與未成熟花雌蕊和雄蕊的發(fā)育過程[27]。桂花發(fā)育過程中,OfARF11、OfARF12、OfARF13和OfARF14可能對(duì)桂花的花期延長(zhǎng)起到調(diào)控作用,該結(jié)果為ARF基因調(diào)控桂花花期的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)[28]。梅花PmARF17能夠促進(jìn)雌蕊的正常發(fā)育[29]。此外,王景超等[30]發(fā)現(xiàn),ARF在玉米雌花序發(fā)育的不同時(shí)期具有重要調(diào)控作用。

在設(shè)施栽培葡萄生產(chǎn)中,棚膜的老化,導(dǎo)致膜通透性降低,樹木葉片遮光等環(huán)境因素會(huì)導(dǎo)致栽培設(shè)施內(nèi)出現(xiàn)受光不足、受光不均勻等現(xiàn)象,最終導(dǎo)致葡萄花芽分化不良,影響產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益[31-32]。因此,設(shè)施增設(shè)發(fā)光二極管(LED)補(bǔ)光措施有助于葡萄花芽分化,然而具體的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。前期篩選出有利于花芽分化的最佳補(bǔ)光比例為:紅光∶藍(lán)光=4∶1[31],采取不同時(shí)期葡萄花芽進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析發(fā)現(xiàn),VvARF7參與調(diào)節(jié)花芽分化的激素通路。本研究通過探索VvARF7基因在花芽分化中的功能,通過對(duì)其進(jìn)行同源克隆、生物信息學(xué)和基因表達(dá)分析來挖掘該基因的光響應(yīng)潛力,為后續(xù)深入開展葡萄花芽分化的分子機(jī)制研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年5月-2021年9月在寧夏銀川市賀蘭縣園藝產(chǎn)業(yè)園(106°16′E,38°20′N)內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)材料為10年生設(shè)施栽培紅地球葡萄,株行距為0.8 m×1.5 m,每行6個(gè)生物學(xué)重復(fù),行間利用反光膜進(jìn)行分區(qū)。利用課題組前期試驗(yàn)篩選獲得的最佳復(fù)合光補(bǔ)光比例,紅光∶藍(lán)光=4∶1(R4B1)處理葡萄,不補(bǔ)光作為空白對(duì)照(CK),光周期為16 h/8 h,補(bǔ)光時(shí)間由揭苫升溫前至葡萄成熟。花芽采樣時(shí)期參考路瑤等[33]對(duì)紅地球花芽分化時(shí)間的劃分,于5月中旬到9月初進(jìn)行采樣,每15 d采樣1次,采取基部5～7個(gè)生長(zhǎng)一致的芽,6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。采集的葡萄花芽經(jīng)液氮速凍后立即帶回實(shí)驗(yàn)室,凍存于超低溫冰箱用于后續(xù)試驗(yàn)。

RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和同源重組試劑盒、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和XhoⅠ均購(gòu)自諾唯贊生物科技股份有限公司(南京),質(zhì)粒小提試劑盒、純化回收試劑盒及大腸桿菌感受態(tài)DH5α均購(gòu)自天根生化科技有限公司(北京)。瞬時(shí)表達(dá)載體PBI221-GFP和根癌農(nóng)桿菌菌株EH105均由寧夏大學(xué)賀蘭山校區(qū)葡萄抗逆分子育種實(shí)驗(yàn)室提供。引物合成及測(cè)序由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 基因克隆

葡萄花芽總RNA提取參照植物總RNA快速分離試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品)說明書進(jìn)行, 經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性,通過NanoDrop測(cè)定濃度和純度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將葡萄花芽總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,首先去除基因組DNA,體系為5×gDNA wiper Mix 2 μl,RNA 1 000 ng,RNase-free ddH2O補(bǔ)齊至10 μl;反應(yīng)條件:42 ℃ 2 min;cNDA合成:上一步的混合液10 μl,HiScript Ⅲ Enzyme Mix 2 μl, Random hexamers 1 μl,10×RT Mix 2 μl,Oligo (dT)20VN 1 μl,RNase-free ddH2O 補(bǔ)齊至20 μl,反應(yīng)條件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 15 s,4 ℃ 5 min。

