趙為民, 戴超輝, 陳 哲, 涂 楓, 李 輝, 付言峰, 李碧俠, 任守文, 程金花

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所,江蘇 南京 210014; 2.江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源保護與利用平臺,江蘇 南京 210014; 3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種養(yǎng)結(jié)合重點實驗室,江蘇 南京 210014)

長鏈非編碼RNA (Long non-coding RNA,LncRNA) 是一類本身不編碼蛋白、轉(zhuǎn)錄本長度超過200 bp的RNA。研究結(jié)果表明LncRNA參與了X染色體失活、胚胎發(fā)育、基因印記、癌癥、免疫等各種細胞生命活動[1-5]。

近年來大量畜禽相關(guān)的LncRNA被鑒定出來,這些LncRNA緊密參與了畜禽肌肉發(fā)育、免疫調(diào)控、繁殖等重要性狀[6-9],注釋和解析這些LncRNA的功能對進一步挖掘調(diào)控畜禽重要經(jīng)濟性狀的功能元件具有深遠意義。然而大多數(shù)LncRNA定位于細胞核,而RNAi的工作系統(tǒng)主要在細胞質(zhì)中發(fā)揮作用,對定位于細胞核的LncRNA作用非常有限[10-12],這限制了LncRNA的功能解析。

CRISPRi系統(tǒng)通過核酸酶活性失活的Cas9(dCas9)和sgRNA的復(fù)合物結(jié)合到某個基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(Transcription start site,TSS)附近,物理性阻礙RNA聚合酶的通過,從而導(dǎo)致基因沉默[13]。通過dCas9融合基因抑制結(jié)構(gòu)域如KRAB(Krüppel-associated box),形成dCas9-KRAB復(fù)合結(jié)構(gòu),可進一步提高轉(zhuǎn)錄抑制的效率[14-16]。Liu等[17]利用CRISPRi系統(tǒng)鑒定了數(shù)百個與細胞生長相關(guān)的LncRNA,Klann等[18]利用CRISPRi系統(tǒng)鑒定了大量與基因表達調(diào)控相關(guān)的功能元件。CRISPRi系統(tǒng)在抑制基因表達上也呈現(xiàn)出較強的特異性[19-20],是研究LncRNA功能的新一代工具。

LncRNA-NEAT1是在研究肌細胞分化時發(fā)現(xiàn)的一個長鏈非編碼 RNA[21],其作為核心組分主要參與細胞亞結(jié)構(gòu)旁斑(Paraspeckle)的形成,在細胞分化,癌癥發(fā)生和病毒感染等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要作用[21-23]。本課題組前期研究結(jié)果表明豬LncRNA-NEAT1基因在脂蛋白刺激下表達顯著上調(diào),表明其在Toll樣受體2(Toll Like Receptor 2,TLR2)介導(dǎo)的先天性免疫反應(yīng)中可能起到調(diào)控作用[24]。本研究利用CRISPR/dCas9-KRAB系統(tǒng)來抑制LncRNA-NEAT1基因的表達,為后續(xù)進一步研究其在先天性免疫反應(yīng)中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 細胞、菌株與質(zhì)粒

Trans5a感受態(tài)菌株購于北京擎科生物科技有限公司,Lenti-dCas9-KRAB-blast載體由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)趙長志惠贈,豬PK15細胞、px330載體由本實驗室保存。

1.2 試劑

RNA提取試劑盒購于南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司;DNA提取試劑盒、DNA marker購于北京擎科生物科技有限公司;內(nèi)切酶BbsI、T7E1酶購于NEB公司;PCR酶、T載體、末端轉(zhuǎn)移酶TdT、T4連接酶、qPCR試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于寶生物工程(大連)有限公司;無內(nèi)霉毒素質(zhì)粒試劑盒購于天根生化科技(北京)有限公司;Blasticidin S HCl (滅瘟素S)購于南京碧云天生物技術(shù)有限公司;DNA純化回收試劑盒購于Zymo ResearchZymo research_安諾倫(北京)生物科技有限公司公司;DMEM培養(yǎng)基、青鏈霉素購于武漢博士德生物工程有限公司;胎牛血清購于Biological Industries (BI)公司;opti-MEM和LipofectamineTM3000 Transfection Reagent購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 豬LncRNA-NEAT1基因的亞細胞表達分布