參考VvARF7基因編碼區(qū)序列(CDS)并使用Primer 8.0軟件設(shè)計(jì)特異性全長(zhǎng)擴(kuò)增引物VvARF7-F/R (表1),以紅地球葡萄花芽的cDNA 為模板,使用高保真酶(南京諾唯贊生物科技有限公司產(chǎn)品)進(jìn)行特異性擴(kuò)增,擴(kuò)增體系為:cDNA 2.0 μl,上下游引物各1.0 μl,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 12.5 μl,ddH2O 3.5 μl。擴(kuò)增程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸2 min,上述程序循環(huán)30次;72 ℃徹底延伸10 min;擴(kuò)增完成后于4 ℃保存用于后續(xù)試驗(yàn)。

表1 本研究所用的引物序列

1.3 生物信息學(xué)分析

用DNASTAR軟件和美國(guó)生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)網(wǎng)絡(luò)服務(wù)工具對(duì)核苷酸序列進(jìn)行查詢和比對(duì);利用NCBI在線軟件工具Conserved Domains Search預(yù)測(cè)保守結(jié)構(gòu)域(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/);采用MEGA 12.0鄰接法(Bootstrap為1 000)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;在Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)(https://asia.ensembl.org/index.html)中搜索并下載VvARF7基因的起始密碼子上游2 000 bp 的啟動(dòng)子序列,使用在線軟件plantCARE進(jìn)行啟動(dòng)子序列分析;采用在線軟件ExPASy Proteomics server(https://web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)VvARF7基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì);使用DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列相似性比對(duì)。

1.4 基因表達(dá)模式分析

根據(jù)葡萄VvARF7基因CDS設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)特異擴(kuò)增引物(表1)。熒光定量?jī)x為qTOWER 2.2(德國(guó)Analytik Jena公司產(chǎn)品),反應(yīng)總體系為20 μl:2×ChamQ universal SYBR qPCR Master Mix 10 μl,cDNA 1 μl,上下游引物各1 μl,ddH2O 7 μl。運(yùn)行程序?yàn)?95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,55 ℃ 30 s,循環(huán)40次;95 ℃ 15 s,60 ℃ 60 s;95 ℃ 15 s。

1.5 植物瞬時(shí)表達(dá)載體構(gòu)建及亞細(xì)胞定位

設(shè)計(jì)植物過表達(dá)載體的特異性引物pBI221-GFP-VvARF7-F/pBI221-GFP-VvARF7-R(表1)。以葡萄花芽的cDNA為模板,利用純化回收試劑盒回收VvARF7基因擴(kuò)增產(chǎn)物和經(jīng)XbaⅠ和XhoⅠ雙酶切后的線性載體pBI221-35S-GFP,通過同源重組法將回收的PCR產(chǎn)物與酶切后的線性載體連接,產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞后,涂布于加有氨芐青霉素(Amp)的LB固體培養(yǎng)基上,37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)12 h,挑取單克隆進(jìn)行菌落PCR檢測(cè),檢測(cè)后,將正確的單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),提取質(zhì)粒,進(jìn)行酶切檢測(cè),檢測(cè)正確的送公司測(cè)序。構(gòu)建好的融合載體pBI221-GFP-VvARF7通過電激轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到農(nóng)桿菌EH105中,檢測(cè)正確的單克隆接種于50 ml含有利福平和卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng)16 h,將菌液收集至50 ml離心管中,3 000 r/min離心10 min收集菌體,加入重懸液[10 mmol/L MgCl2,10 mmol/L 2-嗎啉乙磺酸(MES)],使用移液槍吹散沉淀,再次離心10 min,棄去上清液,該步驟重復(fù)1次。上述步驟結(jié)束后,加入適量重懸液,使用移液槍吹散沉淀后,繼續(xù)加入乙酰丁香酮 (AS,200 μmol/L)靜置活化4～5 h后注射至煙草葉片中(6～8周),將黑暗環(huán)境培養(yǎng)24 h后的煙草轉(zhuǎn)到正常生長(zhǎng)環(huán)境培養(yǎng)2 d,剪取一小塊本氏煙草葉片,用DAPI (4′, 6-二脒基-2-苯基吲哚,核染料)染色(可利用10 ml注射器抽真空,使DAPI進(jìn)入煙草內(nèi)部,有利于染色),使用LeicaTC-SSP8X(德國(guó)Leica公司產(chǎn)品)共聚焦熒光顯微鏡觀察本氏煙草葉片中融合蛋白的分布情況。