待細胞密度長至80%左右,胰酶消化細胞,用預(yù)冷PBS清洗兩遍后加入Buffer A(10 mmol/L tris-cl,10 mmol/L NaCl,0.5% IGEPAL? CA-630),冰上放置5 min,離心后上清液用于細胞質(zhì)RNA的提取。用Buffer A洗滌沉淀2次,沉淀用于細胞核RNA的提取。

1.4 豬LncRNA-NEAT1基因的5′末端快速擴增(5′RACE)

基于前期測序獲得部分序列結(jié)果[24],LncRNA-NEAT1基因的5′末端快速擴增過程如下:利用oligodT反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈,然后再利用TdT酶進行5′末端dC-tailing,回收純化后,用引物5P(5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACGCGGGGGGGGGG-3′)和5′末端的特異性引物5′GSP(5′-CTGCCTCCCTCCTTCAGACAAAG-3′)擴增其5′末端。 PCR擴增條件:95 ℃ 5 min,95 ℃ 30 s,65 ℃(-0.5 ℃)45 s,72 ℃ 1 min,15個循環(huán);95 ℃ 1 min,60 ℃ 45 s,72 ℃ 1 min,20個循環(huán);72 ℃ 3 min。擴增的PCR產(chǎn)物經(jīng)過DNA純化回收后與T載體連接,然后轉(zhuǎn)化Trans5a感受態(tài)細胞,后續(xù)進行測序驗證。

1.5 LncRNA-NEAT1基因啟動子區(qū)域的sgRNA設(shè)計

針對LncRNA-NEAT1基因啟動子區(qū)(-300～0 bp)利用CRISPOR(http://crispor.tefor.net/)在線設(shè)計2對sgRNA。設(shè)計原則為選取cfdSpecScore>80,Doench′16-Score>50的sgRNA。

1.6 px330-sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建

依據(jù)sgRNA的序列合成反向互補的單鏈寡核苷酸sgF和sgR,并在sgF的5′端添加CACCG,在sgR的5′端添加AAAC。95 ℃變性5 min,室溫冷卻,使sgF和sgR退火互補。BbsⅠ 酶切px330載體,回收純化后與退火的寡核苷酸連接,轉(zhuǎn)化Trans5a感受態(tài)細胞,后續(xù)進行測序驗證與無內(nèi)霉毒素質(zhì)粒提取。

1.7 px330- sgRNA-dCas9-KRAB載體構(gòu)建

通過酶切px330載體,將Cas9序列替換為多克隆位點,然后再將dCas9-KRAB-BSD插入到該多克隆位點。具體方法如下:首先以px330載體為模板,通過引物F:5′-TTGTACCGGTCGTACGGCTAGCCTCGAGAAGCTTGAATTCCTAGAGCTCGCTGA-3′和R:5′-GATGCGGCCGCTCCCCAGCAT-3′進行PCR擴增。 PCR產(chǎn)物包含引入了多個酶切位點(引物F下劃線部分)的bGH poly(A)片段。然后對PCR產(chǎn)物和px330載體分別進行AgeⅠ和NotⅠ雙酶切并進行連接,轉(zhuǎn)化Trans5a感受態(tài)細胞,后續(xù)進行測序驗證與質(zhì)粒提取。此重組后的載體為px330-MCS。將篩選好的sgRNA先構(gòu)建到px330-MCS,為px330-sgRNA-MCS。然后對px330-sgRNA-MCS和Lenti-dCas9-KRAB-blast進行BsiWⅠ和EcoRⅠ雙酶切,將Lenti-dCas9-KRAB-blast載體中的dCas9-KRAB-BSD連接到px330-sgRNA-MCS中,形成重組載體px330-sgRNA-dCas9-KRAB。

1.8 Blasticidin S篩選質(zhì)量濃度摸索

豬PK15細胞鋪板12孔板,24 h后待細胞密度達到80%左右,分別添加0 μg/ml、1 μg/ml、3 μg/ml、4 μg/ml的Blasticidin S,每個質(zhì)量濃度處理3次重復(fù),每2 d換1次,在第7 d時觀察細胞的死亡情況,使細胞致死的最小劑量為后續(xù)的藥篩質(zhì)量濃度。

1.9 LncRNA-NEAT1基因的沉默

豬PK15細胞在轉(zhuǎn)染前1 d鋪12孔板,轉(zhuǎn)染時密度大約70%。對照組轉(zhuǎn)染px330-dCas9-KRAB,實驗組分別轉(zhuǎn)染px330-sgRNA1-dCas9-KRAB和px330-sgRNA2-dCas9-KRAB質(zhì)粒,48 h后,利用Blasticidin S篩選細胞7 d后進行LncRNA-NEAT1基因的表達檢測。