1.6 數(shù)據(jù)分析

用2-△△Ct方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量,3次重復(fù)。用Microsoft Excel 2010軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,并采用IBM SPSS 26.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)比較差異顯著性,然后使用Origin Pro 2021軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因的克隆

根據(jù)目的基因的CDS設(shè)計(jì)同源克隆引物(表1),將提取的葡萄花芽總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后作為模板擴(kuò)增,擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示,將擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收后送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序,測(cè)序結(jié)果正確,VvARF7的CDS長(zhǎng)度為3 468 bp,編碼1 155個(gè)氨基酸(GenBank 登錄號(hào):XP 010656094.1)。

M:DL5 000 marker;1:VvARF7基因。圖1 葡萄VvARF7基因擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 Amplification product of VvARF7 gene of grape

2.2 VvARF7轉(zhuǎn)錄因子特征及啟動(dòng)子分析

采用ExPASy分析VvARF7蛋白理化性質(zhì),結(jié)果顯示,該蛋白質(zhì)分子式為C5 652H8 815N1 651O1 781S37,相對(duì)分子質(zhì)量為12 958,蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為6.66,不穩(wěn)定系數(shù)為76.67,脂肪系數(shù)為68.39,平均親水系數(shù)為-0.739,屬于酸性不穩(wěn)定親水蛋白質(zhì)。VvARF7的氨基酸組成中,Q谷氨酰胺(Gln)占比最高,為17.2%,C半胱氨酸(Cys)占比最低,為1.1%。分析VvARF7蛋白結(jié)構(gòu)域,結(jié)果(圖2a)顯示,該蛋白質(zhì)含有ARF轉(zhuǎn)錄因子特有的 B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(126～227 aa)、Auxin_resp 域(258～334 aa)以及AUX_IAA結(jié)構(gòu)域(1 040～1 112 aa)。對(duì)VvARF7蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),結(jié)果如圖2b所示,VvARF7蛋白的結(jié)構(gòu)分為α-螺旋結(jié)構(gòu)、延伸鏈、β-旋轉(zhuǎn)以及無規(guī)則卷曲,氨基酸殘基所占比例分別為27.27%、14.63%、8.14%和49.96%。最后,對(duì)VvARF7蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè),發(fā)現(xiàn)葡萄VvARF7基因編碼蛋白質(zhì)為多鏈折疊結(jié)構(gòu),該蛋白質(zhì)多肽鏈的主要結(jié)構(gòu)元件是無規(guī)則卷曲(圖3c)。

a為VvARF7蛋白的保守結(jié)構(gòu)域分析;b為VvARF7蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)(藍(lán)色為α-螺旋,紫色為無規(guī)則卷曲,紅色為延伸鏈;綠色為β-旋轉(zhuǎn));c為VvARF7蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。 圖2 葡萄VvARF7蛋白特征分析Fig.2 Characteristics analysis of VvARF7 protein in Vitis vinifera L.

VrARF7-like(XP 034700221.1):河岸葡萄;VvARF7(XP 010656094.1):葡萄;GhARF7 X1(XP 016753978.2):棉花;DzARF7-like(XP 022732351):榴蓮;TwARF7-like(XP 038712736.1):雷公藤;PdARF7-like(XP 034224656.1):扁桃;AtARF7(AAG35177.1):擬南芥;RhARF7(QNN25870.1):薔薇;ZmARF7(ADG43141.1):玉米;DcARF7(PKU86397.1):鐵皮石斛;CnARF7(KAG1369998.1):椰子。圖3 葡萄VvARF7蛋白與其他植物ARF7蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of VvARF7 protein of Vitis vinifera L. and other related plant species

VvARF7基因的啟動(dòng)子序列的分析結(jié)果(表2)表明,葡萄VvARF7基因啟動(dòng)子區(qū)域除存在TATA-box、CAAT-box等一些基本順式作用元件(表中未列出)外,還存在光響應(yīng)元件G-Box、Box 4、chs-CMA1a、TCT-motif和AAAC-motif,激素響應(yīng)元件TGACG-motif、ABRE、AuxRR-core和TCA-element。