1.10 定量PCR

1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,使用QuantStudio 5進行qPCR擴增。對照組與試驗組各3個生物學(xué)重復(fù),每個樣品重復(fù)3次。采用三步法擴增,程序簡要如下:預(yù)變性95 ℃ 2 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40個循環(huán)。數(shù)據(jù)均以平均值±標準差表示。使用單因素方差分析各組之間的差異顯著性。引物序列見表1。

表1 引物序列信息

2 結(jié)果與分析

2.1 豬LncRNA-NEAT1表達的亞細胞定位

利用低滲溶液將細胞總RNA分為細胞質(zhì)和細胞核RNA,RT-PCR結(jié)果顯示LncRNA-NEAT1表達于細胞核,在細胞質(zhì)中幾乎不表達(圖1)。HPRT作為細胞內(nèi)參基因,其在細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄后會向細胞質(zhì)中運輸,其mRNA在細胞質(zhì)中的表達量多于細胞核。圖1結(jié)果顯示HPRT在細胞質(zhì)的表達量高于細胞核,符合其表達定位。

圖1 LncRNA-NEAT1在細胞質(zhì)與細胞核中的表達Fig.1 Expression of LncRNA-NEAT1 in cytoplasm and nucleus

2.2 豬LncRNA-NEAT1轉(zhuǎn)錄起始位點

為了確定LncRNA-NEAT1的轉(zhuǎn)錄起始位點,通過5′RACE對其5′端序列進行了克隆,圖2結(jié)果顯示得到大約270 bp的條帶,與預(yù)期相符。

圖2 LncRNA-NEAT1的5′RACE擴增結(jié)果Fig.2 5′RACE amplification of LncRNA-NEAT1

2.3 豬LncRNA-NEAT1啟動子區(qū)的sgRNA設(shè)計與效率驗證

通過CRISPOR在線設(shè)計程序,對LncRNA-NEAT1啟動子區(qū)(-300～0 bp)設(shè)計了2對sgRNA,分別為sgRNA1:5′-CCGAGGCGTCTCCTCAGACA-3′,PAM為GGG,位置約-200 bp,Doench 16-Score參數(shù)為63;sgRNA2:5′-GAGCAATGCCCCGGGTGACG-3′,PAM為CGG,位置約-150 bp,Doench 16-Score參數(shù)為63。

2.4 px330-sgRNA-dCas9-KRAB載體的酶切驗證

圖3顯示構(gòu)建的px330-sgRNA-dCas9-KRAB經(jīng)過BsiWⅠ和EcoRⅠ雙酶切后,得到約4 200 bp的px330骨架和5 000 bp的dCas9-KRAB-BSD片段,與預(yù)期相符。

M:DNA相對分子質(zhì)量標準樣品;1:px330-sgRNA1-dCas9-KRAB載體BsiWⅠ和Eco RⅠ雙酶切;2:px330-sgRNA2-dCas9-KRAB載體BsiWⅠ和Eco RⅠ雙酶切。圖3 px330-sgRNA-dCas9-KRAB質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.3 Identification of px330-sgRNA-dCas9-KRAB plasmid by enzyme digestion

2.5 Blasticidin S篩選質(zhì)量濃度的確定

圖4結(jié)果顯示,在加Blasticidin S培養(yǎng)7 d后,1 μg/ml質(zhì)量濃度Blasticidin S處理的細胞只有部分細胞死亡(圖4B),而3 μg/ml與4 μg/ml質(zhì)量濃度Blasticidin S處理的的細胞幾乎全部死亡(圖4C、圖4D),因此在后續(xù)的篩選中,Blasticidin S篩選質(zhì)量濃度為3 μg/ml。圖4A為陰性對照組,細胞生長正常。

A:陰性對照組;B:1 μg/ml的Blasticidin S;C:3 μg/ml 的Blasticidin S;D:4 μg/ml 的Blasticidin S。圖4 不同質(zhì)量濃度Blasticidin S對細胞的致死效果Fig.4 The killing effect of different concentrations of Blasticidin S on cells

2.6 CRISPR/ dCas9-KRAB系統(tǒng)沉默豬LncRNA-NEAT1的表達

細胞轉(zhuǎn)染px330-sgRNA-dCas9-KRAB(試驗組)與px330-dCas9-KRAB(對照組)36 h后,添加Blasticidin S篩選細胞7 d,對LncRNA-NEAT1基因的表達進行qPCR檢測。結(jié)果(圖5)顯示,與對照組相比,sgRNA1和sgRNA2分別使LncRNA-NEAT1表達下降了73%和55%,達到顯著水平(P<0.05)。

*表示與對照組相比差異顯著(P<0.05)。圖5 sgRNA1和sgRNA2對LncRNA-NEAT1基因的沉默效果Fig.5 Silencing effect of sgRNA1 and sgRNA2 on LncRNA-NEAT1 gene

2.7 豬LncRNA-NEAT1啟動子區(qū)的切割驗證

為了進一步驗證CRISPR/ dCas9-KRAB系統(tǒng)中的sgRNA是否會切割其結(jié)合位點,利用Sanger測序?qū)gRNA1和sgRNA2的結(jié)合位點進行分析。結(jié)果(圖6)顯示試驗組中sgRNA1和sgRNA2的結(jié)合位點和對照組一致,其序列沒有發(fā)生堿基缺失或者插入。

圖6 豬LncRNA-NEAT1啟動子區(qū)sgRNA結(jié)合位點的Sanger測序峰圖Fig.6 Sanger sequencing peak map of sgRNA binding sites in the promoter region of pig LncRNA-NEAT1

3 討 論

近年來隨著重測序以及功能基因組學(xué)的發(fā)展,豬相關(guān)的LncRNA與增強子等被大量鑒定出來[6,25]。CRISPRi與RNAi和CRISPR/dCas9敲除相比,在研究細胞核內(nèi)相關(guān)的LncRNA或表達增強子(Enhancer-derived RNAs,eRNAs)上有著較大優(yōu)勢[12,15],并且也可以進行高通量的篩選研究,為解析豬功能基因組以及挖掘重要調(diào)控元件奠定基礎(chǔ)。

LncRNA-NEAT1在最初發(fā)現(xiàn)時定位于小鼠肌細胞核內(nèi),作為核心組分主要參與細胞亞結(jié)構(gòu)旁斑(Paraspeckle)的形成[21]。本試驗發(fā)現(xiàn)豬LncRNA-NEAT1幾乎只表達于細胞核,表明LncRNA-NEAT1的表達定位在物種間相對保守。由于Lenti-dCas9-KRAB-blast載體較大(約14 kb),如果再聯(lián)合轉(zhuǎn)染sgRNA表達載體,會導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低,從而會影響基因沉默效果。本研究通過酶切與亞克隆構(gòu)建了px330-sgRNA-dCas9-KRAB這種“All-in-one”載體,將sgRNA和dCas9-KRAB表達元件都整合到一個載體,大幅度縮減了載體,提高了表達效率[26-27],從而進一步提升沉默效果。

位于TSS不同位置的sgRNA對CRISPR/ dCas9-KRAB的沉默效果具有決定性作用[15,28]。因此本研究首先利用5′RACE確定了LncRNA-NEAT1的TSS。由于大多數(shù)編碼LncRNA基因,其表達水平相對于編碼蛋白基因較低[29-31], 確定這些重要而表達水平較低的LncRNA的TSS并不容易,這也是利用CRISPR/dCas9-KRAB系統(tǒng)沉默LncRNA一個限制因素。

TSS附近啟動子區(qū)對基因表達水平有重要影響,其區(qū)域內(nèi)堿基的刪除或插入會影響其基因的表達[32-34]。盡管dCas9呈現(xiàn)失活的狀態(tài),并不會切割sgRNA的結(jié)合位點[13],為了進一步驗證LncRNA-NEAT1的表達下調(diào)不是由于sgRNA切割TSS附近啟動子區(qū)造成的,本研究利用Sanger測序?qū)υ囼灲MsgRNA的結(jié)合位點進行序列分析,結(jié)果顯示其結(jié)合位點并沒有發(fā)生刪除或者插入,表明LncRNA-NEAT1的表達下調(diào)是通過CRISPR/dCas9-KRAB系統(tǒng)來實現(xiàn)。

本研究獲得了LncRNA-NEAT1基因的TSS位點,在其附近啟動子區(qū)設(shè)計并驗證了2對有效sgRNA,通過構(gòu)建“All-in-one”載體,利用CRISPR/dCas9-KRAB系統(tǒng)有效沉默了豬LncRNA-NEAT1基因的表達。