表2 VvARF7基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

2.3 VvARF7蛋白進(jìn)化樹和多序列比對(duì)分析

為了確定葡萄VvARF7蛋白與其他植物中VvARF7蛋白的進(jìn)化關(guān)系,在NCBI中下載得到河岸葡萄(XP 034700221.1)、棉花(XP 016753978.2)、榴蓮(XP 022732351)、扁桃(XP 034224656.1)、薔薇(QNN25870.1)、雷公藤(XP 038712736.1)、擬南芥(AAG35177.1)、玉米(ADG43141.1)、鐵皮石斛(PKU86397.1)以及椰子(KAG1369998.1)的ARF7蛋白序列,利用MEGA 12.0軟件,采用鄰接法對(duì)葡萄的VvARF7 (XP 010656094.1)蛋白和其他物種的ARF7蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,結(jié)果(圖3)顯示,與葡萄VvARF7同源的蛋白質(zhì)可聚為2類,其中葡萄VvARF7與河岸葡萄VrARF7親緣關(guān)系最近,并與棉花、榴蓮、扁桃、薔薇、雷公藤、擬南芥聚為雙子葉植物類,而玉米、鐵皮石斛與椰子聚為單子葉植物類。

將VvARF7蛋白與其他7條相似度高的雙子葉植物ARF7蛋白進(jìn)行氨基酸多重序列比對(duì),結(jié)果(圖4)顯示序列一致性為76.36%,均含有ARF轉(zhuǎn)錄因子特有的B3 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域、Auxin_resp結(jié)構(gòu)域和AUX_IAA結(jié)構(gòu)域。

2.4 葡萄VvARF7基因表達(dá)模式分析

葡萄花芽分化的關(guān)鍵階段是花序分化,該階段是決定葡萄有無花的關(guān)鍵[34]。在補(bǔ)光處理期間,本研究發(fā)現(xiàn),在5月30日-8月15日葡萄花芽分化過程中紅藍(lán)(4∶1)復(fù)合光處理(R4B1)的VvARF7基因相對(duì)表達(dá)量低于不補(bǔ)光的對(duì)照組(CK)(圖5),紅地球葡萄花芽6月15日處于始分化期,6月15日及之前VvARF7相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組無顯著差異。6月30日-7月30日花芽分化階段處于原始體發(fā)育期、花序主軸發(fā)育和花序二級(jí)軸發(fā)育時(shí)期,在紅藍(lán)(4∶1)復(fù)合光處理下,VvARF7相對(duì)表達(dá)量顯著低于CK且維持在一個(gè)低水平狀態(tài),表明VvARF7相對(duì)表達(dá)量低有利于葡萄花芽分化。較低水平的IAA有利于花芽分化[35],在整個(gè)花芽分化過程中,VvARF7基因在紅藍(lán)(4∶1)復(fù)合光處理下,在5月30日-8月15日較CK均下調(diào)表達(dá),推測(cè)VvARF7有可能響應(yīng)紅藍(lán)光并整合生長(zhǎng)素和光信號(hào)參與葡萄花芽分化過程。

CK:不補(bǔ)光處理;R4B1:紅藍(lán)光補(bǔ)光處理。圖5 VvARF7基因在花芽分化不同時(shí)期的表達(dá)Fig.5 Expression of VvARF7 gene during different stages of flower bud differentiation

為進(jìn)一步了解VvARF7基因在葡萄不同組織中的表達(dá)情況,采用qRT-PCR對(duì)VvARF7在葉、花芽、根等組織中的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行分析,結(jié)果(圖6)顯示,VvARF7基因在葡萄的各個(gè)組織中均有不同程度的表達(dá),其中在卷須中的相對(duì)表達(dá)量最高,其次是根中,而在葉片中的相對(duì)表達(dá)量最低。這說明VvARF7基因在不同組織中的相對(duì)表達(dá)量存在差異,且可能在植物生長(zhǎng)發(fā)育的不同階段具有不同的作用。

圖6 VvARF7基因在葡萄不同組織中的表達(dá)量Fig.6 Expression amount of VvARF7 gene in different tissues of grapes

2.5 葡萄VvARF7蛋白亞細(xì)胞定位

為探究VvARF7蛋白的亞細(xì)胞定位情況,將去除終止子密碼子的CDS通過同源重組法與瞬時(shí)表達(dá)載體PBI221-GFP連接,形成重組質(zhì)粒pBI221-GFP-VvARF7,經(jīng)菌落PCR、酶切、測(cè)序鑒定正確后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng),提取重組質(zhì)粒,通過電擊法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌EH105感受態(tài),將農(nóng)桿菌菌液注射到4～6周的本氏煙草葉片中,培養(yǎng)3 d后觀察。結(jié)果如圖7所示,融合蛋白VvARF7-GFP的綠色熒光分布在細(xì)胞核上,說明VvARF7蛋白定位于細(xì)胞核中,這與其作為轉(zhuǎn)錄因子的功能特點(diǎn)相符。

PBI221為陰性對(duì)照,Merged為GFP和DAPI信號(hào)融合;GFP為綠色熒光信號(hào);DAPI為細(xì)胞核染料。比例尺=10 μm。圖7 VvARF7蛋白亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of VvARF7 protein

3 討 論

研究結(jié)果表明,光質(zhì)可以調(diào)控生長(zhǎng)素相關(guān)基因,并且可以介導(dǎo)光反應(yīng),兩者相互作用共同調(diào)控植物的生長(zhǎng)[36]。生長(zhǎng)素相關(guān)基因響應(yīng)光處理并參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育在模式植物擬南芥中有較多研究,Tian等[37]研究發(fā)現(xiàn)AtARF8基因表達(dá)受多種外源光的影響,如受紅光、遠(yuǎn)紅光、白光及藍(lán)光誘導(dǎo), 從而導(dǎo)致擬南芥arf8突變體子葉伸長(zhǎng),進(jìn)而影響到擬南芥幼苗的正常生長(zhǎng)發(fā)育;Vert等[38]研究發(fā)現(xiàn)在光誘導(dǎo)擬南芥幼苗發(fā)育過程中,AtARF2基因參與生長(zhǎng)素途徑和油菜素內(nèi)酯途徑,且與SK21蛋白存在相互作用;Folta等[39]發(fā)現(xiàn)藍(lán)光誘導(dǎo)IAA1、IAA5和IAA18等基因,其相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組均有顯著變化,表明這些基因參與擬南芥下胚軸生長(zhǎng)的過程;Sun等[40]研究發(fā)現(xiàn),IAA19的轉(zhuǎn)錄水平受到PIF4的調(diào)控,并且IAA19參與生長(zhǎng)素介導(dǎo)的向光性生長(zhǎng)反應(yīng)。此外,劉帥等[31]發(fā)現(xiàn)植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因響應(yīng)紅藍(lán)復(fù)合光,參與葡萄花芽分化過程;Wang等[41]研究發(fā)現(xiàn),與光照相比,OSARF1、OSARF2、OSARF16、OSARF21和OSARF23在黑暗條件下的相對(duì)表達(dá)量增加。

Reed[36]建議未來關(guān)于ARFs蛋白和Aux/IAA蛋白的研究應(yīng)該側(cè)重于其與生長(zhǎng)素以及光信號(hào)的關(guān)系,并具體探究它們之間的相互作用機(jī)制。本試驗(yàn)克隆了設(shè)施紅地球葡萄VvARF7基因,使用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)VvARF7蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明,VvARF7基因編碼1 155個(gè)氨基酸,該蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量為12 958,由蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果可知,其含有β-旋轉(zhuǎn)(8.14%)、延伸鏈(14.63%)、α-螺旋(27.27%)、無規(guī)則卷曲(49.96%)。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明,VvARF7與河岸葡萄VrARF7-like進(jìn)化距離最近,并且VvARF7蛋白定位于細(xì)胞核中,符合轉(zhuǎn)錄因子的特點(diǎn)。啟動(dòng)子分析結(jié)果表明,VvARF7基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有大量光響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯和脫落酸等激素響應(yīng)相關(guān)元件。本研究初步分析了VvARF7基因在設(shè)施栽培紅地球葡萄花芽不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在花芽分化后期,VvARF7相對(duì)表達(dá)量在紅藍(lán)復(fù)合光處理下顯著低于對(duì)照組,說明VvARF7基因可能響應(yīng)紅藍(lán)光參與葡萄花芽分化。本研究結(jié)果顯示,VvARF7基因在葡萄的多種組織中均有不同程度的表達(dá),表明葡萄VvARF7參與多種組織生物學(xué)過程。花芽分化是大量基因參與調(diào)控形成的復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),課題組后期將對(duì)該類基因在花芽分化過程中的調(diào)控機(jī)理進(jìn)行深入研究,并且進(jìn)行轉(zhuǎn)基因功能驗(yàn)證,以期為明確該基因的功能、解析設(shè)施紅地球葡萄花芽分化分子機(jī)制提供理論參考。